于鳳芹 徐云芳 張青

肝癌是一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，我國(guó)肝癌發(fā)病率及死亡率逐年升高，目前臨床主要采用手術(shù)切除治療肝癌，但患者術(shù)后5年生存期縮短且復(fù)發(fā)率升高［1-2］。由于部分患者出現(xiàn)放射抵抗性且患者就診時(shí)已錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)導(dǎo)致治療效果不佳，因而增強(qiáng)肝癌患者放射敏感性具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并可能發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，研究表明miRNA 異常表達(dá)與肝癌放射抵抗有關(guān)，但仍有部分miRNA 與肝癌放射抵抗的關(guān)系尚未完全闡明［3］。研究表明微小RNA-3182（microRNA-3182，miR-3182）在肺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-3182 可顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖及侵襲［4］。miR-3182 在骨肉瘤組織及細(xì)胞中低表達(dá)，lncRNA ODURL 可通過(guò)抑制miR-3182 的表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)展［5］。但miR-3182 在肝癌中的表達(dá)及其相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。序列相似性家族83 成員A（family with sequence similarity83，member A，F(xiàn)AM83A）在乳腺癌患者外周血中的表達(dá)水平明顯升高，且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］。肺腺癌組織中FAM83AmRNA 的表達(dá)升高，其高表達(dá)與臨床分期較晚及肺腺癌預(yù)后不良有關(guān)［7］。研究表明沉默F(xiàn)AM83A可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱及放射敏感性［8］。starBase 預(yù)測(cè)顯示FAM83A可能是miR-3182 的靶基因，但需進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，miR-3182 和FAM83A在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡和放射敏感性的影響尚未可知。因此，本研究主要探討miR-3182 對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡及放射敏感性的影響，并分析FAM83A是否為miR-3182 增強(qiáng)肝癌細(xì)胞放射敏感性的功能性靶基因，為miR-3182 在肝癌細(xì)胞放射增敏作用中的分子機(jī)制提供新方向，為miR-3182用于肝癌治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

肝癌細(xì)胞株MHCC97H、Huh7、MHCCLM3 與正常肝細(xì)胞株THLE-2 均購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640 培養(yǎng)基與胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公 司；Trizol 試 劑 與Lipofectamine2000 reagent 均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；兔抗人FAM83A、Bcl-2、Bax 抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及其基因表達(dá)質(zhì)粒均購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；miR-3182 mimics 及陰性對(duì)照miR-NC、FAM83A-siRNA 及陰性對(duì)照si-NC均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

細(xì)胞培養(yǎng)：取凍存肝癌MHCC97H 細(xì)胞，解凍，1 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，加入2 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，PBS 洗滌3 次×5 min，每24 h 更換一次培養(yǎng)液，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC97H細(xì)胞接種于96 孔板（1×105個(gè)/孔），放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到60%-70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-3182 mimics 與miR-NC 分別轉(zhuǎn)染至MHCC97H 細(xì)胞，分別為miR-3182 組、miRNC 組；將FAM83AsiRNA、siRNA-NC 分別轉(zhuǎn)入MHCC97H 細(xì)胞，分別為si-FAM83A 組、si-NC 組。為驗(yàn)證FAM83A 是否為miR-3182 功能性靶基因，將miR-3182 mimics 分別與FAM83A過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入MHCC97H 細(xì)胞，分別為miR-3182+pcDNA-FAM83A 組、miR-3182+pcDNA組，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)miR-3182、FAM83AmRNA表達(dá)

取出凍存細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后各組MHCC97H 細(xì)胞，冰上溶解，加入1 mLTrizol 試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒配置qRT-PCR 反 應(yīng) 體 系，miR-3182 以U6 為 內(nèi) 參，F(xiàn)AM83A以GAPDH 為內(nèi)參，檢測(cè)細(xì)胞中miR-3182、FAM83AmRNA 的相對(duì)表達(dá)量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，qRT-PCR 反應(yīng)條件：95℃3 min 循環(huán)1 次，95℃變 性15 s，60℃退 火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，采 用2-ΔΔCt法 計(jì) 算miR-3182、FAM83AmRNA 的表達(dá)水平。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將含有miR-3182 結(jié)合位點(diǎn)的FAM83A 3′UTR序列及其突變體插入熒光素酶報(bào)告基因載體中，分別得到WT-FAM83A、MUT-FAM83A，分別將質(zhì)粒與miR-3182 mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染至肝癌MHCC97H 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC97H 細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞接種于6 孔板，PBS 洗滌細(xì)胞，每孔分別加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，充分混勻，室溫孵育10 min，于1 h 內(nèi)放入流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

設(shè)定0、2、4、6、8 Gy 劑量組，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于直線加速器，按照設(shè)定劑量組照射細(xì)胞（源靶距100 cm，照射野10 cm×10 cm，吸收劑量率300 cGy/min），收集肝癌MHCC97H 細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞接種于24 孔板（3×104個(gè)/mL），加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10～15 d，PBS 洗滌，細(xì)胞呈肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)終止培養(yǎng)，計(jì)算克隆形成率（PE）及存活分?jǐn)?shù)（SF），PE=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%，SF=（照射組細(xì)胞PE/對(duì)照組細(xì)胞PE）×100%，應(yīng)用GraphPad Prism7.0 軟件采用多靶單擊模型進(jìn)行曲線擬合。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)FAM83A、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，加入RIPA 蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法定量蛋白，每孔30 μg 蛋白樣品進(jìn)行上樣，SDS-PAGE 電泳反應(yīng)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉1 h，TBST 洗滌3 次×5 min，按照1∶1 000 稀釋比稀釋一抗，加入FAM83A、Bcl-2、Bax 一抗，4℃孵育24 h，TBST 洗滌3 次×5 min，孵育二抗（稀釋比1∶2 000），滴加ECL 顯影，放入成像系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-3182 和FAM83A 在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)

與正常肝細(xì)胞株THLE-2 相比，miR-3182 在肝癌細(xì)胞株MHCC97H、Huh7、MHCCLM3 中的表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05），其中miR-3182 在肝癌MHCC97H 細(xì)胞中的表達(dá)水平較其他類(lèi)型肝癌細(xì)胞相對(duì)降低，而FAM83A mRNA 及蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖1、表1。

圖1 FAM83A 蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of FAM83A protein

表1 miR-3182 和FAM83A 在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=9）Table 1 Expression of miR-3182 and FAM83A in hepatoma cells and normal hepatocytes（±s，n=9）

表1 miR-3182 和FAM83A 在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=9）Table 1 Expression of miR-3182 and FAM83A in hepatoma cells and normal hepatocytes（±s，n=9）

與THLE-2 組比較，*P＜0.05

分組THLE-2 MHCC97H Huh7 MHCCLM3 F 值P 值miR-3182 1.03±0.09 0.29±0.03*0.42±0.04*0.35±0.03*367.174 0.000 FAM83A mRNA 1.01±0.09 2.76±0.28*3.11±0.29*2.86±0.27*136.632 0.000 FAM83A protein 0.21±0.02 0.63±0.06*0.75±0.07*0.69±0.06*172.800 0.000

2.2 miR-3182 靶向調(diào)控FAM83A 的表達(dá)

starBase 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-3182 與FAM83A 的3′UTR 區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2A。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)基因檢測(cè)結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染FAM83A 的3′UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-3182 mimics 的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著下調(diào)（P<0.05）；而miR-3182 mimics 或miR-NC 與MUT- FAM83A 3′UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染肝癌MHCC97H 細(xì)胞時(shí)，熒光素酶活性無(wú)明顯改變（P>0.05），見(jiàn)表2。表明miR-3182 在肝癌細(xì)胞中通過(guò)靶向作用于3′UTR 區(qū)負(fù)向調(diào)節(jié)FAM83A基因的表達(dá)。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肝癌MHCC97H 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-3182，F(xiàn)AM83A 表達(dá)水平下降（P＜0.05）；抑制miR-3182 表達(dá)，F(xiàn)AM83A表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2B、表3。表明miR-3182 可靶向抑制FAM83A 的表達(dá)。

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Table 2 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Table 2 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

與miR-NC 組比較，*P＜0.05

MUT-FAM83A 1.04±0.08 1.03±0.09 0.249 0.806分組miR-NC miR-3182 t 值P 值WT-FAM83A 1.02±0.09 0.38±0.04*19.495 0.000

圖2 miR-3182 靶向調(diào)控FAM83A 的表達(dá)Figure 2 miR-3182 targets the regulation of FAM83A expression

2.3 miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的影響

qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌MHCC97H 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-3182 mimics 的轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示，miR-3182 組細(xì)胞中miR-3182 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），表明成功提高肝癌MHCC97H 細(xì)胞中miR-3182 的表達(dá)水平。細(xì)胞放射及平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-3182 后，與miR-NC 組相比，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著減少（P＜0.05）見(jiàn)圖3C；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示與miRNC 組相比，miR-3182 組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）見(jiàn)圖3A，提示miR-3182 可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞放射敏感性。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-3182 后，與miR-NC 組相比，Bcl-2 表達(dá)下降（P＜0.05），Bax 表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3B、表4。表明過(guò)表達(dá)miR-3182 可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞放射敏感性。

表3 miR-3182 調(diào)控FAM83A 蛋白的表達(dá)（±s，n=9）Table 3 miR-3182 regulates the expression of FAM83A protein（±s，n=9）

表3 miR-3182 調(diào)控FAM83A 蛋白的表達(dá)（±s，n=9）Table 3 miR-3182 regulates the expression of FAM83A protein（±s，n=9）

與miR-NC 組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC 組比較，#P＜0.05

分組miR-NC miR-3182 anti-miR-NC anti-miR-3182 F 值P 值FAM83A protein 0.63±0.06 0.25±0.03*0.61±0.06 1.02±0.09#219.907 0.000

圖3 miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的影響Figure 3 Effect of miR-3182 overexpression on apoptosis and radiosensitivity of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H

表4 miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的影響（±s，n=9）Table 4 Effect of miR-3182 overexpression on apoptosis and radiosensitivity of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H（±s，n=9）

表4 miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的影響（±s，n=9）Table 4 Effect of miR-3182 overexpression on apoptosis and radiosensitivity of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H（±s，n=9）

與miR-NC 組比較，*P＜0.05

分組miR-NC miR-3182 t 值P 值miR-3182 1.00±0.08 2.67±0.28*17.204 0.000 Apoptosis rate（%）7.35±0.71 21.65±2.08*19.519 0.000 N k Bcl-2 protein 0.75±0.07 0.32±0.03*16.939 0.000 Bax protein 0.28±0.03 0.62±0.06*15.205 0.000 D0(Gy)2.564 1.322 Dq(Gy)1.699 0.477 1.940 1.434 SF2 0.696 0.300 0.390 0.756 SER-1.939

2.4 抑制FAM83A 表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的影響

肝癌MHCC97H 細(xì)胞中抑制FAM83A 表達(dá)后，與si-NC 組相比，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著下降（P＜0.05），Bax 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表5。

圖4 抑制FAM83A 表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的影響Figure 4 Effect of inhibition of FAM83A expression on apoptosis and radiosensitivity of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H

2.5 FAM83A 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的作用

為明確FAM83A 是否為miR-3182 的功能性靶基因，通過(guò)在過(guò)表達(dá)miR-3182 肝癌MHCC97H 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FAM83A 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，探討FAM83A 能否逆轉(zhuǎn)由miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞放射敏感性的作用，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)的肝癌MHCC97H 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FAM83A 后可逆轉(zhuǎn)miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞放射敏感性的作用，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），而B(niǎo)ax 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表6。

圖5 FAM83A 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的作用Figure 5 FAM83A overexpression reverses the effect of miR-3182 overexpression on apoptosis and radiosensitivity of MHCC97H cells

3 討論

miR-3182 在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其可能通過(guò)調(diào)控mTOR 和S6K1 基因表達(dá)進(jìn)而參與乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程［9］。miR-3182 表達(dá)水平降低還可能作為診斷肺腺癌的重要標(biāo)志物［10］。索拉非尼可能通過(guò)調(diào)控miR-3182 表達(dá)進(jìn)而參與結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)展進(jìn)程［11］。研究表明miR-3182 表達(dá)異常與鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。miR-3182 在肝癌中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究結(jié)果顯示miR-3182 在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，提示miR-3182 表達(dá)水平降低與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。本研究通過(guò)上調(diào)miR-3182 表達(dá)，研究結(jié)果顯示miR-3182 過(guò)表達(dá)可明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，說(shuō)明miR-3182 過(guò)表達(dá)可通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡從而增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性。本研究結(jié)果顯示miR-3182過(guò)表達(dá)后可促進(jìn)肝癌細(xì)胞中Bax 的表達(dá)，而抑制Bcl-2 的表達(dá)。研究表明Bcl-2/Bax 比例升高可抑制細(xì)胞凋亡，其比例降低可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13-14］，說(shuō)明miR-3182 過(guò)表達(dá)可下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)及上調(diào)Bax 的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，提示miR-3182 過(guò)表達(dá)可能通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性。

表5 抑制FAM83A 表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的影響（±s，n=9）Table 5 Effect of inhibition of FAM83A expression on apoptosis and radiosensitivity of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H（±s，n=9）

表5 抑制FAM83A 表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的影響（±s，n=9）Table 5 Effect of inhibition of FAM83A expression on apoptosis and radiosensitivity of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H（±s，n=9）

與si-NC 組比較，*P＜0.05

組別si-NC si-FAM83A t 值P 值FAM83A protein 0.65±0.06 0.29±0.03*16.100 0.000 Apoptosis rate（%）6.28±0.63 18.29±1.36*24.039 0.000 Bcl-2 protein 0.76±0.07 0.39±0.03*14.575 0.000 Bax protein 0.26±0.03 0.58±0.05*16.464 0.000 D0(Gy)2.577 1.501 Dq(Gy)1.817 0.515 N k 2.024 1.409 SF2 0.713 0.350 0.388 0.666 SER-1.717

表6 FAM83A 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的作用（±s，n=9）Table 6 FAM83A overexpression reverses the effect of miR-3182 overexpression on apoptosis and radiosensitivity of MHCC97H cells（±s，n=9）

表6 FAM83A 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-3182 過(guò)表達(dá)對(duì)MHCC97H 細(xì)胞的凋亡和放射敏感性的作用（±s，n=9）Table 6 FAM83A overexpression reverses the effect of miR-3182 overexpression on apoptosis and radiosensitivity of MHCC97H cells（±s，n=9）

與miR-NC 組比較，*P＜0.05；與miR-3182+pcDNA 組比較，#P＜0.05

組別miR-NC miR-3182 miR-3182+pcDNA miR-3182+pcDNA-FAM83A F 值P 值FAM83A protein 0.67±0.06 0.31±0.03*0.28±0.03 0.56±0.05#165.418 0.000 Apoptosis rate（%）8.06±0.79 20.65±2.17*22.71±2.13 12.69±1.36#144.010 0.000 Bcl-2 protein 0.74±0.07 0.35±0.03*0.33±0.03 0.64±0.06#148.777 0.000 Bax protein 0.26±0.03 0.61±0.06*0.63±0.03 0.38±0.03#185.524 0.000 D0(Gy)2.588 1.343 1.227 2.255 Dq(Gy)1.602 0.605 0.554 0.286 N k 1.857 1.569 1.571 1.135 SF2 0.683 0.330 0.290 0.453 0.386 0.745 0.815 0.443 SER-1.928-1.544

FAM83A 在肺腺癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，且高表達(dá)量與患者預(yù)后不良有關(guān)［15］。研究表明FAM83A 在乳腺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并可在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮癌基因作用［16］。FAM83A 可通過(guò)激活EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而促使乳腺癌細(xì)胞對(duì)放療或化療產(chǎn)生一定抗性［17］。相關(guān)研究表明FAM83A 可能參與食管鱗癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，并可能作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［18］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83A 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，提示FAM83A 表達(dá)水平升高可能促進(jìn)肝癌的發(fā)生。本研究進(jìn)一步研究顯示沉默F(xiàn)AM83A 可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性。提示沉默F(xiàn)AM83A 可能作為肝癌放射治療的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)FAM83A 是miR-3182 的靶基因，經(jīng)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)證明miR-3182 過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)FAM83A 可逆轉(zhuǎn)其對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡及放射敏感性的作用，進(jìn)一步證明FAM83A 是miR-3182 調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞放射敏感性的功能性靶基因。提示miR-3182 可通過(guò)下調(diào)靶基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性。

綜上所述，miR-3182 過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制靶基因FAM83A 表達(dá)，從而調(diào)控肝癌細(xì)胞放射敏感性，為miR-3182 在肝癌放射增敏作用中的機(jī)制提供理論依據(jù)。但本研究?jī)H在體外探討miR-3182 對(duì)肝癌細(xì)胞放射敏感性的作用，并未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，后續(xù)研究將進(jìn)行深入探討。