氟化鈉與氫化鎂協(xié)同抗Wistar大鼠口腔牙菌斑作用的研究*

秦 漢 姜亨波 楊青文 秦 臻 石運(yùn)芝

口腔醫(yī)學(xué)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271000

牙菌斑(dental plaque)是口腔中不能被水沖去或漱掉的細(xì)菌性斑塊，是由基質(zhì)包裹的互相黏附或黏附于牙面、牙間或修復(fù)體表面的軟而未礦化的細(xì)菌性群體[1]。牙菌斑作為齲齒四聯(lián)因素中起主導(dǎo)作用的一個(gè)因素，它通過與糖反應(yīng)持續(xù)產(chǎn)酸，致使牙釉質(zhì)脫礦，而產(chǎn)生齲齒[2]。因此，減少牙菌斑成為實(shí)現(xiàn)有效防齲的重要靶點(diǎn)。

氟化物因能促使早期釉質(zhì)病損再礦化、殺滅致齲菌和阻止致齲菌代謝糖產(chǎn)酸而成為重要的防齲物質(zhì)[1]。目前常用氟化物有8%氟化亞錫、75%氟化鈉甘油糊劑及含氟涂料等。氟化物雖然具有對(duì)軟組織無腐蝕性、不使牙變色等優(yōu)點(diǎn)，但因攝入過高的氟會(huì)引起人體慢性氟中毒，并且長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致耐受菌株的產(chǎn)生[2]，因此我們的目的是尋找一種能與氟化物起協(xié)同作用的藥物，進(jìn)而減少氟化物的用量，避免氟化物中毒。氟化鈉(NaF)作為一種重要的氟化鹽，常用來制造其它氟化物，但對(duì)NaF防齲作用的研究報(bào)道較少。

2007年日本學(xué)者Ohsawa報(bào)道，動(dòng)物呼吸2%的氫氣可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子，顯著改善腦缺血再灌注損傷[3]。氫氣(hydrogen)，作為一種無毒、容易制備且具有選擇性抗氧化作用的氣體，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。 Kim J等發(fā)現(xiàn)富氫水能有效抑制體外鏈球菌菌斑生物膜的形成[3]。氫化鎂(MgH2)是一種白色結(jié)晶的化學(xué)物質(zhì)，與水反應(yīng)放出氫氣，MgH2+H2O=H2↑+Mg(OH)2。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，采用體內(nèi)菌斑染色和體外藥敏試驗(yàn)方法，檢測(cè)氟化鈉和氫化鎂的抗牙菌斑作用，并分析可能的生物學(xué)機(jī)理。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康成年Wistar大鼠24只，體重(220±20)g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅公司，常規(guī)飼養(yǎng)，通風(fēng)清潔，光照12 h，適應(yīng)1周后開始試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氫化鎂、氟化鈉(上海瀚思化工有限公司)，水合氯醛(天津市大化學(xué)制劑廠)，TPY瓊脂培養(yǎng)皿(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)，TSB胰蛋白胨大豆肉湯(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)，菌斑染色劑-堿性品紅(日進(jìn)齒科材料有限公司)。用打孔機(jī)將空白濾紙制作成直徑為5 mm的空白紙片，高溫消毒后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組與牙菌斑采集

將24只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組(每組6只)：對(duì)照組、MgH2組、NaF組、NaF+MgH2組。各組大鼠分別進(jìn)行編號(hào)，保證菌斑染色試驗(yàn)效果與藥敏試驗(yàn)為同一個(gè)研究對(duì)象，減少實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)組大鼠每天飼喂普通顆粒飼料和高糖水(60%)。20天后，用菌斑染色劑檢測(cè)大鼠磨牙舌面與牙合面菌斑的形成情況，在牙合面窩溝點(diǎn)隙用標(biāo)準(zhǔn)取菌環(huán)法采集牙菌斑，輕刮取菌斑，剪下無菌環(huán)放入裝有1 mL生理鹽水的無菌瓶中，密封送實(shí)驗(yàn)室，稀釋后移入TSB增菌液中，37℃恒溫箱中培養(yǎng)備用。

1.3.2菌斑染色實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組以生理鹽水涂抹大鼠下頜左右第一與第二磨牙的舌面與牙合面，然后用蘸有菌斑顯示液的小棉球在上述部位進(jìn)行涂抹，蒸餾水沖洗后，進(jìn)行拍照、記錄；實(shí)驗(yàn)組中，對(duì)大鼠相應(yīng)牙齒進(jìn)行藥物涂抹20天后，采用同樣的方法檢測(cè)大鼠的牙菌斑數(shù)量，并進(jìn)行拍照、記錄。

菌斑計(jì)數(shù)指標(biāo)的測(cè)量，參照Rustogide[5]菌斑計(jì)數(shù)法進(jìn)行。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0=齦緣區(qū)與牙合面無菌斑；1=齦緣區(qū)的牙面有薄的菌斑，但視診不可見，若用探針尖的側(cè)面可刮出菌斑；2=在齦緣或牙合 面可見中等量菌斑；3=齦溝內(nèi)或齦緣區(qū)及牙合面有大量軟垢。菌斑指數(shù)=牙齒各區(qū)域菌斑計(jì)數(shù)之和/牙區(qū)域總數(shù)。

1.3.3藥敏試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前臨時(shí)配制170 mg/mL的氫化鎂、170 mg/mL氟化鈉以及兩者的等比例(1∶1)混合物溶液。采用無菌棉將TSB增菌液中的細(xì)菌分別均勻涂抹于普通培養(yǎng)基上，用無菌鑷子按照實(shí)驗(yàn)分組夾取空白紙片，在上述溶液中充分浸泡后，快速放入培養(yǎng)皿，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后取出，觀察、測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 在體菌斑染色結(jié)果

菌斑顯示液涂抹、蒸餾水沖洗后，著粉紅色的區(qū)域即為菌斑存在區(qū)(圖1)，陽(yáng)性著色主要見于大鼠下頜左右第一與第二磨牙的牙合面和舌面近牙齦緣。對(duì)照組在牙合面可見中等量菌斑，齦緣區(qū)的牙面與牙合面有薄的菌斑(圖1)。菌斑指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，氫化鎂與氟化鈉聯(lián)合用藥的菌斑指數(shù)明顯低于單獨(dú)應(yīng)用氫化鎂或氟化鈉組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠牙菌斑指數(shù)和抑菌圈直徑

注：同一列中上標(biāo)不同小寫字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

A.對(duì)照組；B.MgH2組；C.NaF組；D.NaF+MgH2組。

2.2 體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用TPY培養(yǎng)基培養(yǎng)的大鼠牙菌斑，在相同劑量濃度下，氫化鎂抑菌圈直徑小于氟化鈉(表1)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究還發(fā)現(xiàn)，在氫化鎂的藥敏試驗(yàn)中，抑菌圈內(nèi)部出現(xiàn)散在的菌落(圖2)，推測(cè)可能為耐藥株；氫化鎂與氟化鈉聯(lián)合用藥的抑菌圈直徑明顯大于單獨(dú)應(yīng)用氫化鎂或氟化鈉組(表1，圖2)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示氫化鎂與氟化鈉聯(lián)合具有良好的協(xié)同作用，能夠有效抑制大鼠牙菌斑的生長(zhǎng)繁殖。

A.對(duì)照組；B.MgH2組；C.NaF組；D.NaF+MgH2組。

3 討 論

牙菌斑是齲病發(fā)生的始動(dòng)因子，在pH 7～4范圍內(nèi)，pH每降低一個(gè)單位，羥基磷灰石的溶解性便可增加7倍，細(xì)菌的產(chǎn)酸能力及乳酸脫氫酶活性能直接影響致齲能力[6]。氟化鈉是目前常用的防齲物，但其攝入量無法準(zhǔn)確控制，有報(bào)道[7]稱當(dāng)氟攝入量超過6 mg/d時(shí)，可以導(dǎo)致氟化物中毒。本實(shí)驗(yàn)選用170 mg/mL 濃度的氟化鈉與氫化鎂進(jìn)行聯(lián)合使用，觀察其對(duì)混合菌種牙菌斑繁殖的影響，并與單獨(dú)使用氫化鎂或氟化鈉進(jìn)行比較。菌斑染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組菌斑指數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，且NaF+MgH2組菌斑指數(shù)顯著低于MgH2組和NaF組(P<0.05)，提示氫化鎂與氟化鈉的聯(lián)合用藥能夠有效的減少大鼠牙齒上的牙菌斑的數(shù)目且對(duì)牙菌斑的抑制效果要大于單獨(dú)使用氫化鎂或氟化鈉。在藥敏試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)照組氟化鈉濃度為170 mg/mL 時(shí)，可出現(xiàn)一個(gè)直徑為(14.80±2.12)mm的明顯抑菌圈，證明氟化鈉可以抑制牙菌斑中細(xì)菌的生長(zhǎng)。相關(guān)文獻(xiàn)中也曾報(bào)道，氟化物可以通過釋放出來的氟離子抑制多糖、脂磷壁酸等大分子物質(zhì)的合成來發(fā)揮其滅菌、產(chǎn)酸抑菌作用，進(jìn)而使牙菌斑內(nèi)細(xì)菌(包括致齲菌)的數(shù)量減少[8]。Sj?gren[9]的體外實(shí)驗(yàn)也表明，用1.5 ml/L的氟可抑制菌斑產(chǎn)酸，使菌斑pH值明顯升高。在氫化鎂的對(duì)照組中抑菌圈的直徑為(11.00±1.10)mm，但是抑菌圈周圍有散在的小菌落，考慮可能為耐藥菌，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍說明氫氣也具有抑制牙菌斑繁殖的能力，與之形成對(duì)比的是實(shí)驗(yàn)組中，氫化鎂與氟化鈉混合試劑抑菌圈直徑最大(P<0.05)，表明氫化鎂與氟化鈉混合試劑具有協(xié)同抵抗牙菌斑生長(zhǎng)的能力且藥效大于單獨(dú)使用氟化鈉或氫化鎂。

目前已有的研究中對(duì)人類口腔中牙菌斑成分已有了清楚的認(rèn)識(shí)，但有關(guān)大鼠牙菌斑的構(gòu)成卻有待進(jìn)一步研究，且導(dǎo)致大鼠致齲的機(jī)理也不明確，我們?cè)诶顜r濤等[10]的研究結(jié)論中發(fā)現(xiàn)，盡管人和大鼠口腔中細(xì)菌所占比例不同，但是牙菌斑中的優(yōu)勢(shì)菌仍為鏈球菌和放線菌，各自所占比例大約為41.23%和52.5%，提示大鼠致齲的機(jī)理應(yīng)與人類口腔致齲的機(jī)理基本一致，均可能是通過細(xì)菌無氧活動(dòng)來進(jìn)行產(chǎn)酸，然后作用于牙釉質(zhì)表面的羥基磷灰石而致齲。馬宏等研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌對(duì)牙面的吸附早期，氟可以通過競(jìng)爭(zhēng)性地與Ca2+結(jié)合，使細(xì)菌與牙面之間不能以“鈣橋”的方式結(jié)合，同時(shí)使游離菌與已粘附菌之間的連接作用減弱，有利于唾液的清除；氟還可作用于某些代謝醇而影響細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的糖酵解過程，抑制產(chǎn)酸作用[11]。我們的研究結(jié)果證明，氟化鈉具有減少牙菌斑的作用，推測(cè)可能通過相似的機(jī)理。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)氫化鎂與氟化鈉均對(duì)牙菌斑有顯著抑制作用，并且聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，比單一使用氟化鈉或氫化鎂效果更佳。另外，本實(shí)驗(yàn)僅是初步研究，許多環(huán)節(jié)，如氫化鎂產(chǎn)生氫氣的同時(shí)釋放出來的少量氫氧化鎂，是否也發(fā)揮一定的作用，氟化鈉與氫化鎂聯(lián)用的最佳效應(yīng)劑量等，都有待于進(jìn)一步研究。