短序潤楠扦插生根特性及相關(guān)生理生化分析

徐茵 盧藝菲 袁森

摘要：以10年生短序潤楠（Machilus breviflora）1年生嫩枝為插穗，分別用清水（CK）和500 mg/L ABT生根粉溶液浸泡30 min，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，扦插于體積比為1 ∶ 1 ∶ 1的黃心土、河沙、珍珠巖混合基質(zhì)中，分析其生根特性，并動態(tài)監(jiān)測生根過程中插穗內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量、超氧化物歧化酶（SOD）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性、丙二醛（MDA）和葉綠素含量的變化。結(jié)果表明，可溶性糖和可溶性蛋白含量與插穗生根率呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），扦插過程中二者含量的高低以及變動幅度的大小直接會對扦插效果造成影響;短序潤楠扦插生根率與SOD活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），并與葉綠素（a+b）含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與IAAO活性及MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）;ABT處理提高了插穗內(nèi)SOD活性，減緩了葉綠素（a+b）的分解速率，降低IAAO活性和MDA含量，增加插穗抵御逆境能力和促根激素IAA含量，延緩插穗衰老，從而促進(jìn)生根。此外，扦插過程中各生理指標(biāo)之間相關(guān)性也十分密切，說明各生理指標(biāo)并不是單一地對插穗生根起作用，而是相互影響。

關(guān)鍵詞：短序潤楠;扦插;生根特性;生理生化;相關(guān)性

中圖分類號： S718.43 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0153-04

短序潤楠（Machilus breviflora）隸屬于樟科（Lauraceae）潤楠屬（Machilus），是華南地區(qū)的鄉(xiāng)土樹種。其春季嫩葉呈紅色，葉及樹皮含揮發(fā)油，枝葉濃密，分枝呈層狀伸展，有較高的觀賞價值和潛在的藥用價值[1]，目前在園林造景中應(yīng)用較少，具有廣闊的市場前景。

關(guān)于短序潤楠人工繁育的報道并不多見。種子繁殖是目前主要且成活率較高的繁殖途徑，用赤霉素（GA3）處理后，其發(fā)芽率高達(dá)100%[2]，但扦插育苗生根率僅為48.89%[3]。傳統(tǒng)的種子繁殖雖然成活率高，但成苗速度慢，且存在嚴(yán)重的變異分化現(xiàn)象，優(yōu)良性狀易喪失，因此為了能持續(xù)穩(wěn)定地獲得短序潤楠優(yōu)良無性繁育苗，本研究將對短序潤楠插穗內(nèi)的生理指標(biāo)進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，探究扦插生根過程中的生理學(xué)特性，以期為提高種質(zhì)資源的保存、繁殖效率以及為今后的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用插穗來源于廣東省江門市鶴山共和林業(yè)示范基地，以10年生短序潤楠做采穗母株。促根劑為購自博翔生物科技有限公司的ABT生根粉，扦插基質(zhì)為黃心土、河沙、珍珠巖混合（體積比為1 ∶ 1 ∶ 1）而成。

1.2 試驗方法

1.2.1 插穗制備 扦插前1 d在基地內(nèi)剪取生長健壯、整齊一致、無病蟲害的短序潤楠半木質(zhì)化枝條帶回試驗地，截取枝條上端8～12 cm作為插穗，下切口斜剪，當(dāng)晚將插穗基部置于清水內(nèi)浸泡。

1.2.2 扦插方法 于2017年6月8日在廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園溫室大棚內(nèi)進(jìn)行扦插。扦插前3 d用0.5%高錳酸鉀溶液對插床進(jìn)行消毒。將制備好的插穗分成2組：處理組（ABT）和對照組（CK）。處理組用500 mg/L ABT浸泡插穗基部30 min，對照組用清水處理。在插床上采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，每個區(qū)組處理組和對照組的插穗各120條。

1.2.3 插后管理 插床的遮陰率控制在75%左右（用遮陽網(wǎng)控制）。棚內(nèi)配置自動間歇噴水裝置，視情況調(diào)節(jié)噴水次數(shù)。插后每隔2周噴灑0.5%高錳酸鉀溶液消毒，并及時清除干枯霉變的插穗，保證各區(qū)組環(huán)境條件相同。

1.3 取樣及指標(biāo)測定

1.3.1 取樣方法 扦插前（0 d）采樣1次，扦插后每隔14 d取1次樣，共取樣7次，每次均在3個區(qū)組各隨機(jī)取8株，進(jìn)行3次重復(fù)測定。

1.3.2 生理指標(biāo) 可溶性糖含量采用蒽酮法測定;可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量采用李合生的方法[4]測定;吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性采用比色法[5]測定;葉綠素含量采用丙酮提取法[6]測定。

1.3.3 形態(tài)指標(biāo) 扦插后100 d統(tǒng)計插穗生根情況，包括生根率、愈傷率、鮮活率、平均根數(shù)、平均根長。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013和SPSS 19.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 短序潤楠扦插苗的生根特性

試驗觀察發(fā)現(xiàn)，ABT處理組和清水對照組愈傷組織形成期基本一致，均在扦插后的20 d左右，但前者不定根形成期比后者提前15 d左右。可將短序潤楠扦插苗不定根的形成過程劃分為3個階段：愈傷組織形成階段（0～20 d）、不定根表達(dá)階段（21～60 d）和不定根伸長階段（61～100 d）。

100 d后生根情況調(diào)查顯示，ABT處理組的插穗平均根數(shù)為2.9條/穗，平均根長為17.5 mm，愈傷率為19.7%，鮮活率為79.2%，生根率為46.8%;對照組平均根數(shù)為 1.0條/穗，平均根長為7.6 mm，愈傷率為7.0%，鮮活率為55.6%，生根率為31.1%（表1）。

對2組處理的根系指標(biāo)進(jìn)行方差分析（表2）可知，處理組和對照組插穗的愈傷率、鮮活率、生根率差異極顯著（P<0.01），2組插穗的平均根數(shù)和平均根長差異顯著（P<0.05），說明使用ABT促根劑能顯著或極顯著影響插穗的生根情況。

2.2 短序潤楠扦插生根過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

2.2.1 可溶性糖含量的變化 如圖1所示，在0～28 d，ABT處理組插穗內(nèi)可溶性糖含量持續(xù)下降，此時插穗處于愈傷組織和根原始體形成期，需消耗大量營養(yǎng)。在42～84 d，可溶性糖含量又逐漸上升，這期間大部分插穗逐漸形成不定根，可以從基質(zhì)中吸取養(yǎng)分，光合作用逐漸恢復(fù)，插穗能夠自身合成糖類。整個扦插期間，處理組插穗可溶性糖含量始終高于對照組，兩者之間可溶性糖含量差異明顯，處理組可溶性糖含量在28 d降到谷值后開始回升，比對照組要早14 d;且處理組在谷值時可溶性糖含量降幅為37.03%，低于對照組的48.56%，這說明ABT處理可以調(diào)節(jié)插穗內(nèi)可溶性糖含量的變化而促進(jìn)生根。插后84 d對照插穗可溶性糖含量出現(xiàn)降低的情況，可能是由于不定根的伸長使得體內(nèi)呼吸作用增強(qiáng)，增加了可溶性糖的消耗。

2.2.2 可溶性蛋白含量的變化 處理組與對照組插穗內(nèi)的可溶性蛋白含量在整個扦插生根過程中的變化趨勢基本均表現(xiàn)為“下降—上升—下降”的趨勢（圖2）。在扦插前期，可溶性蛋白含量持續(xù)下降，比扦插前分別下降40.9%和30.6%，蛋白質(zhì)屬于生根所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，因而在愈傷組織形成階段插穗內(nèi)的可溶性蛋白含量會大幅下降。28 d以后，插穗內(nèi)可溶性蛋白含量開始上升，在扦插后56 d，ABT處理組和清水對照組均達(dá)到峰值，且含量基本相同。56～84 d期間，可溶性蛋白含量又開始下降，處理組下降幅度明顯高于對照組，可能是因為插穗的根系和地面部分迅速生長，可溶性蛋白需求量增大，從而使插穗內(nèi)的可溶性蛋白含量出現(xiàn)下降。值得注意的是，除試驗56 d和70 d處理組和對照組插穗可溶性蛋白含量基本持平外，其余時間段經(jīng)ABT處理的均要小于同期對照，這可能是由于ABT處理活化了插穗體內(nèi)的某些蛋白酶，促進(jìn)了可溶性蛋白的分解，為插穗生根提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量，進(jìn)而促進(jìn)插穗生根。

2.3 短序潤楠扦插生根過程中相關(guān)酶活性的變化

2.3.1 SOD活性的變化 由圖3可知，0～28 d，處理組插穗內(nèi)SOD活性持續(xù)上升至峰值，在此階段插穗剛受到切割傷害，脫離母體，未能適應(yīng)新環(huán)境，導(dǎo)致SOD活性升高;扦插 28 d 后，不定根開始形成，插穗逐漸適應(yīng)逆境條件，SOD活性逐漸降低，后逐漸趨于平穩(wěn)。對照組SOD活性波動相對較大，0～42 d處于上升狀態(tài)，42 d后開始下降，后又有小幅回升，70～84 d又開始降低，可能是由于對照處理插穗內(nèi)部環(huán)境不穩(wěn)定，易受到外界環(huán)境的干擾。在0～28 d，處理組內(nèi)插穗SOD活性均高于同期對照，在扦插后28 d，處理組相對于扦插前增幅達(dá)到250.8%，明顯高于清水對照的196.8%，說明在生根前期ABT處理較大輻度地提高了插穗內(nèi)SOD活性，以抵御插穗離開母株初期所受到的逆境傷害。28 d以后，處理組SOD活性迅速下降并趨于穩(wěn)定，而對照組卻繼續(xù)上升，到達(dá)峰值52.71 μ/g，并且之后其SOD活性一直高于處理組，說明此時處理組在ABT的作用下已經(jīng)適應(yīng)逆境狀態(tài)并開始生根，而對照組由于還未適應(yīng)，從而導(dǎo)致SOD活性一直維持在較高水平。

2.3.2 IAAO活性的變化 如圖4所示，2組插穗內(nèi)IAAO活性在扦插0～14 d均明顯上升，增幅分別為58.3%和 69.5%，高活性的IAAO使得IAA含量在扦插初期明顯降低，有利于插穗不定根原基的誘導(dǎo)和表達(dá)。14～42 d，IAAO活性不斷下降， 在42 d均到達(dá)谷值， 此階段正是不定根大量生成的時期，由于IAAO活性較低，插穗中IAA不會被其氧化，高含量的IAA有利于插穗形成不定根。42～56 d，IAAO活性逐漸上升，最后基本上趨于平穩(wěn)，此時，插穗生根狀況已趨于穩(wěn)定，IAA含量降低到適宜水平。對照組與經(jīng)ABT處理的插穗內(nèi)IAAO活性變化趨勢基本一致，且整個生根過程中，對照的IAAO活性始終高于處理組，說明經(jīng)過ABT處理過的插穗可以通過調(diào)節(jié)IAAO的活性從而間接改變插穗內(nèi)激素IAA的含量，以促進(jìn)插穗不定根的生長。

2.4 短序潤楠扦插生根過程中MDA、葉綠素含量的變化

2.4.1 MDA含量的變化 本試驗結(jié)果顯示，MDA含量在短序潤楠插穗生根時期呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化（圖5）。ABT處理組MDA含量在扦插后28 d到達(dá)峰值，對照組在其后14 d出現(xiàn)峰值，且其增幅大于ABT處理組，隨后插穗內(nèi)MDA含量持續(xù)下降。在扦插后0～28 d，ABT處理組插穗內(nèi)的MDA含量一直呈上升趨勢，這個階段由于插穗剛脫離母體進(jìn)入基質(zhì)，切口還未愈合，體內(nèi)的水分和營養(yǎng)消耗遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其從外界環(huán)境中吸取的，從而導(dǎo)致MDA含量大幅上升。在28～84 d的生根過程中，插穗逐漸適應(yīng)新環(huán)境，并大量形成愈傷組織和不定根，可以從外界獲取水分和合成營養(yǎng)物質(zhì)以達(dá)到自身消耗與補(bǔ)給兩者之間的平衡，因而插穗內(nèi)的MDA含量隨之下降。在整個過程中，除了在扦插后的28 d，清水對照組的MDA含量一直大于ABT處理組，說明清水對照組受到的逆境脅迫更大，這與其生根率低于ABT處理組的結(jié)果相符，說明ABT的使用能較大程度地抑制插穗內(nèi)MDA的含量，使其組織活力維持在較高水平，加強(qiáng)其對逆境條件的耐脅迫性，促進(jìn)插穗生根。

2.4.2 葉綠素含量的變化 從圖6可以看出，ABT處理組與對照組插穗母葉中葉綠素含量的變化趨勢基本一致， 均呈現(xiàn)出“降低—升高—降低”的變化趨勢。0～28 d，葉綠素含量比扦插前有所減少，ABT處理組葉綠素的含量下降到扦插初始值的60.4%，清水對照組葉綠素的含量為扦插初始值的 50.6%，在42 d之后，插穗母葉內(nèi)的葉綠素含量開始上升，在扦插后的56 d，ABT處理組葉綠素的含量上升到峰值，清水處理組則要晚14 d才達(dá)到峰值，到達(dá)峰值后，2組插穗母葉內(nèi)的葉綠素含量又開始逐漸下降。除了在扦插后的70 d，整個試驗過程中，ABT處理組插穗母葉內(nèi)的葉綠素含量均高于清水對照組，說明植物生長調(diào)節(jié)劑處理能夠延緩短序潤楠葉片中葉綠素的降解，從而保證插穗內(nèi)有足夠的葉綠素來進(jìn)行光合作用。

2.5 扦插生根率與插穗內(nèi)各生理指標(biāo)相關(guān)性分析

植物的扦插生根受插穗內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)、氧化酶和內(nèi)源激素等生理指標(biāo)共同影響，研究扦插生根與生理指標(biāo)的關(guān)系不能僅僅以單個指標(biāo)作為評定標(biāo)準(zhǔn)，因此對生根率與插穗內(nèi)生理指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析尤為必要。

短序潤楠扦插生根過程中生根率與營養(yǎng)物質(zhì)、氧化酶活性、丙二醛和葉綠素含量之間關(guān)系密切（表3）。生根率與可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素（a+b）含量均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.964、0.919和0.945;生根率與SOD活性呈顯著正相關(guān)。

各生理指標(biāo)之間相關(guān)性也十分密切，可溶性糖與可溶性蛋白、葉綠素（a+b）含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與SOD活性極顯著正相關(guān)（P<0.01），與MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）;SOD活性與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與葉綠素（a+b）含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對扦插生根的影響

使用植物生長調(diào)節(jié)劑可有效提高難生根樹種扦插的生根率[7]。在本試驗中，使用植物生長調(diào)節(jié)劑相較于對照組可以有效縮短插穗不定根形成所需要的時間，提高愈傷率、鮮活率、生根率，且平均根數(shù)和平均根長顯著優(yōu)于清水對照組（P<0.05）。

3.2 營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化與扦插生根的關(guān)系

可溶性糖和可溶性蛋白都是植物生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，高含量的可溶性蛋白還可以增強(qiáng)植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)作用[8-10]。由相關(guān)性分析可知，插穗內(nèi)的可溶性糖和可溶性蛋白含量與生根率均呈極顯著正相關(guān)，說明營養(yǎng)物質(zhì)的含量及其在扦插過程中的變化規(guī)律與植物的生根效果有著極為密切的關(guān)系。經(jīng)過生長調(diào)節(jié)劑處理過的插穗可溶性糖含量均比對照要高，說明ABT處理有利于插穗內(nèi)可溶性糖的積累。特別值得注意得是，處理組插穗可溶性蛋白含量在大部分時間段要小于同期對照，這與雜交鵝掌楸扦插生根過程中可溶性蛋白的變化趨勢[11]基本一致，推測這是由于生長調(diào)節(jié)劑激活了插穗體內(nèi)的某些蛋白酶，促進(jìn)了可溶性蛋白的分解，以滿足扦插過程中大量的營養(yǎng)消耗[12]。

3.3 相關(guān)酶活性的變化與扦插生根的關(guān)系

氧化酶廣泛存在于絕大部分植物中，對插穗不定根的形成有顯著的指示作用[13]。由相關(guān)性分析可知，插穗生根率與SOD活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），并與IAAO活性呈顯著負(fù)相關(guān)。

SOD是保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分，能有效抑制植物在逆境中體內(nèi)自由基的形成從而適應(yīng)逆境存活下來[14]。結(jié)果表明，SOD活性在生根過程中先升后降，在扦插初期處理組SOD活性高于對照組，扦插后期則反之，說明在愈傷組織形成階段ABT較大輻度地提高了插穗內(nèi)SOD活性以抵御逆境傷害;在不定根表達(dá)和伸長階段處理組已經(jīng)適應(yīng)逆境并開始生根，而對照組SOD活性一直高于處理組，還未適應(yīng)逆境條件，不利于根系的形成。

IAAO是氧化吲哚乙酸（IAA）的專一性酶，而一定濃度的IAA是不定根發(fā)生的基礎(chǔ)，與不定根的形成有密切關(guān)系[15-16]。一般情況下，高活性的IAAO使內(nèi)源激素IAA水平降低是插穗生根誘導(dǎo)期的特點之一[17]，這與在0～14 d，2組插穗內(nèi)的IAAO活性迅速上升的試驗結(jié)果具有一致性。在整個過程中處理組中的IAAO活性始終低于對照，這是因為在不定根生長階段，高水平的IAA可以促進(jìn)不定根的發(fā)生，而IAAO可以氧化IAA，因而對照組相對于處理組而言生根要慢且生根效果較差。

3.4 丙二醛和葉綠素含量的變化與扦插生根的關(guān)系

MDA是脂膜過氧化的主要產(chǎn)物，過多的MDA將會加劇細(xì)胞膜的損傷和植物的衰老，直至死亡。通過相關(guān)性分析可知，生根率與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P

植物葉片能夠產(chǎn)生大量生根所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和激素，并且其也是葉綠素的載體[19]。通過相關(guān)性分析可知，葉綠素含量與生根率呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），說明植株光合作用的強(qiáng)弱與插穗的生根率密切相關(guān)。在扦插前期，葉綠素含量不斷下降，但是經(jīng)過生長調(diào)節(jié)劑ABT處理，插穗的葉綠素含量下降幅度要小于對照組，說明生長調(diào)節(jié)劑的使用可以減緩葉綠素的降解，提高光合作用效率，使插穗合成更多形成不定根所需的營養(yǎng)物質(zhì)。

3.5 插穗內(nèi)各生理指標(biāo)之間的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，短序潤楠扦插過程中插穗內(nèi)各生理指標(biāo)之間相關(guān)性十分密切，大多數(shù)指標(biāo)之間呈極顯著相關(guān)或顯著相關(guān)，說明在短序潤楠插穗的生根過程中，各生理指標(biāo)并不是單獨地起作用，而是相互影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]戴 磊，馮志堅，李文峰. 4種潤楠屬植物精油成分分析[J]. 福建林業(yè)科技，2013，40（1）：49-51.

[2]楊麗洲，馮志堅，周 兵，等. 不同處理方法對短序潤楠種子發(fā)芽的影響[J]. 廣東林業(yè)科技，2010，26（3）：55-58.

[3]徐 茵，袁 森，盧藝菲，等. 植物生長調(diào)節(jié)劑對短序潤楠嫩枝扦插生根的影響[J]. 浙江林業(yè)科技，2017，37（5）：69-73.

[4]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[5]張志良，瞿偉菁，李小方. 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M]. 4版.北京：高等教育出版社，2009.

[6]張憲政，陳鳳玉，王榮富. 植物生理學(xué)實驗技術(shù)[M]. 沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[7]Henrique A，Carnpinhos E N，Ono E O，et al. Effect of plant growth regulators in the rooting of Pinus cuttings[J]. Brazilian Archives of Biology and Technology，2006，49（2）：189-196.

[8]Claussen W. Proline as a measure of stress in tomato plants[J]. Plant Science，2005，168（1）：241-248.

[9]Cordeiro Y E M，Pinheiro H A，dos Santos Filho B G，et al. Physiological and morphological responses of young mahogany （Swietenia macrophylla King） plants to drought[J]. Forest Ecology and Management，2009，258（7）：1449-1455.

[10]Johari-Pireivatlou M. Effect of soil water stress on yield and proline content of four wheat lines[J]. African Journal of Biotechnology，2010，9（1）：36-40.

[11]郭 鑫. 雜交鵝掌楸硬枝扦插繁殖技術(shù)與生根機(jī)理研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2011.

[12]崔凱榮，邢更生，周功克，等. 植物激素對體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)[J]. 遺傳，2000，22（5）：349-354.

[13]Li S W，Xue L G，Xu S J，et al. Mediators，genes and signaling in adventitious rooting[J]. Botanical Review，2009，75（2）：230-247.

[14]劉文化. 三種園林植物抗寒性及扦插繁殖研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2010.

[15]曹幫華，扈紅軍，張大鵬，等. 桑樹硬枝扦插生根能力及其生根關(guān)聯(lián)酶活性的研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2008，34（1）：96-100.

[16]王新建，何 威，張秋娟，等. 豫楸1號扦插生根過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量及氧化酶類活性的變化[J]. 林業(yè)科學(xué)，2009，45（4）：156-161.

[17]張金浩. 裸花紫珠扦插繁殖技術(shù)及生根機(jī)理研究[D]. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2014.

[18]王順財. 楸樹嫩枝扦插繁殖技術(shù)及其生根機(jī)理研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2007.

[19]徐振華，王學(xué)勇，李敬川，等. 試管苗瓶外生根的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2002，18（4）：84-86，89.