阿利吉侖對氧糖剝奪損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用及可能機制*

陸婉杏， 蒙蘭青， 黃曉華

(1右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科， 廣西 百色 533000； 2廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院神經內科， 廣西 南寧 530001)

腦缺血性疾病嚴重影響著病人的生存質量[1]，而腦缺氧缺糖導致的損傷是腦血管疾病的直接原因[2]。氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)損傷模型是一種通過剝奪細胞的營養(yǎng)來模擬腦缺血的經典離體細胞模型。近年神經細胞的OGD模型多被用于在細胞水平模擬臨床腦缺血過程，以進行細胞自主修復及藥效機制方面的研究[3]。

阿利吉侖(aliskiren)不僅具有抗氧化應激、減輕炎癥反應、抗凋亡和減小梗死體積等多種功能，還可以改善神經功能的缺失[4]。但目前有關阿利吉侖在神經細胞OGD損傷中的保護作用研究極少，僅見苗江永[5]通過改良Longa線栓法建立腦缺血再灌注模型，因而有必要探討阿利吉侖對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的腦保護作用及其相關機制。神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y的某些生化、藥理和功能方面的特性與正常神經元具有一定的相似性，故而被廣泛用于神經系統(tǒng)疾病及藥物作用機制方面的研究[6]。本實驗以SH-SY5Y細胞為研究對象，建立OGD模型模擬腦缺血性損傷，分析阿利吉侖對氧糖剝奪SH-SY5Y細胞興奮性氨基酸轉運蛋白2(excitatory amion acid transporter 2, EAAT2/GLT-1)、EAAT3/EAAC1、EAAT4、S100鈣結合蛋白β亞基(S100 calcium-bin-ding protein β subunit, S-100β)及內皮素1(endothelin-1,ET-1)表達、乳酸(lactic acid,LD)水平、Na+-K+-ATPase活性及細胞形態(tài)的影響，探討阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用，為腦缺血性疾病的治療提供實驗依據，也為阿利吉侖作為有效腦保護劑的臨床應用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 主要藥品與試劑

阿利吉侖購自BioChemPartner；DMEM/F12培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK-8、 GLT-1 ELISA試劑盒、EAAC1 ELISA試劑盒、 EAAT4 ELISA試劑盒、ET-1 ELISA 試劑盒、S-100β ELISA試劑盒和Hoechst 33258購自Bioswamp;LD測試盒和超微量Na+-K+-ATP酶測試盒購自南京建成生物工程研究所。

2 主要儀器

酶標儀購自Labsystems Multiskan MS;CO2恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo。

3 方法

3.1細胞培養(yǎng) 神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中科院細胞庫，復蘇后接種于含10%的胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化、400×g離心3 min、細胞重懸后，傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

3.2不同OGD處理時間對SH-SY5Y細胞活力的影響 用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液調整SH-SY5Y細胞濃度后，種植于96孔板中，使每孔含3×103個細胞；OGD(37 ℃，1%O2，5%CO2)分別處理0 h、0.5 h、1 h、2 h及4 h；處理完畢后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；于酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光度(A)值，細胞相對存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。實驗重復3次。本實驗對照組細胞的存活率定為100%；以細胞相對存活率<60%的處理時間作為OGD造模時間[7]；結果篩選出OGD損傷時間為4 h，繼續(xù)后續(xù)實驗。

3.3不同劑量阿利吉侖對OGD處理的SH-SY5Y細胞的影響 取培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞，隨機分為5組，即對照(control)組，OGD組及阿利吉侖低、中、高劑量(5.0、10.0和20.0 μmol/L)組。除對照組外，OGD組和阿利吉侖組均進行OGD造模。將對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞以1×108/L接種到96孔板，正常培養(yǎng)24 h。OGD組換成無糖培養(yǎng)液，阿利吉侖低、中、高組換成含5.0、10.0和20.0 μmol/L阿利吉侖的無糖培養(yǎng)液，OGD(37℃，1%O2，5%CO2)處理4 h后，換正常培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。

3.4ELISA檢測SH-SY5Y細胞的GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β表達 OGD處理4 h后，分別按照GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β ELISA試劑盒說明書檢測各實驗組SH-SY5Y細胞的GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β表達。實驗重復3次。

3.5Hoechst 33258染色觀察SH-SY5Y細胞的形態(tài)變化 OGD處理4 h后，復氧24 h，棄培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定10 min，棄固定液，PBS洗兩遍，每次3 min，棄掉液體。加入少量Hoechst 33258染液，室溫染色3-5 min。棄掉染色液，用PBS洗5遍，每次3 min，棄掉液體。熒光顯微鏡檢測和拍照。

3.6LD測試盒和超微量Na+-K+-ATP酶測試盒檢測SH-SY5Y細胞的LD含量和Na+-K+-ATPase活性 OGD處理4 h后，取各孔上清，分別按LD測試盒和超微量Na+-K+-ATP酶測試盒說明書操作，在酶標儀530 nm和636 nm下讀取各孔的A值，計算各組的平均值。實驗重復3次。LD含量用mmol/(g protein)表示；Na+-K+-ATPase活性用U/(g protein)表示。

4 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0對各組實驗數(shù)據進行分析，所有數(shù)據均以平均值±標準差(mean ± SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同OGD損傷時間對SH-SY5Y細胞活力的影響

CCK-8檢測結果顯示，與正常細胞相比，OGD損傷0.5 h、1 h、2 h和4 h的細胞A值逐漸降低(P<0.05)，即OGD損傷時間越長，SH-SY5Y細胞的活力越低，見圖1。OGD損傷4 h時，SH-SY5Y細胞的相對活力不足60%，因此4 h可作為后續(xù)實驗OGD造模時間。

Figure 1.Effect of time after OGD injury on viability of SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖1 不同OGD損傷時間對SH-SY5Y細胞活力的影響

2 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細胞GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β表達的影響

ELISA檢測結果表明，與對照組相比，OGD組的GLT-1、EAAC1和EAAT4表達顯著減少(P<0.05)，ET-1和S-100β的表達顯著增加(P<0.05)；與OGD組比較，阿利吉侖(5.0、10.0和20.0 μmol/L)組的GLT-1、EAAC1和EAAT4表達呈劑量依賴性增加(P<0.05)， ET-1和S-100β表達呈劑量依賴性減少(P<0.05)，圖2。

Figure 2.Effect of aliskiren on levels of GLT-1, EAAC1, EAAT4, ET-1 and S-100β in SH-SY5Y cells induced by OGD. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsOGD group.

圖2 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細胞GLT-1、EAAC1、EAAT4、ET-1和S-100β表達的影響

3 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

Hoechst 33258染色結果顯示，對照組的細胞核總體染色均勻，呈淡藍色；OGD損傷后，SH-SY5Y細胞核呈亮藍色，致密濃染，少數(shù)呈碎片狀；阿利吉侖(5.0、10.0和20.0 μmol/L)干預后，致密濃染的細胞核有所減少，形態(tài)趨于正常,見圖3。

Figure 3.Hoechst 33258 staining of SH-SY5Y cells in each group (×200).

圖3 各組SH-SY5Y細胞Hoechst 33258染色

4 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細胞乳酸含量和Na+-K+-ATPase活性的影響

與對照組相比，OGD組的乳酸含量顯著升高(P<0.05)，Na+-K+-ATPase活性顯著降低(P<0.05)；與OGD組相比，阿利吉侖(5.0、10.0和20.0 μmol/L)組的LD含量呈劑量依賴性降低(P<0.05)，Na+-K+-ATPase活性呈劑量依賴性升高(P<0.05)，見圖4。

討 論

許多中樞神經系統(tǒng)疾病與神經細胞的缺糖缺氧密切相關。腦細胞對葡萄糖和氧的依賴性都非常高，長期缺氧缺糖會導致腦細胞的不可逆性損傷，故而選擇合適的神經細胞OGD損傷時間進行神經保護類藥物的篩選尤為重要[8]。本研究采用CCK-8檢測OGD損傷不同時間后SH-SY5Y細胞的活力，結果顯示OGD損傷時間越長，細胞活力越低；4 h時，細胞相對活力不足60%，因此，選擇4 h作為后續(xù)實驗OGD造模時間比較合適。因為細胞活力太高時，后期阿利吉侖干預難以體現(xiàn)其對SH-SY5Y細胞的保護作用；細胞活力太低時，阿利吉侖干預難以對OGD損傷的SH-SY5Y細胞進行保護。有研究也認為，右美托咪啶對氧糖剝奪/再灌注誘導神經細胞凋亡起保護作用時，細胞活力接近50%的氧糖剝奪再灌注(OGD/R)造模時間比較合適[7]。

Figure 4.Effect of aliskiren on content of LD and activity of Na+-K+-ATPase in SH-SY5Y cells induced by OGD. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group.

圖4 阿利吉侖對OGD損傷的SH-SY5Y細胞LD含量和Na+-K+-ATPase活性的影響

興奮性氨基酸毒性是腦缺血損傷的主要機制之一。谷氨酸的清除主要受興奮性谷氨酸轉運體的調節(jié)[9]。雖然GLT-1為膠質細胞轉運體，但近年發(fā)現(xiàn)了僅在肽鏈 C端進行改變的 GLT-1 剪切變異體，且GLT-1a、GLT-1b和GLT-1c主要分布于神經元[10]；EAAC1和EAAT4均為神經元轉運體。EAATs和Na+-K+-ATPase是直接偶聯(lián)的，即兩者作為一個功能復合體調控谷氨酸的轉運[11]。本實驗ELISA結果表明，阿利吉侖能通過上調OGD損傷的SH-SY5Y細胞GLT-1、EAAC1和EAAT4表達水平，增強Na+-K+-ATPase活性，通過GLT-1、EAAC1和EAAT4及時將興奮性的谷氨酸從突觸間隙轉運到細胞內，終止興奮性突觸傳遞并維持細胞外谷氨酸的正常濃度，從而減輕細胞損傷。

ET-1是一種在中樞神經系統(tǒng)中能產生廣泛病理、生理效應的內皮縮血管因子[12]。當發(fā)生腦缺血缺氧時，ET-1的合成和釋放量會大幅提高，造成血管的劇烈收縮，導致嚴重的腦損傷。本實驗中，阿利吉侖干預后各劑量組的ET-1水平均較OGD組顯著下降，這提示阿利吉侖可能是通過下調ET-1來減少OGD對SH-SY5Y細胞的損傷。

S-100β是一種酸性鈣結合蛋白，參與調節(jié)神經細胞的生長、分化和代謝，被認為是反映腦膠質細胞損傷的生化標志性蛋白[13]。另外，星形膠質細胞和神經元相互影響。EAATs 能夠促進谷氨酸能突觸周圍的星形膠質細胞快速釋放谷氨酰胺，被神經元攝取用來合成谷氨酸和γ-氨基丁酸[14]。正常情況下的S-100β蛋白濃度很低，當S-100β蛋白表達過量時，神經元內Ca2+水平上升，當Ca2+超過神經元的耐受閾時，會產生神經毒性，造成神經功能的嚴重損傷[15]。本實驗ELIA檢測結果顯示，阿利吉侖組SH-SY5Y細胞的S-100β含量顯著低于OGD組，提示阿利吉侖可能是通過抑制S-100β的表達水平，阻止其介導的Ca2+濃度超載，從而保護OGD損傷的SH-SY5Y細胞。

本實驗中，OGD組SH-SY5Y細胞的LD含量顯著高于對照組，提示OGD損傷可以降低細胞利用氧的能力，細胞的能量代謝主要通過糖酵解獲得；細胞內Na+-K+-ATPase活性降低，表明細胞的能量代謝發(fā)生障礙。阿利吉侖干預后，細胞的LD含量顯著減少，Na+-K+-ATPase活性顯著增加，說明阿利吉侖可以減輕OGD損傷引起的細胞能量代謝障礙，增加細胞的能量供應，發(fā)揮神經保護作用。這與秦文等[16]在研究N-乙酰半胱氨酸對氧糖剝奪大鼠皮層星形膠質細胞的保護作用時得出的結論一致。本研究結果為阿利吉侖在臨床應用及產品開發(fā)提供了實驗依據，也為防治腦缺血疾病的藥物開發(fā)提供了參考資料。