徐陽(yáng)，龔榜初*，吳開云，白杰健

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311400；3.青川縣林業(yè)和園林局，四川 廣元 628100)

山桐子(IdesiapolycarpaMaxim)，又稱“油葡萄”[1]，適應(yīng)性強(qiáng)、耐旱、耐貧瘠[2-5]，單株產(chǎn)果量高，全果含油，油脂品質(zhì)高[6-7]，兼具多種保健功能[8]，是重要的木本油料物種，被譽(yù)為樹上油倉(cāng)[1]。同時(shí)山桐子樹形優(yōu)美，秋日果實(shí)深紅色，圓錐狀下垂，也是優(yōu)良的園藝觀賞樹種[5,9-10]。山桐子產(chǎn)業(yè)目前在我國(guó)大有星火燎原之勢(shì)，在全國(guó)各地正迅猛發(fā)展[10]。但山桐子童期長(zhǎng)[11]、雌雄異株、雄株多的生物學(xué)特點(diǎn)[4]，不利于山桐子產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，急需開展山桐子雌雄分化、油脂形成等方面的分子生物學(xué)研究，在此基礎(chǔ)上，建立山桐子分子輔助育種體系，以加速山桐子產(chǎn)業(yè)發(fā)展。從生物體中提取DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，山桐子葉片和其他組織中富含大量的多糖、多酚、類菇烯等多種初生與次生代謝產(chǎn)物[12]，提取高質(zhì)量的DNA比較困難[13]，屬于一種頑拗植物[14]。受限于此，山桐子相關(guān)分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢，現(xiàn)有試劑盒等提取方法所提山桐子DNA濃度較低。李娜等[15]以山桐子轉(zhuǎn)錄組為材料，開發(fā)了19條簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記，為山桐子群體遺傳學(xué)提供了較好的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，初步展開的SSR等標(biāo)記分型條帶清晰度也有待提高。據(jù)此，本文在植物DNA常用提取方法CTAB法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，以期提供一種山桐子高質(zhì)量基因組DNA提取方法，為山桐子分子生物學(xué)研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年4月初，分別采集6份山桐子種質(zhì)資源的嫩葉，每份種質(zhì)視為1份生物學(xué)重復(fù)，然后裝于凍存管立即存于液氮中，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。其中70、71、72號(hào)材料用于比較不同DNA提取方法的提取效果，70、71、72、73、74、75號(hào)共6份材料用于SSR分型與簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 山桐子DNA提取

采用SDS法[16]、CTAB法[17]、試劑盒法(參照北京天根生化科技有限公司的植物基因組提取試劑盒)、改良CTAB法提取山桐子總DNA。

其中改良CTAB法具體方法：

首先，將嫩葉放入研缽中，加入液氮充分研磨，取粉末加入2 mL離心管中，加至1/2或2/5處為佳，加入PEG漂洗液，翻轉(zhuǎn)混勻，離心收集沉淀，重復(fù)洗滌3次。PEG漂洗液[18-19]：5 mmol·L-1EDTA (pH=8.0)、50 mmol·L-1Tris-HCl (pH值8.0)、350 mmol·L-1山梨醇、10% PEG 8000、1% β-巰基乙醇(用前加入)。然后，向經(jīng)PEG漂洗液漂洗的材料中加入1 mL裂解液，65 ℃裂解45 min后離心取上清。CTAB裂解液：1.4 mol·L-1NaCl (pH值8.0)，0.1 mol·L-1Tris-HCl (pH值8.0)，20 mmol·L-1Na·EDTA，2% CTAB，2%PVP。再加入同體積的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)混合液，翻轉(zhuǎn)混勻，靜置5 min，10 000g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管中；重復(fù)該步驟2～3次，直至分離相中間層無(wú)雜質(zhì)(雜質(zhì)較少)，上清液清澈。再次將上清液轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管中，加等體積的預(yù)冷異丙醇與0.1倍體積的3 mol·L-1醋酸鈉(pH值5.2)，翻轉(zhuǎn)，置于-20 ℃放置2 h，10 000g離心20 min，棄上清液，加1 mL 70%乙醇清洗DNA沉淀，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，10 000g離心5 min，倒掉上清，通風(fēng)干燥約40 min，保證DNA充分干燥。最后加100 mL ddH2O溶解DNA，完全溶解后，進(jìn)行檢測(cè)或-20 ℃保存。

1.2.2 DNA檢測(cè)與相關(guān)分子生物學(xué)試驗(yàn)

利用Nanodrop微量分光光度計(jì)檢測(cè)各方法所提DNA的質(zhì)量和濃度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)改良CTAB法的DNA完整度。

SSR引物選用李娜等[15]的8號(hào)SSR引物(F：TCTCCATCGTACTATTTGAATCTCAT，R：ATCAAT CAAATCAATCACAAGCC))。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min，Tm 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 8 min。利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠在垂直板電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)進(jìn)行SSR分型條帶的電泳分離，250 V電壓下電泳50～60 min，電泳后用AgNO3銀染10 min，用生物電泳圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)進(jìn)行觀察、拍照。

利用內(nèi)切酶組合RsaⅠ+HaeⅢ對(duì)山桐子基因組DNA進(jìn)行酶切，酶切文庫(kù)質(zhì)檢合格后用IlluminaHiSeqTM 進(jìn)行PE125 bp測(cè)序[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各方法所提DNA濃度與質(zhì)量

山桐子葉片中含有較多的雜質(zhì)，提取DNA較為困難。利用SDS法進(jìn)行山桐子葉片DNA提取，3個(gè)樣本均能提取到一定量的DNA(32.1～80.6 ng·μL-1)，平均為57.73 ng·μL-1，濃度變異幅度較大，為42.21%(表1)；D260/D280為1.35～1.65，均小于1.8，所提DNA中含有較高蛋白質(zhì)污染；D260/D230為1.01～1.20，均小于2，所提DNA中存在嚴(yán)重的糖類與鹽污染。綜合表明，利用SDS方法提取的3個(gè)樣本DNA質(zhì)量均較低，其中72號(hào)樣本濃度僅為32.1 ng·μL-1，D260/D280為1.35，D260/D230為1.20，嚴(yán)重不合格，無(wú)法用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。

表1 不同DNA提取方法所得山桐子DNA質(zhì)量比較

利用試劑盒法提取的山桐子DNA，相對(duì)于SDS法，純度有較大提升，D260/D280為1.77～1.81，所提DNA中少量蛋白質(zhì)污染，D260/D230為1.46～1.79，糖類與鹽污染得到一定的控制。CTAB法提取的山桐子DNA濃度顯著高于試劑盒法和SDS法，平均濃度達(dá)144.33 ng·μL-1，其中70號(hào)樣本DNA濃度可達(dá)223.2 ng·μL-1。但CTAB法所提DNA樣本間濃度變異幅度較大，達(dá)49.84%，不利于后續(xù)分子生物學(xué)對(duì)樣本濃度的標(biāo)準(zhǔn)化要求；D260/D280比值與試劑盒法相當(dāng)，為1.62～1.83，DNA樣本中可能存在蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)污染，D260/D230低于試劑盒法，高于SDS法，表明所提DNA中也存在較高的糖類與鹽污染。

利用改良的CTAB法提取的3個(gè)山桐子樣本DNA濃度可高達(dá)417.5～470.5 ng·μL-1，平均為438.93 ng·μL-1，為試劑盒法的8.5倍。D260/D280為1.94～1.97，均高于1.8，D260/D230為2.10～2.17，均高于2，表明各樣本DNA濃度高、純度高，蛋白質(zhì)、糖類與鹽污染得到極好的控制。電泳結(jié)果(圖1)顯示，改良CTAB法提取的DNA條帶稍有拖尾，整齊明亮，說(shuō)明DNA得率較高且完整。同時(shí)樣本濃度與純度各指標(biāo)變異幅度最少，能夠滿足分子生物學(xué)對(duì)樣本標(biāo)準(zhǔn)化的要求。

M，DNA maker；70、71、72分別為70、71、72號(hào)樣本DNA。圖1 改良CTAB法所提山桐子DNA電泳圖譜

2.2 利用改良CTAB法提山桐子DNA的SSR標(biāo)記結(jié)果

SSR標(biāo)記具有共顯性、高度重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，在分子群體遺傳進(jìn)化、輔助育種等方面應(yīng)用廣泛。本文利用改良的CTAB法提取6個(gè)山桐子樣本DNA，采用李娜等[15]的8號(hào)引物進(jìn)行SSR標(biāo)記分型。圖2顯示，6個(gè)樣本的SSR標(biāo)記條帶均比較清晰，表明改良的CTAB法所提取的DNA可以滿足SSR標(biāo)記相關(guān)分子試驗(yàn)所需。

M，DNA maker；左側(cè)為maker各條帶大??；70～75分別為70、71、72、73、74、75號(hào)山桐子樣本。圖2 利用改良CTAB法所提6個(gè)山桐子樣本的SSR標(biāo)記聚丙烯凝膠電泳結(jié)果

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)技術(shù)、簡(jiǎn)化基因組測(cè)序等技術(shù)可提供較高通量的標(biāo)記數(shù)，在群體分析中具有較高的效率，但此類研究往往依賴于酶切效果，而基因組DNA樣品純度較低等因素可能影響限制性內(nèi)切酶的活性，導(dǎo)致部分酶切位點(diǎn)未被酶切開，因此對(duì)DNA要求較高。酶切效率是評(píng)價(jià)簡(jiǎn)化基因組實(shí)驗(yàn)是否成功的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。本文采用RsaⅠ+HaeⅢ組合對(duì)改良CTAB法所提的山桐子DNA進(jìn)行酶切，進(jìn)行酶切文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)估，并利用IlluminaHiSeqTM 進(jìn)行PE125 bp測(cè)序。本試驗(yàn)的酶切效率為90.32%，表明酶切效率正常。同時(shí)，測(cè)序reads插入片段長(zhǎng)度主要為364～444 bp(圖3)，表明所提DNA可以滿足基因組測(cè)序等試驗(yàn)要求。

圖3 Reads插入片段分布

3 小結(jié)與討論

常用的提取植物核酸的方法如SDS法、CTAB法等只適用于部分植物，用于山桐子DNA提取存在較大局限性。SDS法操作簡(jiǎn)單、溫和，如本文數(shù)據(jù)顯示，通過該方法可提取到一定量的山桐子DNA，但所得到的產(chǎn)物質(zhì)量與純度不高，糖類、蛋白質(zhì)、鹽類雜質(zhì)較多。通過CTAB法，可提取純度較高的山桐子DNA，且對(duì)蛋白質(zhì)污染有較好的控制，DNA純度有所提高。但酚類污染仍較嚴(yán)重，且山桐子樣本DNA濃度與純度變異幅度較大，試驗(yàn)中多次抽提試驗(yàn)周期較長(zhǎng)。隨著提取技術(shù)的發(fā)展，基于高效核酸吸附柱的核酸提取試劑盒出現(xiàn)，大大提高了核酸提取效率[15]。但本文數(shù)據(jù)顯示，盡管試劑盒法提取的山桐子DNA純度得以提升，但提升幅度較小，各山桐子樣本DNA濃度仍較低。

Kobayashi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PEG洗脫液可有效洗脫植物代謝產(chǎn)物，在鵝掌楸高質(zhì)量DNA提取中應(yīng)用效果較好。在此基礎(chǔ)上，本文以CTAB法為基礎(chǔ)，裂解前進(jìn)行PEG洗脫，并優(yōu)化與簡(jiǎn)化后續(xù)CTAB法操作步驟，形成適宜山桐子高質(zhì)量DNA提取的改良CTAB法。通過本文方法提取的山桐子DNA，DNA濃度可高達(dá)417.5～470.5 ng·μL-1，平均為438.93 ng·μL-1，為試劑盒法的8.5倍，所提各樣本DNA蛋白質(zhì)、糖類與鹽污染得到極好的控制，DNA得率較高且完整，同時(shí)各樣本濃度與純度各指標(biāo)變異幅度最少，可以滿足分子生物學(xué)對(duì)樣本DNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的要求。采用本文改良CTAB法提取的山桐子DNA，可以滿足SSR標(biāo)記分型、簡(jiǎn)化基因組測(cè)序等相關(guān)分子試驗(yàn)所需，為山桐子分子生物學(xué)的開展提供了基礎(chǔ)。