隋佳 于夢 朱淑珍 魏青政★

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是一種常見的嚴(yán)重肝臟疾病，每年全球大約有2.4億人感染HBV，大約有60 萬人因此死亡。盡管人類在HBV 的防治方面取得了很大的進(jìn)展，但HBV感染仍然是慢性肝炎，肝硬化，肝癌的主要原因［1-3］。慢性HBV 感染過程包括免疫耐受期（immune tolerance，IT）、免疫清除期（immune clearance，IC）和非活動病毒攜帶期（inactive virus carrier，IA），在不同時期患者免疫系統(tǒng)的反應(yīng)不同，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，同時治療療效也不一樣［4-5］。細(xì)胞因子是機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能的重要分子，其產(chǎn)生和作用都離不開免疫系統(tǒng)，在HBV的感染和免疫過程中也扮演著不可替代的作用［6-7］。目前，臨床上對慢性乙型肝炎的免疫分期和治療療效評價的指標(biāo)有限，主要依賴乙肝兩對半、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamate-pyruvate transaminase，ALT）、乙型肝炎病毒DNA（HBV DNA）等血清學(xué)指標(biāo)，缺乏免疫指標(biāo)的參與。本研究旨在通過研究細(xì)胞因子與ALT、HBV DNA、免疫分期等的相關(guān)性，分析外周血細(xì)胞因子作為慢性乙型肝炎的療效評價指標(biāo)的潛在價值。

1 對象和方法

1.1 病例來源

選取2017年6月至2019年6月于本院傳染科門診就診的慢性HBV 感染患者75 例為病例來源，所有入組患者均由主治以上醫(yī)師依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》［8］中關(guān)于慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組病例及家屬均對本研究知情并同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝癌；②合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎感染者；③合并藥物性肝炎、酒精性肝炎、脂肪性肝炎；④合并自身免疫性肝病、系統(tǒng)性自身免疫性疾?。虎莺喜⑷焉镎?。

1.2 方法

1.2.1 分組

依據(jù)慢性乙型肝炎免疫分期標(biāo)準(zhǔn)［8-9］，將75 例慢性HBV 感染者分為IT 組20 例［HBeAg（+）、ALT＜60 U/L、HBV DNA＞105拷貝/mL］、IC 組30 例［HBeAg（+/-）、ALT＞60 U/L、HBV DNA＞105拷貝/mL］、IA 組25 例［HBeAg（-）、ALT＜60 U/L、HBV DNA＜105拷貝/mL］，同時選擇25 例無乙肝病史的健康志愿者為健康對照組。所有組別的性別比例、年齡均無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

將上述100 例受試者根據(jù)HBV DNA 水平不同分為低病毒載量組（HBV DNA＜105拷貝/mL）、中病毒載量組（105拷貝/mL≤HBV DNA＜106拷貝/mL）、高病毒載量組（HBV DNA＞106拷貝/mL）。再根據(jù)血清ALT 水平的不同分為低ALT 組（60 U/L≤ALT＜160 U/L）、中ALT 組（160 U/L≤ALT＜500 U/L）、高ALT 組（ALT≥500 U/L）。

1.2.2 細(xì)胞因子和ALT 檢測

所有受試者在入組次日早晨空腹采集靜脈血4 mL，靜置20 min，4 000 r/min 離心2 min、分離血清進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果根據(jù)不同分組進(jìn)行比較分析。細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）的檢測采用ELISA 法，檢測試劑盒均由武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司提供。實驗步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明進(jìn)行操作；ALT 應(yīng)用全自動生化分析儀，具體操作步驟參照ALT 測定試劑盒說明書。ALT＞160 U/L 為異常。

1.2.3 血清病毒載量（HBV DNA）檢測

分離患者血清，應(yīng)用Real-time PCR 法檢測血清中HBV DNA 載量。乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供（單位已經(jīng)換算成拷貝/mL）。實驗步驟參照試劑說明書。HBV DNA＞103拷貝/mL 為異常。

1.2.4 抗病毒治療

對30 例IC 組患者進(jìn)行抗病毒治療1年，藥物選用恩替卡韋分散片（江西青峰藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20100141），劑量為5 mg/d。治療12 個月后，再次檢測ALT、血清病毒載量和細(xì)胞因子水平并與治療前數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。作圖使用Graph-Pad Prism 7。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血HBV DNA 水平與細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

根據(jù)不同HBV DNA 水平分組（具體分組方法見1.3），分析不同HBV DNA 水平的慢性HBV 感染患者的外周血細(xì)胞因子水平，結(jié)果如表1所示。從正常對照組到高病毒載量組，IL-4、IL-6 的變化趨勢都是逐漸上升的，隨著病毒載量的升高，其表達(dá)量也升高，相鄰2 個組別間為（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。正常對照組和低病毒載量組血清IL-8 水平為（P＞0.05）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但明顯低于中病毒載量組（P＜0.05），值得一提的是，高病毒載量組IL-8 水平遠(yuǎn)高于其他組別（P＜0.05）。IL-17和IFN-γ 的變化趨勢較為一致，隨著病毒載量的升高而下降，且正常對照與低病毒載量組無顯著性差異（P＞0.05），除中高病毒載量組IFN-γ 無顯著性差異外，其余各組間均有顯著性差異（P＜0.05）。TGF-β 水平也誰病毒載量升高而升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 血清ALT 水平與細(xì)胞因子的關(guān)系

根據(jù)血清ALT 水平分組（具體分組方法見1.3），分析不同血清ALT 水平的慢性HBV 感染患者的外周血細(xì)胞因子水平，結(jié)果如表2所示。與2.1 中結(jié)果類似，IL-4、IL-6 和IL-8 隨ALT 水平的升高而升高，低ALT 組（60≤ALT＜160）IL-6 水平較正常對照組（ALT＜60）顯著升高外（P＜0.05），低ALT 組IL-4 和IL-8 水平較正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IL-17、IFN-γ、TGF-β 的變化趨勢與2.1 相似，高ALT 組TGF-β 與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（t=2.08，P=0.04＜0.05）。

2.3 慢性HBV 感染過程中不同階段患者的細(xì)胞因子變化

如圖1所示，與NC 組比較，IT 期患者血清IL-4、IL-6、IL-8 水平明顯升高（P＜0.05），除IA 期IL-8 水平與NC 組無顯著性差異外（P＞0.05），其余IC 期和IA 期患者IL-4、IL-6、IL-8 水平均顯著低于IT 期和NC 組患者（P＜0.05）。對比IL-17 和IFN-γ 表達(dá)可發(fā)現(xiàn)，與NC 組比較，IT 期患者IL-17 和IFN-γ 表達(dá)顯著減少（P＜0.05），但I(xiàn)C 期和IA 期又開始回升，IA 期IL-17 水平甚至與NC 組相當(dāng)，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與NC 組比較，IT 期TGF-β 水平明顯升高（P＜0.05），IC 期和IA 期水平略降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異，且與NC 組也無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 不同HBV DNA 水平患者細(xì)胞因子表達(dá)（±s）Table 1 Cytokine expression in patients with different HBV DNA levels（±s）

表1 不同HBV DNA 水平患者細(xì)胞因子表達(dá)（±s）Table 1 Cytokine expression in patients with different HBV DNA levels（±s）

vs 正常對照組，aP＜0.05；vs 低病毒載量組，bP＜0.05；vs 中病毒載量組cP＜0.05。

組別正常對照組低病毒載量組中病毒載量組高病毒載量組n 35 15 17 33 IL-4（pg/mL）8.5±3.6 18.8±5.1a 34.7±5.4ab 42.2±6.8abc IL-6（pg/mL）28.5±13.2 38.5±15.9a 58.1±17.3ab 70.4±21.3abc IL-8（pg/mL）7.0±2.2 8.6±3.8 12.3±3.7ab 61.1±41.3abc IL-17（pg/mL）154.3±66.3 157.1±46.3 113.5±37.2ab 89.4±31.3abc IFN-γ（pg/mL）31.5±7.1 28.7±5.1 16.4±3.7ab 14.5±4.3ab TGF-β（pg/mL）98.2±46.3 103.2±54.1 111.2±46.5 123.2±62.3

表2 不同ALT 水平患者細(xì)胞因子表達(dá)（±s）Table 2 Cytokine expression in patients with different ALT levels（±s）

表2 不同ALT 水平患者細(xì)胞因子表達(dá)（±s）Table 2 Cytokine expression in patients with different ALT levels（±s）

vs 正常對照組，aP＜0.05；vs 低ALT 組，bP＜0.05；vs 中ALT 組cP＜0.05。

組別正常對照組低ALT 組中ALT 組高ALT 組n 70 12 7 11 IL-4（pg/mL）8.6±4.1 10.3±3.2 28.7±4.9ab 54.3±10.9abc IL-6（pg/mL）29.6±11.8 52.5±17.8a 58.1±20.5a 75.4±21.3abc IL-8（pg/mL）7.5±4.2 10.6±3.3 22.4±10.1ab 63.1±38.4abc IL-17（pg/mL）159.3±70.6 153.0±44.5 123.9±40.1ab 74.4±29.6abc IFN-γ（pg/mL）33.2±6.3 25.7±5.8a 15.4±4.7ab 11.5±3.8ab TGF-β（pg/mL）99.4±50.1 105.1±37.8 115.2±45.4 133.2±41.2a

圖1 不同感染階段患者血清細(xì)胞因子水平Figure 1 Serum cytokine levels in patients at different stages of infection

2.4 抗病毒治療前后患者血清各指標(biāo)變化

收集25 例HBeAg 陽性的慢性乙肝患者，應(yīng)用替恩卡韋干預(yù)治療12 個月以后采集外周血，檢測ALT、HBV DNA、各細(xì)胞因子等數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖2所示。患者ALT 和HBV DNA 水平較治療前顯著降低（P＜0.05）。細(xì)胞因子的檢查發(fā)現(xiàn)，患者治療后IL-4、IL-6 和IL-8 較治療前明顯降低（P<0.05），IL-17、IFN-γ 較治療前明顯升高（P<0.05），TGF-β無顯著性變化（P>0.05）。

3 討論

HBV 感染在全球特別在發(fā)展中國家，是一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［3］。急性HBV 感染以后，大約1%～5%的成人會發(fā)生慢性感染，這種感染的發(fā)病率隨著年齡的增長而降低，新生兒和兒童的發(fā)病要高于成人［10］。慢性乙型肝炎病毒感染是導(dǎo)致患者發(fā)病和死亡的重要原因。從HBV 的自然史可以了解到，準(zhǔn)確把握慢性HBV 感染分期，對于治療和預(yù)防再發(fā)有著重要的意義［11］。目前關(guān)于慢性乙型肝炎的治療效果主要通過ALT，乙肝五項，HBsAg DNA 等角度來評判，但這一判斷機(jī)制大多從病毒和臟器角度出發(fā)，沒有深入到免疫層面。細(xì)胞因子在機(jī)體抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用，外周血細(xì)胞因子的檢測相對容易獲得，通過分析外周血細(xì)胞因子與ALT、HBsAg DNA 以及慢性HBV 感染分期的關(guān)系，有助于深入挖掘細(xì)胞因子作為慢性乙型肝炎療效評價的指標(biāo)［6］。

圖2 抗病毒治療前后ALT、HBV-DNA 和細(xì)胞因子的變化Figure 2 Changes of ALT，HBV-DNA and cytokines before and after antiviral therapy

IL-4 對HBV 基因表達(dá)有抑制作用，因此，它在調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)和肝臟的先天防御機(jī)制中起著重要而復(fù)雜的作用［12］。關(guān)于慢性肝炎患者IL-4水平的報道不盡相同，一些研究報道慢性肝炎患者IL-4 的表達(dá)水平降低而一些研究中表明IL-4 水平升高［13-16］。本研究中，IL-4 水平隨HBV DNA 水平升高而升高，與血清ALT 水平呈正相關(guān)趨勢，隨HBV 感染過程先升高后下降，抗病毒治療后水平下降。這些結(jié)果提示我們，IL-4 的表達(dá)水平與肝臟的炎癥和壞死程度密切相關(guān)，即患者受到感染后隨著疾病的進(jìn)展，肝臟炎性反應(yīng)逐漸增加，IL-4的水平也隨之波動。與IL-4 變化類似的還有IL-6、IL-8 和TGF-β。IL-6 是一種多效細(xì)胞因子，其水平的升高與各種慢性疾病［17］以及慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和疾病活動有關(guān)。本研究中，IL-6 的水平隨ALT 水平的升高而升高，也說明了IL-6 可以反應(yīng)肝臟的炎癥情況。TGF-β 與本研究中多個細(xì)胞因子有相互作用關(guān)系。在慢性乙型肝炎中，肝組織的炎性反應(yīng)激活肝臟間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TGF-β，TGF-β 對Th17 的分化成熟非常重要，它與IL-6 共同作用可以啟動CD4+T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞分化，成熟的Th17 細(xì)胞產(chǎn)生IL-17、IL-6 等炎性介質(zhì)，進(jìn)一步加強(qiáng)炎性反應(yīng)。TGF-β 本身具有抗炎作用，本研究中隨著ALT 水平的升高而升高，原因可能在于肝臟炎性反應(yīng)的增強(qiáng)促進(jìn)了TGF-β 的進(jìn)一步分泌以減少炎癥影響、維持肝臟功能。本研究中涉及到的另外兩個細(xì)胞因子IL-17 和IFN-γ的表達(dá)水平規(guī)律類似，隨HBV DNA 水平升高而升高、但在高病毒載量時表達(dá)水平略有下調(diào)，與ALT之間的關(guān)系也是如此；在不同的疾病進(jìn)展過程中，這兩種細(xì)胞因子水平隨疾病進(jìn)展先降低后升高，在抗病毒治療后表達(dá)水平顯著升高。造成這一現(xiàn)象的原因可能是在肝臟受到損傷時，在TGF-β 等細(xì)胞因子的作用下，Th17 細(xì)胞分化較多，IL-17 水平升高；而當(dāng)病毒感染較為嚴(yán)重時，總的CD4+ T細(xì)胞的數(shù)量減少，盡管有細(xì)胞因子促進(jìn)了Th17 細(xì)胞的分化但數(shù)量仍受到限制，導(dǎo)致IL-17 的分泌有一定程度的下降。IFN-γ 同理。

本研究通過比較不同HBsAg DNA 和ALT 分級的細(xì)胞因子（如IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ、TGF-β 等）的變化趨勢，探究哪些細(xì)胞因子可以作為潛在療效的評價指標(biāo)。結(jié)果顯示，除TGF-β 外，其他細(xì)胞因子均與HBsAg DNA 和ALT 存在一定的相關(guān)性，IL-4、IL-6、IL-8 與HBsAg DNA 和ALT呈正相關(guān)，IL-17、IFN-γ 與之呈負(fù)相關(guān)。然后對比不同慢性HBV 感染分期的細(xì)胞因子指標(biāo)差異，結(jié)果顯示，除TGF-β 外，其他細(xì)胞因子均在不同分期差異顯著（P＜0.05）。尤其是IL-8，在IC 期的表達(dá)水平明顯高于其他時期。最后，本研究選擇IC 期30 例進(jìn)行抗病毒治療，12 個月以后，檢測細(xì)胞因子和其他血清學(xué)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ 同HBsAg DNA 和ALT 一樣在治療前后有顯著性變化，TGF-β 在治療前后變化差異不大。因此，有理由相信，細(xì)胞因子可以作為評價慢性乙型肝炎療效的潛在指標(biāo)。本研究由于經(jīng)費和人員的關(guān)系，只檢測了六種報道與慢性HBV 感染關(guān)系較為密切的細(xì)胞因子，更多的潛在的細(xì)胞因子還需要更深入的研究來發(fā)現(xiàn)。此外，通過對細(xì)胞因子的深入挖掘，還有利于對慢性HVB 發(fā)病機(jī)制的研究。由于本研究所選的樣本量有限，且年齡因素尚未考慮，還需要更多更深入的研究論證IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ 是否可以作為慢性乙肝治療效果的評價指標(biāo)。

綜上所述，外周血細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ 與ALT、HBsAg DNA 及慢性乙肝感染分期都存在一定的相關(guān)性，可以作為慢性乙型肝炎治療的潛在評價指標(biāo)。