朱志楊，沈 輝，萬夕和，任 乾，蔣 葛，范賢平，喬 毅，甄曉然,3

(1.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)又稱河蟹，是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟品種。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，河蟹發(fā)生的病害問題日漸凸顯，其中顫抖病、腹水病和細菌性爛鰓病等疾病對河蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。2015年，一種新型病癥-肝胰腺壞死綜合征(hepatopancreatic necrosis syndrome，HPNS)被首次報道[1]，該病發(fā)病區(qū)域由江蘇北部逐漸蔓延至江蘇南部、安徽、湖北等地[2]，一般發(fā)生在成蟹的第2、3、4次蛻殼期，病蟹肝胰腺呈灰白色[3]，發(fā)病劇烈時肝胰腺壞死并伴有大量死亡，據(jù)不完全估計已造成經(jīng)濟損失數(shù)億元[4]，因此受到河蟹養(yǎng)殖業(yè)和學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。

目前，關(guān)于HPNS病因的研究報道主要集中在環(huán)境脅迫[1]、種質(zhì)退化[5]、病毒感染及微孢子蟲感染等方面[4，6]。宋學(xué)宏[7]和朱健明等[8]研究認為水體中高pH脅迫和低氧脅迫引發(fā)河蟹肝胰腺白化，繼而在細菌的繼發(fā)感染下惡化形成HPNS；楊宗英等[1，9]研究并驗證了水質(zhì)毒害因子脅迫引發(fā)河蟹HPNS早期的肝胰腺白化；楊先樂[10]研究認為苗種質(zhì)量下降是引發(fā)HPNS的根本原因；崔龍波等[6]研究認為病毒、微孢子蟲以及細菌等多種病原微生物引發(fā)HPNS；Ding等[4]研究發(fā)現(xiàn)微孢子蟲可引發(fā)HPNS早期等肝胰腺白化現(xiàn)象。然而引起HPNS的病因尚未明確，已有研究發(fā)現(xiàn)，白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal & haematopoietic necrosis virus，IHHNV)的感染可改變甲殼動物肝胰腺、消化道等器官的微生物群落結(jié)構(gòu)，影響其生理功能，并對組織和細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，甚至引發(fā)河蟹肝胰腺白化[11-14]。與HPNS在發(fā)病初期出現(xiàn)不同程度的肝胰腺白化現(xiàn)象較為一致[1]。

本研究的前期工作中，對不同規(guī)格的河蟹進行了病原篩查，發(fā)現(xiàn)樣品中檢出較高比例的河蟹個體攜帶WSSV、IHHNV或同時攜帶IHHNV-WSSV，部分個體還具有HPNS癥狀(尚未發(fā)表)。在本研究中，利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對健康蟹、肝胰腺壞死綜合征病蟹、WSSV感染蟹、IHHNV感染蟹以及IHHNV-WSSV共感染蟹的肝胰腺菌群結(jié)構(gòu)進行研究，探索其肝胰腺菌群相似性，以期初步探究河蟹肝胰腺菌群結(jié)構(gòu)與河蟹HPNS的關(guān)系，病原感染與HPNS的關(guān)聯(lián)，從而揭示病原感染、肝胰腺菌群結(jié)構(gòu)變化以及HPNS之間的相互關(guān)系，為今后河蟹HPNS的進一步研究、診斷和防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

河蟹樣品于2017年7月采自江蘇省泰州市興化某養(yǎng)殖場，其中健康蟹7只，WSSV感染蟹7只、IHHNV感染蟹5只，IHHNV-WSSV共感染蟹9只，肝胰腺壞死綜合征病蟹2只，樣品基本情況詳見表1。所有樣品均采于同一養(yǎng)殖池塘。樣品低溫冷藏，快速運至實驗室后，對肝胰腺進行無菌取樣，根據(jù)體表觀察和解剖學(xué)觀察結(jié)果判定健康狀況，其中“Healthy”表示健康蟹，“W”表示W(wǎng)SSV感染蟹；“I”表示IHHNV感染蟹；“DWI”表示IHHNV-WSSV共感染蟹 ；“HPNS”表示肝胰腺壞死綜合征病蟹。

表1 樣品基本情況表Tab.1 Basic information of sample crabs

1.2 方法

1.2.1 病原篩查

1.2.1.1 DNA提取

取100 mg肝胰腺組織樣品充分研磨后，按照上海博彩生物科技有限公司3S DNA Isolation Kit V2.2試劑盒的操作步驟提取基因組DNA，-20 ℃保存。Healthy組、W組、I組、DWI組中各隨機選取3份DNA，與HPNS組的2份DNA，進行后續(xù)的PCR-DGGE基因指紋圖譜構(gòu)建與分析。

1.2.1.2 病原PCR檢測

以DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，對WSSV、IHHNV和中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasmaeriocheiris)等常規(guī)病原進行篩查，參考檢測方法、引物及擴增條件詳見表2。

表2 病原檢測的引物序列Tab.2 Primers used in the pathogen detection

1.2.2 16S rDNA的PCR-DGGE基因指紋圖譜構(gòu)建與分析

1.2.2.1 16S rDNA片段的PCR擴增

根據(jù)病原檢測結(jié)果，以隨機挑取的Healthy組、W組、I組、DWI組中的各3份DNA和HPNS組的2份DNA為模板，PCR擴增16S rDNA片段，參考方法、引物及擴增條件詳見表2。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓160 V，電泳時間45 min。

1.2.2.2 16S rDNA V3區(qū)片段的PCR擴增

以16S rDNA片段的PCR產(chǎn)物為模板，PCR擴增16S rDNA V3區(qū)片段，參考方法、引物及擴增條件詳見表3。

表3 16S rDNA V3區(qū)基因擴增的引物序列Tab.3 Primers used in the PCR of 16S rDNA V3 area

1.2.2.3 DGGE成像與分析

16S rDNA V3區(qū)的PCR產(chǎn)物經(jīng)Bio.Rad電泳儀分析，DGGE的聚丙烯酰胺膠濃度為8%(w/v)，變性梯度為40%～60%，DGGE電泳程序按文獻進行[22]。電泳結(jié)束后凝膠以SYBR? Gold Nucleic Acid Gel Stain染色，DGGE圖譜采用Quantity One軟件分析指紋圖譜，以非加權(quán)組算術(shù)平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPMEGA)進行相似性聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。多樣性分析采用Shannon-Wiener指數(shù)H’，計算方法為：

H’=-∑(ni/N)lg(ni/N)

式中ni是第i條帶的光密度值，N是一個泳道所有條帶的光密度之和。在對所有條帶進行高斯建模的基礎(chǔ)上，以條帶光密度曲線下面積值作為物種的相對豐度。

1.2.2.4 DGGE條帶的序列分析

將DGGE凝膠進行DNA回收，于100 μL TE緩沖液中過夜保存；以上清液作為DNA模板進行PCR擴增，擴增引物及擴增條件詳見表3。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，每份樣品挑3份陽性克隆送至上海生工公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI上進行比對，以其中同源性最高的序列確定為參照菌株，相似性≥97%的序列視為同一序列型。數(shù)據(jù)的處理和主成份分析采用Excel和SPSS軟件，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同患病河蟹的癥狀

不同組蟹的健康狀況以及病原檢測結(jié)果如表4和圖1所示， Healthy組蟹、W組蟹以及I組蟹的體質(zhì)狀況、攝食情況以及肝胰腺外觀均正常，但病原檢測結(jié)果存在差異，Healthy組蟹未感染病原，W組和I組蟹分別出現(xiàn)WSSV感染、IHHNV感染；DWI組蟹雖未出現(xiàn)肝胰腺病變，但活力稍弱，病原檢測顯示IHHNV-WSSV共感染；HPNS組蟹的體質(zhì)狀況減弱，停止攝食，解剖學(xué)觀察顯示肝胰腺白化，病原檢測顯示IHHNV-WSSV共感染。

表4 不同樣品蟹的健康狀況及病原測試結(jié)果Tab.4 Health status and pathogenic test results of different sample crabs

注：“-”表示未感染病原，“W+”表示感染W(wǎng)SSV病原，“I+”表示感染IHHNV病原。

圖1 不同組樣品蟹對比圖Fig.1 Comparison of different sample crabsa：Healthy組；b：W組；c：I組；d：DWI組；e：HPNS組

2.2 PCR-DGGE指紋圖譜與肝胰腺菌群差異

不同實驗組的肝胰腺菌群指紋圖譜如圖2所示，處于不同位置的條帶數(shù)為28條，各實驗組的DGGE條帶在數(shù)量、位置和條帶亮度上存在差異，I組條帶數(shù)最多(平均14條)，Healthy組次之(平均13條)，W組和DWI組再次之(平均11條)，HPNS組最少(平均8條)。各實驗組間的條帶數(shù)量表現(xiàn)出除I組以外，W組、DWI組、HPNS組與Healthy組相比，肝胰腺菌群中條帶數(shù)量出現(xiàn)不同程度的降低。

各實驗組Shannon-Wiener指數(shù)計算結(jié)果顯示，Healthy組的肝胰腺菌群多樣性最高(為2.521 5)，HPNS組最低(為1.96)。W組(多樣性指數(shù)為2.304 5)、I組(多樣性指數(shù)為2.266 6)、DWI組(多樣性指數(shù)為2.310 4)以及HPNS組與Healthy組相比，均出現(xiàn)肝胰腺菌群多樣性指數(shù)降低。

圖2 實驗組河蟹肝胰腺的DGGE指紋圖譜Fig.2 Bacterial DGGE profile of hepatopancreas from experimental crabs

UPMEGA相似性聚類結(jié)果如圖3所示。一支HPNS個體的肝胰腺菌群與一支DWI個體最先聚類(相似度0.83)，再與HPNS另一個體聚類(相似度0.74)，隨后依次與DWI組(相似度0.72)、I組(相似度0.69)、W組(相似度0.62)聚類，最后與Healthy組聚類(相似度0.56)。

圖3 實驗組河蟹肝胰腺菌群的UPMEGA相似性聚類分析Fig.3 UPMEGA cluster analysis of hepatopancreas microflora from experimental crabs

2.3 DGGE圖譜差異條帶測序結(jié)果分析

DNA條帶的測序結(jié)果顯示，28條DNA膠回收條帶屬于4個門21個菌屬，具體測序結(jié)果見表5。各實驗組在門水平上的肝胰腺菌群組成及其相對豐度如圖4所示。河蟹肝胰腺菌群主要分為四類，擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。5個實驗組間在門水平上，菌群的相對豐度變化總體未顯示出差異性，與Healthy組相比，僅見Ⅰ組中變形菌門的相對豐度顯著增加；HPNS組中厚壁菌門的相對豐度顯著減少。

各實驗組在屬水平上的肝胰腺菌群組成及其相對豐度如圖5所示。除各實驗組均以沉積小桿菌屬(Sediminibacterium)為首要優(yōu)勢菌屬外，Healthy組中的其它優(yōu)勢菌屬依次為氣單胞菌屬、顆粒鏈球菌屬(Granulicatella)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)；W組中的其它優(yōu)勢菌屬依次為慢生根瘤菌屬、氣單胞菌屬、紅球菌屬(Rhodococcus)；I組中的其它優(yōu)勢菌屬依次為慢生根瘤菌屬、氣單胞菌屬、顆粒鏈球菌屬；DWI組中的其它優(yōu)勢菌屬依次為氣單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、紅球菌屬；HPNS組中的其它優(yōu)勢菌屬依次為氣單胞菌屬、紅球菌屬、希瓦氏菌屬(Shewanella)。

部分菌屬的相對豐度變化顯示(詳見圖5)，慢生根瘤菌屬僅在HPNS組中未出現(xiàn)；鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)的相對豐度依次在Healthy組、W組、I組、DWI組、HPNS組中逐漸降低甚至消失(P>0.05)；氣單胞菌屬在各實驗組中均存在，依次在Healthy組、W組、I組、DWI組、HPNS組中呈上升趨勢(P>0.05)；假單胞菌屬的相對豐度依次在Healthy組、W組、DWI組、I組中呈上升趨勢(P>0.05)；希瓦氏菌屬僅出現(xiàn)在HPNS組和DWI組中。

表5 DGGE代表條帶序列比對結(jié)果Tab.5 Result of sequence aligement of band in DGGE

圖4 不同實驗組在門水平上的相對豐度Fig.4 Comparision of relative abundance at the bacteria phylum levels among different experimental groups

圖5 不同實驗組在屬水平上的相對豐度Fig.5 Comparision of relative abundance at the bacteria genus levels among different experimental groups

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，HPNS組肝胰腺菌群的一支與DWI組中的一支最先聚類(相似度0.83)，繼而HPNS組與DWI組聚類(相似度0.72)，與Healthy組的肝胰腺菌群結(jié)構(gòu)相似度最低(相似度0.56)，表明HPNS病蟹的肝胰腺菌群結(jié)構(gòu)與IHHNV-WSSV共感染蟹的肝胰腺菌群結(jié)構(gòu)較為一致，而與Healthy蟹之間的肝胰腺菌群結(jié)構(gòu)存在差異。因此，從微生物菌群結(jié)構(gòu)相似性及菌群結(jié)構(gòu)的變化結(jié)果來看，DWI組隨著時間的推移，可能會發(fā)展成為HPNS組，河蟹HPNS與WSSV-IHHNV共感染可能存在一定的關(guān)聯(lián)。

近年來，河蟹感染W(wǎng)SSV并出現(xiàn)批量死亡的報道日漸增多[6，23，24]。孫婷等[12]發(fā)現(xiàn)WSSV感染可引發(fā)河蟹肝胰腺白化，與河蟹HPNS在發(fā)病初期出現(xiàn)的肝胰腺白化現(xiàn)象較為一致[1]，且相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)，在HPNS病蟹體內(nèi)檢出較高含量的WSSV[25]。本研究發(fā)現(xiàn)HPNS組的河蟹出現(xiàn)肝胰腺白化，并攜帶WSSV，與上述的研究結(jié)果較為一致，表明WSSV與HPNS的發(fā)生可能存在一定關(guān)聯(lián)。IHHNV的報道主要集中在對蝦的生理代謝和生長方面[14]，當(dāng)IHHNV-WSSV共感染時會加劇對蝦肝胰腺和肌肉組織的損傷[26]。目前，已有美青蟹(Callinectesarcuatus)、絨螯近方蟹(Hemigrapsuspenicillatus)、顆粒新厚蟹(Neohelicegranulate)感染攜帶IHHNV的報道，但未見明顯病理性變化[27，28]。IHHNV大規(guī)模感染河蟹的研究尚未見報道，但在本研究前期流行病學(xué)調(diào)查中，IHHNV在不同規(guī)格河蟹中均具有一定的陽性檢出率。蝦蟹混養(yǎng)模式下的克氏原鰲蝦(Procambarusclarkii)中IHHNV感染率很高[29]，河蟹感染IHHNV有可能來自于宿主克氏原鰲蝦。由此初步推論，IHHNV-WSSV共感染與河蟹HPNS也許具有一定的相關(guān)性，其相關(guān)模擬實驗還需進一步開展和佐證。

目前，關(guān)于河蟹體內(nèi)菌群的研究主要集中在腸道菌群上，研究發(fā)現(xiàn)河蟹腸道中優(yōu)勢菌群為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和疣微菌門(Verrucomicrobia)[30，31]。而針對河蟹肝胰腺菌群的研究較少，Shen等[3]對健康蟹及肝胰腺壞死綜合征病蟹的肝胰腺微生物菌群進行研究發(fā)現(xiàn)，健康河蟹肝胰腺的優(yōu)勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門；在HPNS發(fā)病過程中，病蟹肝胰腺菌群多樣性降低，優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其中柔膜菌門(Tenericutes)和放線菌門的比例明顯增加，擬桿菌門細菌的數(shù)量急劇減少，導(dǎo)致病蟹肝胰腺中脂肪和纖維素代謝異常，營養(yǎng)物質(zhì)吸收受到抑制。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，與Healthy組相比，HPNS組肝胰腺菌群多樣性降低，放線菌門的比例顯著增加。表明病蟹肝胰腺菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的改變，繼而影響其免疫、消化功能[32]。此外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，HPNS組、W組、I組、DWI組與Healthy組相比，氣單胞菌屬、假單胞菌屬等致病菌屬的相對豐度增加，而鞘氨醇單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬等有益菌屬的相對豐度下降甚至消失，本研究結(jié)果不僅進一步從屬水平反映出HPNS病蟹的肝胰腺菌群發(fā)生變化，其正常生理功能下降，而且表明了病原感染可能與肝胰腺菌群中致病菌和有益菌豐度的變化存在一定的關(guān)聯(lián)。在相對豐度發(fā)生變化的致病菌屬中，氣單胞菌和假單胞菌產(chǎn)生的毒力因子可破壞宿主的凝血系統(tǒng)和免疫防御系統(tǒng)，造成廣泛的組織損傷[33-35]。Ding等[13]研究發(fā)現(xiàn)河蟹腸道菌群中氣單胞菌和假單胞菌的豐度在WSSV感染下顯著增加，崔龍波等[6]也研究發(fā)現(xiàn)HPNS病蟹肝胰腺中存在著病毒感染所特有的嗜酸性包涵體和大量以氣單胞菌為主的細菌。本研究結(jié)果與Ding等[13]和崔龍波等[6]的研究結(jié)果較為一致，表明病原感染可能引發(fā)肝胰腺中致病菌的增殖，繼而對肝胰腺產(chǎn)生損傷。在相對豐度發(fā)生變化的有益菌屬中，鞘氨醇單胞菌屬和鞘氨醇桿菌屬多數(shù)含有類胡蘿卜素類物質(zhì)[36-39]，具有較強的代謝能力和對貧營養(yǎng)環(huán)境的耐受力[40]。楊宗英等[1]研究發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素的大量消耗可能引發(fā)河蟹肝胰腺白化。因此，本研究結(jié)果初步表明病原感染可引發(fā)河蟹肝胰腺菌群中鞘氨醇單胞菌屬和鞘氨醇桿菌屬的減少，可能引發(fā)宿主肝胰腺中類胡蘿卜素含量降低，導(dǎo)致宿主的代謝能力和對貧營養(yǎng)環(huán)境的耐受力減弱，進而引發(fā)肝胰腺白化。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，僅HPNS組未出現(xiàn)慢生根瘤菌，慢生根瘤菌主要來源于豆科植物[41]，豆科植物是河蟹飼料的重要原料[42]，慢生根瘤菌可能作為餌料形式短時間存在于河蟹體內(nèi)。在HPNS組中未發(fā)現(xiàn)慢生根瘤菌，表明HPNS組蟹已經(jīng)長時間未攝食，繼而檢測不到慢生根瘤菌，但在其余4組中，慢生根瘤菌為優(yōu)勢菌，表明其余4組仍處于正常攝食狀態(tài)，這在本研究前期流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)的HPNS組蟹停止攝食活動中得到證實。病蟹由于長期未攝食而處于饑餓狀態(tài)。有研究者在實驗室條件下，對河蟹進行饑餓實驗，實驗進行90 d后，河蟹肝胰腺指數(shù)明顯降低[43]。結(jié)合本研究結(jié)果，可初步推測在養(yǎng)殖條件下，由于IHHNV-WSSV共感染，導(dǎo)致肝胰腺正常的生理功能下降，繼而停止了攝食行為，從而逐漸發(fā)展形成HPNS。

本文結(jié)合肝胰腺菌群多樣性和聚類分析、病蟹生理學(xué)特征、IHHNV-WSSV共感染引發(fā)的河蟹肝胰腺菌群在屬水平上的變化以及菌屬變化可能產(chǎn)生的病理學(xué)影響，初步推論HPNS的發(fā)生可能與IHHNV-WSSV共感染存在一定的關(guān)聯(lián)， IHHNV-WSSV共感染可能引發(fā)肝胰腺正常的生理功能下降，繼而停止了攝食行為，從而逐漸發(fā)展形成HPNS初期的肝胰腺白化現(xiàn)象。