楊長庚，蘇富強(qiáng)，文 華，劉 偉，魏開金

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223；2.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，屬十足目爬行亞目蜊蛄科螯蝦亞科原螯蝦屬，原產(chǎn)中、南美洲和墨西哥東北部地區(qū)[1]。由于其肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富，且近年來“小龍蝦(克氏原螯蝦)經(jīng)濟(jì)”在全國逐漸興起，集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖也隨之不斷發(fā)展，目前已成為我國一個(gè)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)品種。然而，對(duì)于克氏原螯蝦營養(yǎng)學(xué)的研究起步較晚，相關(guān)報(bào)道較少。

蛋白質(zhì)作為重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，其對(duì)動(dòng)物體的生長及代謝起重要作用。尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，蛋白質(zhì)是決定水產(chǎn)動(dòng)物生長快慢的關(guān)鍵因素[2]，水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料蛋白質(zhì)水平要求較高，一般為畜禽的2～4倍，通常占配方的25%～50%，甚至更多。所以，蛋白質(zhì)需求一直是水產(chǎn)飼料營養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。魚粉營養(yǎng)全面，適口性好，抗?fàn)I養(yǎng)因子少，易于消化，一直以來是水產(chǎn)飼料中不可或缺的優(yōu)質(zhì)蛋白源。但是，隨著集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，魚粉的需求量急劇上升，其價(jià)格一直居高不下。因此，人們對(duì)其他多種蛋白源在水產(chǎn)飼料中的開發(fā)及應(yīng)用進(jìn)行了一系列研究。例如，Elharoun等[3]對(duì)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究表明，噴霧干燥后的雞血粉和急驟干燥后的牛血粉對(duì)虹鱒的增重率和飼料效率等有較好的效果。Guillaume等[4]研究結(jié)果表明大豆?jié)饪s蛋白替代75%的魚粉對(duì)軍曹魚(Rachycentroncanadum)幼魚的生長無不良影響。然而，不同蛋白源生物特性、營養(yǎng)價(jià)值、養(yǎng)殖效果、價(jià)格等差異巨大，造成不同配方飼料的經(jīng)濟(jì)性，實(shí)際效益差異也很大。因此，尋找既具高營養(yǎng)價(jià)值又經(jīng)濟(jì)的蛋白源成為配合飼料研究中的必要環(huán)節(jié)。

目前，對(duì)于克氏原螯蝦的蛋白質(zhì)需求已有一些研究報(bào)道，研究表明克氏螯蝦餌料蛋白質(zhì)含量為27%～33%較適合[5-7]?？耸显r作為雜食動(dòng)物，許多種蛋白源均在其飼料配方中有一定的應(yīng)用[8-9]。然而，對(duì)于不同種類蛋白源對(duì)克氏原螯蝦生長性能、營養(yǎng)生理等的影響未見報(bào)道。此外，蝦、蟹等甲殼動(dòng)物必須進(jìn)行周期型蛻皮才能成長，蛻皮是其生長和發(fā)育的標(biāo)志特征，它貫穿甲殼動(dòng)物個(gè)體發(fā)育的始終[10]。因此如何使小龍蝦快速沉積蛋白質(zhì)是解決肌肉不飽滿的關(guān)鍵。大量的研究表明配合飼料中蛋白來源是影響水產(chǎn)動(dòng)物蛋白質(zhì)沉積的一個(gè)重要因素[11-12]。受到自然環(huán)境的限制小龍蝦的食性以植食性為主[13-14]，但對(duì)動(dòng)物性原料的消化亦較高[15]。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬從克氏原螯蝦攝食、生長、體組成、脫殼率、成活率以及生長軸基因表達(dá)變化等方面，分析不同蛋白源(肉骨粉、菜籽粕、發(fā)酵豆粕、雞肉粉)對(duì)克氏原螯蝦營養(yǎng)生理的影響。以期減少高價(jià)動(dòng)物蛋白源的用量，降低配方成本，為克氏原螯蝦飼料科學(xué)經(jīng)濟(jì)的配制提供理論依據(jù)，為推動(dòng)克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)一步發(fā)展提供重要基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用克氏原螯蝦購自荊州市荊州區(qū)太湖鎮(zhèn)，平均體重10 g左右，體質(zhì)健康。試驗(yàn)在長江水產(chǎn)研究所中華鱘養(yǎng)殖基地進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

試驗(yàn)分別以不同比例的魚粉、菜籽粕、發(fā)酵豆粕、雞肉粉和肉骨粉為蛋白質(zhì)原料，添加相同水平的棉粕、豆粕制成5種等氮等能的粉狀飼料。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料經(jīng)粉碎過80目篩，逐級(jí)混勻后加水?dāng)嚢瑁眯⌒徒g肉機(jī)制成粒徑為2 mm的顆粒，低溫烘干并放入-20 ℃冰箱中保存。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平

續(xù)表

注：每千克復(fù)合維生素中含β-胡蘿卜素 96 mg，VD312 mg，VE 200 mg，VK340 mg，VB140 mg，VB280 mg，煙酰胺 400 mg，泛酸鈣 600 mg，VB6120 mg，B120.8 mg，葉酸 8 mg，生物素 4 mg，VC 200 mg，肌醇 4 000 mg，氯化膽堿 6 000 mg，對(duì)氨基苯甲酸 10 mg。

每千克復(fù)合礦物質(zhì)中含KAl(SO4)21.59 g，CaCO3181.01 g，Ca(H2PO4)2，CoCl20.7 g，MgSO452.16 g，MnSO4·H20 0.7 g，KCl 165.53 g，KI 0.14 g，ZnSO41.92 g，NaH2PO4136.05 g，Na2SeO30.06 g，CuSO4·5H2O 0.75 g，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 13.38 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

用商品料馴化克氏原螯蝦1周。然后挑選大小均一、體格健壯的克氏原螯蝦幼蝦，將其分為5組，分別為對(duì)照組、菜籽粕組、發(fā)酵豆粕組、雞肉粉組、肉骨粉組,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾蝦，隨機(jī)分配于15個(gè)(直徑2 m、高1 m)養(yǎng)殖桶中，分別投喂不同的試驗(yàn)飼料。每日投喂2次(09∶00；18∶00)，投喂量為體質(zhì)量的4%～6%，試驗(yàn)水體處于微流狀態(tài)，溶解氧(DO)≥5 mg/L，pH 7.6±0.1，水溫控制在(24±1)℃，試驗(yàn)共進(jìn)行6周。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，稱取每組蝦的終末體重,并統(tǒng)計(jì)成活率。每桶隨機(jī)取3尾蝦在冰盤上解剖，取肝臟及肌肉置于液氮中保存,用于相關(guān)酶活性及基因表達(dá)分析，取去殼肌肉于-20 ℃冰箱中保存，用于肌肉常規(guī)組成分析。

1.5 樣品分析

1.5.1 生長性能分析

試驗(yàn)完成后，按照以下公式計(jì)算成活率(SR)、增重率(WGR)、特定生長率(SGR)。

SR=(Mt/M0)×100%

WGR= [(Wt-Wo)/Wo]×100%

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%

式中，Mt表示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦存活數(shù)尾數(shù)，M0表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)蝦存活數(shù)尾數(shù)；Wt表示終末體質(zhì)量，W0表示初始體質(zhì)量；t表示飼養(yǎng)天數(shù)。

1.5.2 肌肉營養(yǎng)成分分析

取其肌肉組織用于測定蛋白質(zhì)(GB/T 5009.5—2003)、水分(GB/T 5009.3—2003)和粗脂肪(GB/T 5009.6—2003)[16]。

1.5.3 肝胰臟消化酶分析

取肝胰臟0.2 g左右加9倍質(zhì)量的雙蒸水冰浴中勻漿制備粗酶液。用福林-酚法測定蛋白酶活性，蛋白酶活力單位定義：在37 ℃下，每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸作為一個(gè)酶活力單位(U)。用淀粉-碘比色法測定淀粉酶活性，淀粉酶活力單位定義：在37 ℃、30 min內(nèi)，每毫克蛋白能完全水解淀粉10 mg稱為一個(gè)淀粉酶活力單位(U)。采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定脂肪酶活性。酶液蛋白含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。酶活力以比活力(U/mg prot)表示，酶的比活力=酶活力/蛋白含量。

1.6 RNA的提取及cDNA合成

將保存在液氮中的肝臟和肌肉組織于液氮中研磨成粉末。使用Trizol reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，按照提取說明操作提取總RNA。按照FastKing RT Kit(With gDNase)(北京天根生化科技有限公司)操作說明，合成cDNA第一鏈。

1.7 胰島素生長因子受體(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R)基因克隆及表達(dá)分析

根據(jù)GenBank中編號(hào)MG557703的克氏原螯蝦IGF1R序列，設(shè)計(jì)引物PC-F-S2，PC-F-A2對(duì)胰島素生長因子受體基因進(jìn)行熒光定量PCR分析其表達(dá)情況。其中以18S RNA作為內(nèi)參[17]，引物序列見表2，引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表2 熒光定量PCR檢測所用引物

用TRIzol Reagent 提取總RNA 后， 選擇ABS比值在1.8～2.0，3條電泳條帶完整清晰的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(每個(gè)樣本取500 ng 總RNA)，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系：在20 μL的Quantitative real-time PCR反應(yīng)混合液中含模板1 μL，上游和下游引物各0.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min 預(yù)變性，然后95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)，在75～95 ℃進(jìn)行熔解曲線檢測。反應(yīng)在QIAGEN Rotor-GeneQ 6000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。采樣檢測15個(gè)樣本，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)所涉及的試劑盒均購自北京TIANGEN公司。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)豐度采用2-△△CT法進(jìn)行分析，以克氏原螯蝦18S RNA為內(nèi)參，對(duì)得到的各樣品CT值進(jìn)行均一化處理，以投喂魚粉為蛋白質(zhì)原料的飼料的目的基因 mRNA豐度為基準(zhǔn)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用Duncan氏多重比較法分析試驗(yàn)結(jié)果平均數(shù)的差異顯著性，差異顯著水平為P<0.05，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白源飼料對(duì)克氏原螯蝦生長的影響

從表3可見，試驗(yàn)進(jìn)行6周后，各組克氏原螯蝦的成活率沒有顯著性差異。發(fā)酵豆粕組的增重率最高，其次是對(duì)照組和雞肉粉組，發(fā)酵豆粕組顯著高于菜籽粕組和肉骨粉組。對(duì)于特定生長率，發(fā)酵豆粕組、雞肉粉組和對(duì)照組無顯著差異，菜籽粕組顯著低于其他各組。

表3 不同蛋白源飼料對(duì)克氏原螯蝦生長的影響

注：同列數(shù)值后不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)，表4同。

2.2 不同蛋白源飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉營養(yǎng)成分的影響

由表4可見，不同蛋白源飼料對(duì)克氏原螯蝦水分和粗脂肪無顯著性影響；對(duì)照組的粗蛋白含量最高，顯著高于菜籽粕組和雞肉粉組，但與發(fā)酵豆粕組和肉骨粉組沒有顯著性差異。

表4 不同蛋白源飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉營養(yǎng)成分的影響

2.3 不同蛋白源飼料對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟消化酶的影響

從圖1可見，發(fā)酵豆粕組的肝胰臟蛋白酶活性最高，顯著高于菜籽粕和雞肉粉組，發(fā)酵豆粕、肉骨粉組和對(duì)照組之間差異不顯著，菜籽粕組肝胰臟蛋白酶活性顯著性低于對(duì)照組，其蛋白酶活性最低。肝胰臟淀粉酶活性最高的是肉骨粉組，顯著性高于對(duì)照組，發(fā)酵豆粕組和菜籽粕組肝胰臟的淀粉酶活性顯著低于對(duì)照組。肝胰臟脂肪酶活性最高的是發(fā)酵豆粕組，但各組間沒有顯著性差異。

圖1 不同蛋白源飼料對(duì)克氏原螯蝦肝臟蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性影響的比較Fig.1 Comparison of total liver protease,amylase and lipase activities of P.clarkii fed the diets containing various protein sourcesa:蛋白酶；b: 淀粉酶；c: 脂肪酶注：圖上標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2同。

2.4 胰島素生長因子受體基因IGF1R的克隆及表達(dá)分析

如圖2所示，在肌肉IGF1R mRNA相對(duì)表達(dá)量上，發(fā)酵豆粕組的表達(dá)量最高，與對(duì)照組差異性不顯著，但顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組；在肝臟IGF1R mRNA表達(dá)上，各試驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量都顯著高于對(duì)照組，菜籽粕組、發(fā)酵豆粕組和肉骨粉組間相對(duì)表達(dá)量差異性不顯著。

圖2 不同蛋白源飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉及肝臟中IGF1R相對(duì)表達(dá)量的比較Fig.2 Comparison in muscle and liver relative expression of IGF1R mRNA of P.clarkii fed the diets containing various protein sourcesa:肌肉;b: 肝臟

3 討論

本試驗(yàn)分析了不同蛋白源(菜籽粕、發(fā)酵豆粕、雞肉粉、肉骨粉)對(duì)克氏原螯蝦營養(yǎng)生理的影響。發(fā)酵豆粕是利用微生物在可控條件下降解豆粕，去除抗?fàn)I養(yǎng)因子，將豆粕中蛋白降解成小肽，同時(shí)產(chǎn)生一些微生物的代謝產(chǎn)物，改善其可利用性。有研究表明：發(fā)酵豆粕替代飼料中6%的魚粉，不影響凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的生長和飼料利用[18]。此外，海鱸(Lateolabraxjaponicus)飼料中，發(fā)酵豆粕可以替代25%的魚粉[1]。許氏平鮋(Sebastesschlegeli)飼料中，發(fā)酵豆粕可以替代40%的魚粉[19]。本試驗(yàn)中利用發(fā)酵豆粕替代50%魚粉，經(jīng)過6周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)有利于克氏原螯蝦的生長。

菜籽粕是一種重要的植物蛋白源，其具有蛋白含量高(32%以上)，氨基酸組成相對(duì)平衡等優(yōu)點(diǎn)，在我國來源廣泛，在水產(chǎn)飼料中具有極大的應(yīng)用潛力。目前，對(duì)菜籽粕對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長、生理生化的影響以及替代魚粉等方面，已有一定的研究，發(fā)現(xiàn)菜籽粕可以替代部分魚粉，而對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長性能影響不大[20-21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菜籽粕替代50%魚粉，降低了克氏原螯蝦的生長?？赡苁怯捎诓俗哑珊卸喾N毒素、抗?fàn)I養(yǎng)因子和較高粗纖維含量，導(dǎo)致克氏原螯蝦消化減弱，進(jìn)而影響了生長。

雞肉粉和肉骨粉作為動(dòng)物蛋白源，廣泛應(yīng)用于魚飼料中以部分替代魚粉，目前已有許多研究。雞肉粉可替代黑海菱鲆(Scophthalmusmaeoticus)25%的飼料魚粉，生長性能沒有顯著降低[22]。大黃魚(Pseudosciaenacrocea)飼料中，肉骨粉替代45%的魚粉，對(duì)大黃魚生長的影響不顯著[23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示雞肉粉或肉骨粉替代50%魚粉，克氏原螯蝦的生長性能沒有顯著性降低。

隨著配合飼料的推廣應(yīng)用，在實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)常會(huì)遇到的克氏原螯蝦生長速度快但尾部肌肉不飽滿的問題。推測應(yīng)該是小龍蝦的脫殼周期變短，蛋白質(zhì)沉積不夠的問題造成的。本實(shí)驗(yàn)中，在對(duì)克氏原螯蝦肌肉營養(yǎng)成分分析后，發(fā)現(xiàn)水分和粗脂肪沒有差異；而粗蛋白有顯著性差異，都低于對(duì)照組。這可能由于魚粉相比于其他動(dòng)物性或植物性蛋白源，它的蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成平衡及抗?fàn)I養(yǎng)因子少，更有利于魚類的營養(yǎng)需求。敬婷等[24]在研究羅非魚(Oreochromisniloticus)飼料中肉骨粉替代魚粉實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過添加包膜賴氨酸、蛋氨酸來平衡肉骨粉替代組中的賴氨酸、蛋氨酸含量，可能是替代后沒有影響羅非魚生長性能的一個(gè)重要因素。

消化酶活力的高低決定了魚類對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，影響其生長速度。而餌料是引起消化酶變化的一個(gè)重要因素，其種類和質(zhì)量不僅影響消化酶的活性、種類、分布，而且還可影響酶的分泌，魚類能適應(yīng)于不同的飼料而調(diào)整消化酶的分泌。例如，孫盛明等[25]研究發(fā)現(xiàn)青魚專用配合飼料中豆粕和菜粕蛋白替代魚粉蛋白超過50%對(duì)青魚腸和肝胰臟的蛋白酶活力有顯著的影響，而豆粕和菜籽粕替代魚粉25%、替代魚粉50%和對(duì)照組差異不顯著。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕替代50%魚粉組的肝胰臟蛋白酶活性略高于對(duì)照組，但差異不顯著，這可能與豆粕發(fā)酵處理后，去除一些抗?fàn)I養(yǎng)因子后更有利于蝦體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收與利用；菜籽粕替代50%魚粉組顯著低于對(duì)照組，可能由于菜籽粕中含有多種毒素和抗?fàn)I養(yǎng)因子如硫代葡萄糖甙、芥酸、植酸、單寧等，魚類食用后隨時(shí)會(huì)分解為硫氰酸鹽、異硫氰酸鹽(ITC)、惡唑烷硫酮(OZT)、腈等有毒物，其中腈化物主要損害肝臟和腎臟[26]，可能由此損害了肝胰臟導(dǎo)致蛋白酶活性分泌的減弱。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)雞肉粉和肉骨粉替代50%魚粉后，蛋白酶活性影響不顯著，這與動(dòng)物性蛋白相比植物性蛋白更利于蝦體的吸收有關(guān)。

飼料中蛋白質(zhì)種類及含量、脂肪種類及含量對(duì)魚類腸道淀粉酶活性影響不顯著[27]，而飼料中淀粉含量對(duì)其影響顯著。由于本試驗(yàn)淀粉酶活性存在差異，主要是由于飼料中淀粉含量不同而導(dǎo)致的。對(duì)于脂肪酶的活性，其主要受飼料脂肪含量的影響，而本試驗(yàn)中各組飼料脂肪水平保持一致，所以脂肪酶活性沒有顯著性差異。

本試驗(yàn)在對(duì)胰島素生長因子受體基因IGF1R進(jìn)行克隆后，對(duì)其在肌肉和肝臟中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。胰島素樣生長因子1(IGF1)是一種多功能細(xì)胞調(diào)控因子，它的結(jié)構(gòu)特征為其促生長和物質(zhì)代謝功能提供依據(jù)[28]。而胰島素生長因子受體基因起著介導(dǎo)胰島素樣生長因子的作用，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和機(jī)體的正常發(fā)育中具有重要作用。Gricourt等[29]運(yùn)用人類重組蛋白IGFR研究了長牡蠣(Crassostreagigas)IGF通路，認(rèn)為在長牡蠣體內(nèi)也具有一條IGF-IGFR通路，在該通路中，IGF發(fā)揮了促進(jìn)生長的功能。宋姍姍等[30]闡述了胰島素樣生長因子Ⅰ受體結(jié)構(gòu)、功能及其與生長發(fā)育的關(guān)系。本研究中結(jié)果顯示該基因在小腸和肝臟中均有表達(dá)，且在肝臟中表達(dá)量較高。發(fā)酵豆粕組在小腸和肝臟中都出現(xiàn)比較高的表達(dá)，而此組的克氏原螯蝦生長最好，說明該基因的表達(dá)量與克氏原螯蝦的生長有密切的聯(lián)系。