金順順 姚 康 印遇龍 康寶聚 黎育穎 王 鵬

(1. 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125；2. 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙 410125；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, AKG)是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵中間體[1]，也是谷氨酰胺脫氨(谷氨酰胺水解)的產(chǎn)物。其在臨床和動物營養(yǎng)方面發(fā)揮著有益的作用，能改善動物生長性能、調(diào)節(jié)能量代謝、提高動物免疫力、促進骨骼肌蛋白質(zhì)合成等[2]。體外研究[3]發(fā)現(xiàn)，AKG能通過促進豬腸道上皮細胞蛋白質(zhì)的合成和降低蛋白質(zhì)的分解來促進豬腸道上皮細胞蛋白質(zhì)的合成。亮氨酸(leucine，LEU)是必須氨基酸，也是支鏈氨基酸之一[4]，還能在動物體內(nèi)影響脂質(zhì)代謝，主要是通過抑制脂肪的合成[5-7]以及促進脂肪的分解[8-10]來發(fā)揮作用。據(jù)報道[11]，亮氨酸能調(diào)節(jié)哺乳動物骨骼肌蛋白質(zhì)的代謝，從而達到促進動物生長的作用。肖定福等[12]研究表明，在動物體內(nèi)谷氨酰胺向AKG轉(zhuǎn)化的過程中，首先谷氨酰胺由磷酸鹽活化谷氨酰胺酶反應(yīng)產(chǎn)生谷氨酸，再通過線粒體中谷氨酸脫氫酶的作用或通過轉(zhuǎn)胺作用在細胞溶膠或線粒體中產(chǎn)生AKG，這個代謝過程中，亮氨酸是谷氨酸脫氫酶的激活劑，因此，在生物體的代謝過程中亮氨酸和AKG存在協(xié)同作用。這預(yù)示著亮氨酸和AKG可能對機體內(nèi)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成代謝有協(xié)同作用。而加強骨骼肌蛋白質(zhì)的合成是解決肌肉萎縮的重要一步[13]。骨骼肌蛋白的合成已被證明受到不同營養(yǎng)和生理因素的影響，如氨基酸[14]、葡萄糖[15]、運動[16]、胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor -1，IGF-I)和胰島素[17]等。綜上所述，亮氨酸和AKG兩者都對小鼠的生長性能和骨骼肌產(chǎn)生影響，且兩者在生物體內(nèi)代謝過程中存在協(xié)同作用，然而聯(lián)合使用AKG 和亮氨酸對健康小鼠生長以及骨骼肌的影響，目前未見報道。因此試驗探討了亮氨酸和AKG聯(lián)合使用對小鼠的體重，血清生化指標、器官指數(shù)和骨骼肌纖維的影響，以期為運用亮氨酸和AKG改善蛋白質(zhì)降解引起的肌肉萎縮提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

AKG：有效成分含量為99.5%，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司；

亮氨酸：有效成分含量為98%，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

冷凍型大容量離心機：4K15型，德國Sigma公司；

生化分析儀：cobas c311型，瑞士羅氏公司；

電子天平：GL124-1SCN型，深圳市盛美儀器有限公司。

1.1.3 試驗動物與飼糧

試驗動物：4周齡的雄性C57BL/6小鼠，體重(12.76±0.67) g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；

小鼠專用飼料：主要營養(yǎng)水為粗蛋白質(zhì)(CP)20.50%、粗脂肪(EE)4.62%、鈣(Ca)1.23%、磷(P)0.91%、賴氨酸(Lys)1.30%、蛋氨酸+胱氨酸(Met+Cys)0.68%、亮氨酸(Leu)1.40%，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

將40只C57BL/6小鼠于21～25 ℃、相對濕度60%的飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組10只。對照組：水瓶中加入正常的飲水；Ⅰ組：水瓶中加入1.0%的AKG(每千克水中加入10 g AKG，并調(diào)節(jié)pH值至7.4)；Ⅱ組：水瓶中加入1.8%的亮氨酸(每千克水中加入18 g亮氨酸)；Ⅲ組：水瓶中加入1.8%的亮氨酸和1.0%的AKG(每千克水中加入18 g亮氨酸和10 g AKG，并調(diào)節(jié)pH值至7.4)。試驗期35 d。

1.3 樣品的采集

試驗結(jié)束后，各組小鼠禁食(自由飲水)12 h，對所有小鼠進行眼球摘除采血，將采集的血液置于離心管中，低溫(4 ℃)下靜置30 min，離心10 min (4 ℃、3 000 r/min)，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采血后，對小鼠采用脊椎脫臼法處死，迅速取出心臟和肝臟。將心臟和肝臟用預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分后稱重；取腹部脂肪、肩周脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、趾伸長肌、腓腸肌稱重并留用。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 體重 在正式試驗開始和結(jié)束時利用電子天平對每只小鼠分別進行稱重，分析體重變化。

1.4.2 器官指數(shù)的測定 在試驗結(jié)束后屠宰小鼠，取心臟、肝臟、腹部脂肪、腎周脂、皮下脂肪、腓腸肌、趾長伸肌稱重并記錄。心臟、肝臟、腹部脂肪、腎周脂、皮下脂肪指數(shù)的計算參照丁曉東等[18]的方法，腓腸肌和趾伸長肌指數(shù)的計算參照石鶴坤等[19]的方法。

1.4.3 血清生化指標的測定 采用全自動血液生化分析儀對總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、血氨(BA)進行分析。每組10個重復(fù)。

1.4.4 腓腸肌橫截面積的測定 腓腸肌橫截面積的測定于腓腸肌統(tǒng)一位置切取組織塊(0.6 cm×0.6 cm×0.6 cm)浸入10%中性福爾馬林溶液中固定，經(jīng)脫水、透蠟、包埋，切片后，進行HE染色，光學(xué)顯微鏡進行觀察，每個切面選取10個圖片，然后用Image-Pro plus 6.0軟件分析肌纖維的橫截面積(Cross Section Area, CSA)。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

試驗結(jié)果用(平均值±標準誤差)表示，采用SPSS 20.0進行單因素方差分析，模型顯著時采用Duncan氏多重比較檢驗。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AKG和亮氨酸對小鼠體重變化的影響

由表1可知，在連續(xù)飼喂35 d中，各組小鼠均未出現(xiàn)任何異常反應(yīng)。在試驗結(jié)束第1周，3個處理對小鼠的體重均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)；在第14天和第21天時，Ⅰ組小鼠體重顯著高于Ⅲ組(P<0.05)，其他各組之間無顯著性差異(P>0.05)；試驗第28天時，Ⅲ組小鼠體重顯著低于Ⅰ和Ⅱ組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差異(P>0.05)；試驗第35天時，Ⅲ組小鼠的體重顯著低于Ⅰ組、Ⅱ組和對照組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差異(P>0.05)。小鼠飲水中添加亮氨酸和AKG較其他3組體重有降低的趨勢。原因可能是動物機體內(nèi)由磷酸鹽活化谷氨酰胺酶反應(yīng)所產(chǎn)生的谷氨酸能通過線粒體中谷氨酸脫氫酶的作用或通過轉(zhuǎn)胺作用在細胞溶膠或線粒體中產(chǎn)生AKG，在這個代謝過程中，亮氨酸是谷氨酸脫氫酶的激活劑，因此可以強化AKG的作用。另外AKG也可參與脂質(zhì)代謝和肉堿的形成[20]。而肉堿是一種作為脂肪酸載體進入細胞線粒體的分子，在線粒體中可以進行適當?shù)闹痉纸獯x從而起到降低體重的作用。

2.2 AKG和亮氨酸對小鼠血清生化指標的影響

由表2可見，與對照組相比，Ⅲ組血清TP、ALB和ALP含量顯著升高(P<0.05)，BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組血清BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)，Ⅰ組血清BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組血清ALB含量顯著提高(P<0.05)，Ⅱ組血清UA含量顯著增加(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組血清ALB含量顯著升高(P<0.05)，BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)。各組間其他血清生化指標均無顯著性差異(P>0.05)。血清中TP的含量可直接反映蛋白質(zhì)的吸收情況以及機體體液免疫的健康狀況，從而間接反映機體對外界不良因素的抵抗能力，血清TP含量高說明蛋白質(zhì)合成作用、氮沉積及機體對外界不良因素的抵抗能力增強[21]。聯(lián)合運用亮氨酸和AKG能顯著升高血清ALB和TP的含量，表明兩者可提高機體的體液免疫能力及肝臟對蛋白質(zhì)的合成作用。ALP是遺傳標記的同工酶，其活性的高低能反映骨組織生長、鈣磷代謝、脂肪代謝狀況[22]。聯(lián)合運用兩者能顯著提高血清ALP的活性，可能與AKG可顯著提高粗蛋白、鈣和磷的表觀消化率有關(guān)[23]。同時聯(lián)合運用兩者有利于氨基酸平衡，促進蛋白質(zhì)代謝以及降低血清中尿素和UA的含量[24]。

表1 試驗期間各組小鼠體重的變化?Table 1 Change of body weight of mice from different groups during the whole experimental period (n=10) g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

? 同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 AKG和亮氨酸對小鼠器官指數(shù)的影響

由表3可知，Ⅲ組心臟指數(shù)顯著高于對照組、Ⅰ組和Ⅱ組(P<0.05)。其他各組間器官指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。聯(lián)合運用亮氨酸和AKG能顯著提高心臟指數(shù)，表明兩者聯(lián)合運用能減少外界不良因素對心臟的損傷，促進心臟的生長[25]。

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 AKG和亮氨酸對小鼠脂肪指數(shù)和肌肉指數(shù)的影響

由表4可見，與對照組相比，Ⅱ組和Ⅲ組腹部脂肪指數(shù)顯著降低(P<0.05)，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組腓腸肌指數(shù)顯著增加(P<0.05)，Ⅲ組趾長伸肌指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組腓腸肌指數(shù)和趾長伸肌指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組腓腸肌指數(shù)和趾長伸肌指數(shù)顯著增加(P<0.05)。其他各組間脂肪指數(shù)和肌肉指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。聯(lián)合運用亮氨酸和AKG能顯著提高腓腸肌指數(shù)和趾伸長肌指數(shù)，說明1.0% AKG 和1.8%亮氨酸聯(lián)合添加在促進骨骼肌生長方面有協(xié)同作用。

2.5 AKG和亮氨酸對小鼠腓腸肌橫截面積的影響

由表5可知，與對照組相比，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的小鼠腓腸肌橫截面積顯著增加(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組的小鼠腓腸肌橫截面積顯著增加(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組的小鼠腓腸肌橫截面積顯著增加(P<0.05)。其他各組間小鼠腓腸肌橫截面積均無顯著性差異(P>0.05)。具體的原因可能是：① AKG能促進骨骼肌蛋白質(zhì)的合成和抑制骨骼肌蛋白質(zhì)的降解，從而使得肌纖維的橫截面積增大；② 亮氨酸也能促進骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，從而使得肌纖維的橫截面積增大；③ 在谷氨酰胺、谷氨酸和AKG的相互轉(zhuǎn)化過程中，亮氨酸促進谷氨酸向AKG的轉(zhuǎn)換，而兩者之間存在的協(xié)同作用加速了肌纖維蛋白質(zhì)的合成，從而使得肌纖維的橫截面積增加。

表4 AKG和亮氨酸對小鼠脂肪指數(shù)和肌肉指數(shù)的影響?Table 4 Effect of AKG and leucine on fat index and muscle index of mice (n=10) %

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表5AKG和亮氨酸對小鼠腓腸肌橫截面積的影響?

Table5EffectofAKGandleucineoncrosssectionalareaofgastrocnemiusmuscleofmice(n=10)

組別腓腸肌橫截面積/μm2對照組1 873.08±124.16c試驗組Ⅰ2 289.84±101.02b試驗組Ⅱ2 151.39±78.89b試驗組Ⅲ2 751.94±81.13a

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

試驗通過對C57BL/6 雄性小鼠研究，比較亮氨酸和AKG對小鼠體重和骨骼肌發(fā)育的影響，結(jié)果表明亮氨酸和AKG聯(lián)合運用具有抑制小鼠體重增加，促進心臟生長，加強器官對脂肪的利用和增加腓腸肌纖維的重量和橫截面積的作用。研究為提高肌纖維橫截面積預(yù)防肌肉萎縮提供了新的思路，然而其調(diào)節(jié)骨骼肌代謝的作用機理還有待進一步研究。