呂丹丹，張媛雅，葛海濤，黃夏禾，汪迎春

大規(guī)模膜蛋白質(zhì)組鑒定技術(shù)進(jìn)展

呂丹丹，張媛雅，葛海濤，黃夏禾，汪迎春

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，分子系統(tǒng)生物學(xué)中心，北京 100101

生物膜是一類重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，含有大量的跨膜蛋白和非跨膜蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)胞與外界的物質(zhì)和信息交換以及行使細(xì)胞內(nèi)的多種功能。鑒定并分析膜蛋白在生物膜上的表達(dá)是研究其功能必不可少的步驟。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以在單次實(shí)驗(yàn)中一次性從全細(xì)胞裂解物中鑒定多達(dá)上萬個(gè)蛋白質(zhì)，從而為分析這些蛋白的表達(dá)提供了直接的證據(jù)。但由于膜蛋白具有較強(qiáng)的疏水性，從而導(dǎo)致對膜蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定相對困難，這也使得對膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展相對比較緩慢。隨著鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)(shot-gun proteomics)及濾膜輔助的樣品制備(filter aided sample preparation)等為代表的現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，膜蛋白的鑒定水平及覆蓋率也隨之大幅提高。本文主要綜述了過去20余年在膜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)上的重要進(jìn)展，并以光合作用模式藍(lán)藻集胞藻(sp. PCC6803)的膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究為例，闡述了技術(shù)的進(jìn)步如何提高膜蛋白鑒定的覆蓋度，以期為其他物種膜蛋白質(zhì)組全覆蓋度的鑒定提供相應(yīng)理論借鑒。

膜蛋白；蛋白質(zhì)組學(xué)；疏水性；藍(lán)藻

生物膜主要由磷脂雙分子層和鑲嵌或附著在其上的蛋白質(zhì)構(gòu)成。動物、植物和微生物通常都有一種或多種膜系統(tǒng)。細(xì)胞質(zhì)膜(質(zhì)膜)是最為常見的一種膜系統(tǒng)，負(fù)責(zé)把細(xì)胞質(zhì)和其他內(nèi)溶物與周圍環(huán)境分隔開，并負(fù)責(zé)與環(huán)境交換物質(zhì)和感受信號。除質(zhì)膜外，細(xì)胞內(nèi)還有多種內(nèi)膜系統(tǒng)，如高爾基體、線粒體、葉綠體等都有一層或多層膜狀結(jié)構(gòu)。葉綠體的膜系統(tǒng)分為被膜和類囊體膜，由外膜和內(nèi)膜構(gòu)成的被膜主要的作用是起到將葉綠體的內(nèi)溶物與細(xì)胞質(zhì)分開，并負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)與葉綠體之間的物質(zhì)和信息交換。類囊體膜則是光合作用的主要場所，光合電子傳遞鏈中的所有蛋白質(zhì)復(fù)合體都定位于類囊體膜上，包括光合系統(tǒng)Ⅰ、光合系統(tǒng)Ⅱ、細(xì)胞色素Cytbf復(fù)合物以及ATP合酶復(fù)合物(圖1)。

膜蛋白質(zhì)是生物膜的重要組成成分，在物質(zhì)運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。據(jù)預(yù)測，一個(gè)物種的基因組所編碼的蛋白有30%是膜蛋白[1,2]。由于膜蛋白具有一些特殊的氨基酸組成并由此產(chǎn)生強(qiáng)疏水性，從而導(dǎo)致對膜蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定要遠(yuǎn)遠(yuǎn)難于可溶性蛋白，這也使得對膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展相對較為緩慢。本文以一種光合作用模式藍(lán)藻集胞藻(sp. PCC6803)為例，介紹了膜蛋白的生物化學(xué)特征以及膜蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)，綜述了過去20余年膜蛋白質(zhì)組的研究進(jìn)展，著重闡明了技術(shù)的進(jìn)步如何在提高膜蛋白質(zhì)的鑒定效率及覆蓋度。

1 膜蛋白生物化學(xué)特征及分離純化方法

1.1 膜蛋白的生物化學(xué)特征

由于膜蛋白質(zhì)在功能上的重要性以及在解析膜蛋白質(zhì)組上存在的巨大技術(shù)挑戰(zhàn)，從蛋白質(zhì)組學(xué)學(xué)科出現(xiàn)開始，膜蛋白質(zhì)的分離和鑒定就成為了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)焦點(diǎn)方向。膜蛋白質(zhì)的研究之所以具有巨大的技術(shù)上的挑戰(zhàn)性，最主要的原因是由于其高于一般蛋白質(zhì)的疏水性。整合膜蛋白質(zhì)(integral membrane protein, IMP)一般都通過一個(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TMD)而整合在膜上，跨膜結(jié)構(gòu)域大小一般在20個(gè)氨基酸殘基左右，主要由疏水氨基酸組成，可以和膜的重要組成成分(磷脂雙分子層)發(fā)生疏水相互作用，從而將蛋白質(zhì)固定到膜上[3,4]。除了IMP，生物膜通常還含有大量的周邊膜蛋白 (peripheral membrane protein, PMP)。PMP不含跨膜結(jié)構(gòu)域，與膜的結(jié)合主要是通過蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)與脂類的相互作用(圖1)。有些蛋白質(zhì)還會發(fā)生翻譯后修飾，并通過修飾集團(tuán)與膜的相互作用而結(jié)合到膜上。常見的化學(xué)修飾主要有磷酸肌醇修飾、粽櫚?；⒍罐Ⅴ；?。蛋白質(zhì)與膜的相互作用一般可以分為共價(jià)和非共價(jià)兩種類型。共價(jià)相互作用非常穩(wěn)定，磷酸肌醇修飾的蛋白與膜的結(jié)合可以看作是一種共價(jià)的結(jié)合，結(jié)合非常穩(wěn)定，很難從膜上被分離[5,6]。而很多蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)之間的相互作用通常是非共價(jià)的，包括氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用以及范德華力等。這些非共價(jià)的相互作用可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)形成復(fù)合體。通常很多PMP通過和一個(gè)或多個(gè)IMP共同形成復(fù)合體而結(jié)合在膜上。PMP與膜的結(jié)合一般是可逆的，其結(jié)合穩(wěn)定度通常隨細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的變化而變化。對于通過生物化學(xué)方法分離的懸浮在緩沖液中的生物膜，如果改變緩沖液鹽離子濃度或pH值，都有可能有效地將PMP從生物膜上解離下來。

圖1 藍(lán)藻類囊體膜結(jié)構(gòu)示意圖

類囊體膜是光合作用的主要場所，與此相關(guān)的一些主要的蛋白復(fù)合物如光合系統(tǒng)Ⅰ(Photosystem Ⅰ)、光合系統(tǒng)Ⅱ(Photosystem Ⅱ)、ATP合酶(ATP synthase)以及與CO2固定相關(guān)的NDH-13和NDH-14復(fù)合體均分布在類囊體膜上。這些膜蛋白質(zhì)復(fù)合物既包含IMP, 又包含PMP。

疏水性是膜蛋白的一個(gè)重要生物化學(xué)特征。評價(jià)疏水性的關(guān)鍵指標(biāo)有兩個(gè)：第一個(gè)指標(biāo)是分析其是否含有跨膜結(jié)構(gòu)域及其數(shù)目。所有的IMP都有一個(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，通常一個(gè)膜蛋白如果所含的跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目越多，表明其疏水性越強(qiáng)，但有時(shí)也例外，因?yàn)槟さ鞍渍w疏水性還會受到連接跨膜結(jié)構(gòu)域的膜外區(qū)域大小的影響。一個(gè)蛋白是否含有跨膜結(jié)構(gòu)域及其數(shù)目的多少可以通過生物信息軟件進(jìn)行預(yù)測，常用的軟件是基于隱馬爾可夫模型的TMHMM，其預(yù)測IMP的準(zhǔn)確度可以超過97%[7]。需要指出的是TMHMM目前有兩個(gè)版本，即TMHMM1和TMHMM2。本課題組在具體的研究中發(fā)現(xiàn)，TMHMM2 在預(yù)測某些蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域時(shí)反而不如TMHMM1準(zhǔn)確。第二個(gè)指標(biāo)就是蛋白質(zhì)的GRAVY值。GRAVY值是從總體上評價(jià)一個(gè)蛋白質(zhì)疏水性高低的參數(shù)。一般來說一個(gè)蛋白質(zhì)的GRAVY值越高，表明其疏水性越強(qiáng)[8]。一個(gè)蛋白質(zhì)的GRAVY值取決于其氨基酸序列的構(gòu)成。每個(gè)不同的氨基酸殘基都有一個(gè)特定的疏水值(hydropathy score)，疏水性最高的為異亮氨酸(4.5)，其次為纈氨酸(4.2)，而親水性最高的是精氨酸(?4.5) ，其次為賴氨酸(?3.9)。一般來說，側(cè)鏈為長脂鏈的氨基酸其疏水性越高，而側(cè)鏈為極性的尤其是帶電荷的氨基酸，其親水性越強(qiáng)。GRAVY值就是該蛋白質(zhì)所有氨基酸疏水值的平均值，即所有氨基酸疏水值的加和除以該蛋白質(zhì)的長度(所含氨基酸的數(shù)量)。

1.2 膜及膜蛋白的分離純化

盡管一個(gè)基因組所編碼的蛋白有30%被預(yù)測為膜蛋白，但總體上由于膜蛋白豐度較低，且不易在水溶液中溶解，因此在進(jìn)行膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析時(shí)，經(jīng)常需要先對膜組分進(jìn)行分離純化，以富集低豐度的膜蛋白。在一個(gè)全細(xì)胞裂解物中，由于膜組分的密度不同，在密度梯度離心中具有不同于可溶性組分的沉降系數(shù)，借此可以與可溶性組分分離開。對于各種細(xì)胞器如線粒體、葉綠體來說，一般都是先分離該細(xì)胞器，然后再分離其各個(gè)膜組分。以葉綠體為例，葉綠體含有3個(gè)膜組分：組成葉綠體包被的外膜、內(nèi)膜和類囊體膜。葉綠體的包被可以利用一種叫做Yeda Press的裝置剝離下來，并通過密度梯度離心分離外膜和內(nèi)膜[9~15]。被剝離包被的葉綠體可以被直接裂解，并通過離心獲得類囊體膜。

純化的膜組分既含有IMP, 又含有PMP。由于IMP難溶于水溶液且一般豐度較低，因此難以被現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定。為提高IPM蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的覆蓋度，通常需要將水溶性較高的PMP與IPM分離以便富集IPM。常見的分離方法有如下幾種：(1)高濃度鹽溶液抽提法，即利用高濃度的鹽溶液（如1 mol/L NaCl）來解離與膜結(jié)合的PMP[16]。這種方法的原理是利用鹽離子所帶的電荷，破壞介導(dǎo)PMP與膜相結(jié)合的靜電相互作用，從而將PMP從膜上洗脫到溶液中。經(jīng)過1 mol/L NaCl抽提后的膜所含的PMP顯著減少，而IMP會因此得到顯著的富集；(2)高pH抽提法。細(xì)胞裂解后，膜組分由于磷脂雙分子層的疏水性，在水溶液中通常是以囊泡的形式存在。這些囊泡在形成過程中會把一部分可溶性蛋白包含進(jìn)去，這樣在分離純化的膜組分中就會造成可溶性蛋白的污染。用100 mmol/L Na2CO3溶液(pH11.0)抽提純化的膜組分，可以將這些囊泡狀的膜組分剪切開，形成片狀，釋放其中所包含的可溶性的污染蛋白[10]。同時(shí)，由于高pH值可以改變蛋白質(zhì)在水溶液中的電離效率，從而改變蛋白質(zhì)所帶的電荷，影響蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，并因此將PMP從膜上解離下來，達(dá)到分離PMP與IMP的效果；(3)離液劑(chaotropes)抽提法。常用的離液劑是高濃度(8 mol/L)的尿素(urea)。尿素是一種強(qiáng)極性的試劑，很容易與水及水溶液中的蛋白質(zhì)形成氫鍵，從而破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用，把PMP從膜上解離出來。除尿素外，硫脲(thiourea)是一種更強(qiáng)的離液劑，也經(jīng)常在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中用來溶解蛋白質(zhì)[17,18]；(4)二相分離法(two phase partition)。含有去垢劑Triton X-114在0℃時(shí)會形成均一的水溶液，當(dāng)溫度升高到20℃時(shí)，溶液就會分層，上層是水相，下層是去垢劑相。這時(shí)溶解在Triton X-114溶液中的膜蛋白也會隨著分層，水相中主要包含可溶性蛋白，如容易從膜上解離的PMP，而去垢劑相中主要包含和膜結(jié)合緊密的PMP以及IMP[19]。需要注意的是，這些方法并不一定是單獨(dú)使用，在實(shí)際研究中通常會把多種方法結(jié)合起來使用，以達(dá)到提高分離效率的目的。

2 膜蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)

2.1 雙向電泳與膜蛋白質(zhì)組學(xué)

雙向電泳(2D electrophoresis, 2DE)是早期蛋白質(zhì)組學(xué)研究最重要的技術(shù)之一，可以和MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合(2DE-MS)，進(jìn)行大規(guī)?？焖俚牡鞍踪|(zhì)鑒定[17,18]。雙向電泳本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)分離技術(shù)，可以把高復(fù)雜度的樣品，如含有數(shù)萬個(gè)蛋白的全細(xì)胞裂解物中的蛋白盡可能地分開[20]。一般來說，雙向電泳的第一向?yàn)榈入娋劢?isoelectric focusing, IEF)，即根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，在不同的酸堿環(huán)境下會發(fā)生不同程度的電離，因此蛋白質(zhì)所處環(huán)境的pH值不同，其電離程度以及所帶的凈電荷也不同。在一個(gè)特定的pH值下，該蛋白質(zhì)發(fā)生電離使得其所帶的凈電荷為0，該pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。雖然所有的蛋白質(zhì)都有一個(gè)特定的等電點(diǎn)，但一旦該蛋白質(zhì)發(fā)生翻譯后修飾，其等電點(diǎn)則也有可能改變, 因此在2DE中很多蛋白質(zhì)會在電泳膠上形成分子量相等的多個(gè)點(diǎn)[17,18]。等電聚焦的本質(zhì)就是讓蛋白質(zhì)在高電壓的作用下在一個(gè)pH梯度中進(jìn)行遷移，當(dāng)?shù)鞍走w移到pH梯度中與其等電點(diǎn)相等的位置時(shí)，由于其所帶的凈電荷為0，不再受到電場力的作用，從而停留在該位置。一般商業(yè)化的IEF膠條都是帶有固定化的pH梯度，可以最大限度地提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。對于多種蛋白質(zhì)來說，由于其等電點(diǎn)有所不同，因此其停留的位置也有所不同。等電聚焦就是通過這個(gè)原理對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的。需要指出的是，等電聚焦要想達(dá)到很好的分離分辨率，必須要排除環(huán)境中的帶電離子對蛋白質(zhì)遷移的影響。因此，等電聚焦的緩沖液不能含有鹽離子，最理想的遷移環(huán)境就是電場中所有的電荷都來源于蛋白質(zhì)自身。雙向電泳的第二向是SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)。SDS-PAGE主要是根據(jù)分子量的大小對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。等電聚焦完成以后，可以把含有蛋白質(zhì)的IEF膠條水平地轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE凝膠頂端并用瓊脂糖凝膠固定住。在電場力作用下，蛋白質(zhì)從IEF膠條中垂直進(jìn)入到SDS-PAGE膠中，進(jìn)行第二向分離。

2DE的分辨率和IEF膠條以及SDS-PAGE的尺寸呈正相關(guān)。尺寸越大，分辨率越高，同時(shí)蛋白質(zhì)樣品的上樣量也越大，可以更好地鑒定低豐度蛋白。雖然大尺寸的雙向電泳(如24 cm IEF膠條)理論上可以將多達(dá)1000個(gè)以上的蛋白高分辨地呈現(xiàn)在一塊凝膠上，但一般而言2DE能分離的蛋白通常都是親水性的可溶性蛋白，而高疏水性的尤其是含有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，絕大部分都不能被雙向電泳所分離。這是因?yàn)槟さ鞍椎娜芙馔ǔＰ枰腥ス竸┑妮o助。去垢劑通常都有一個(gè)非極性的基團(tuán)和一個(gè)極性的基團(tuán)，非極性的基團(tuán)和蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，而極性基團(tuán)和溶液中的水發(fā)生相互作用，從而幫助蛋白質(zhì)溶解。不同的去垢劑輔助蛋白質(zhì)溶解的能力是不同的，目前已知的助溶能力最強(qiáng)的去垢劑是SDS，但SDS帶有負(fù)電荷，蛋白質(zhì)一旦結(jié)合大量的SDS后，SDS本身的負(fù)電荷就會干擾等電聚焦，因此SDS與蛋白質(zhì)的等電聚焦是不兼容的。通常與等電聚焦兼容的去垢劑都是非離子性的(如Triton X-100和NP-40)，或者是雙性的 (zwitterionic)，即同時(shí)帶一個(gè)正電荷和一個(gè)負(fù)電荷，總電荷為0，如常用的CHAPS和ASB14都是雙性去垢劑。遺憾的是，這些去垢劑的助溶能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SDS，因此絕大多數(shù)高疏水性的膜蛋白都無法被雙向電泳分離[21~23]。

2.2 基于LC-MS的膜蛋白質(zhì)組學(xué)

基于美國科學(xué)家John Yates實(shí)驗(yàn)室在研發(fā)基于色譜–質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectro-metry, LC-MS)的鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)(shot-gun proteo-mics)技術(shù)上取得的卓越成就[24,25]，鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)逐漸取代2DE-MS技術(shù)，成為高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主流技術(shù)?；贚C-MS的鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的核心策略是依靠LC分離蛋白質(zhì)經(jīng)特異性內(nèi)切酶如胰蛋白酶酶切后產(chǎn)生的肽段，然后經(jīng)電噴霧技術(shù)離子化后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是通量高、容易自動化，更為重要的是酶切后產(chǎn)生的肽段可以根據(jù)不同原理的利用LC進(jìn)行多維分離而降低樣品的復(fù)雜度，如肽段可以首先被強(qiáng)陽離子交換LC進(jìn)行第一維分離，所收集的每個(gè)餾分可以經(jīng)反相LC進(jìn)行第二維分離。這種多維分離技術(shù)與MS結(jié)合可以極大限度地提高蛋白質(zhì)組鑒定的覆蓋度。

在膜蛋白質(zhì)組學(xué)方面，由于基于2DE-MS的方法很難兼容高疏水性的膜蛋白，因此該方法在膜蛋白的高通量鑒定和定量上被逐漸舍棄，而基于LC- MS的膜蛋白質(zhì)組技術(shù)在不斷地推陳出新。早期比較成功的技術(shù)是由John Yates實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的高pH溶液抽提結(jié)合非特異性酶切的方法。該技術(shù)的關(guān)鍵是先利用pH 11.0的Na2CO3將提純的囊泡狀膜組分打開，形成片狀膜組分。然后利用非特異性的蛋白酶Proteinase K對片狀膜組分進(jìn)行不完全消化，這樣兩個(gè)跨膜區(qū)之間的膜外區(qū)域便會被切成大小不一的肽段，可以利用LC-MS進(jìn)行鑒定[14]。該方法有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：第一是高pH緩沖液打開了囊泡狀膜結(jié)構(gòu)，使得包含在囊泡內(nèi)部的膜外區(qū)域也被暴露在水溶液中，從而可以被蛋白酶消化成小片段肽段，這樣就可增加膜蛋白質(zhì)被分析的區(qū)域，提高氨基酸序列鑒定的覆蓋度。這對小的膜蛋白尤其是膜外區(qū)域很小的膜蛋白具有重要的意義；第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是使用非特異性的蛋白酶來進(jìn)行消化。由于很多膜蛋白的膜外區(qū)域很小，沒有合適的特異性內(nèi)切酶如胰蛋白酶的識別為點(diǎn)，這樣可能造成膜外區(qū)域不能被酶切，或酶切所產(chǎn)生的肽段片段過大，不能被LC-MS有效地分析。利用這種方法，454個(gè)含有預(yù)測TMD的蛋白被從腦組織裂解物中鑒定出來，雖然這些蛋白質(zhì)很多都只含一個(gè)TMD，但相較基于2DE的方法來說，在膜蛋白質(zhì)的鑒定上已經(jīng)有了本質(zhì)的提高[14]。

利用高pH結(jié)合非特異性Proteinase K部分酶切的方法雖然能顯著提高膜蛋白的鑒定效率，但這種方法也有一定的弊端。首先，酶切是非特異性的，所得到的肽段的長度較難控制，并且肽段的C-端沒有特異性酶切所產(chǎn)生的標(biāo)志性氨基酸殘基，如胰蛋白酶酶切后所產(chǎn)生的K或R，不利于后續(xù)的質(zhì)譜分析。其次，由于非特異性酶切片段長短的隨機(jī)性，同一個(gè)蛋白在不同的樣品中，甚至在同一個(gè)樣品的不同技術(shù)重復(fù)中，經(jīng)過酶切所產(chǎn)生的肽段也是不一樣的，這樣樣品之間就很難進(jìn)行定量比較，尤其是不利于基于標(biāo)記的如SILAC (stable-isotope labelling by amino acids)或iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。因此，該技術(shù)事實(shí)上并沒有在具體的研究中得到廣泛的應(yīng)用。

上述幾種方法均不需要將膜蛋白真正溶解在溶液中，而是利用非特異性的酶部分消化暴露在膜外的區(qū)域。在膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面，研究的主流思路還是希望能把膜蛋白溶解在溶液中，然后再進(jìn)行后續(xù)的分析。和基于2DE的技術(shù)一樣，使用溶解能力強(qiáng)的去垢劑是溶解膜蛋白的最為直接也是最重要的手段。目前已知的溶解能力最強(qiáng)的去垢劑是SDS，但由于SDS自身帶有電荷且和蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，不易去除，因此不能兼容于后續(xù)的LC-MS。如何去除蛋白質(zhì)樣品中的SDS因此成了很多蛋白質(zhì)組學(xué)研究者孜孜不倦以求攻克的一個(gè)難題。本課題組曾經(jīng)觀察到用1% SDS溶液裂解的全細(xì)胞裂解液保存在4℃時(shí)，SDS會發(fā)生沉淀，可以通過離心予以去除。因此嘗試是否能利用這個(gè)現(xiàn)象去除蛋白質(zhì)樣品中的SDS，但經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，利用這種辦法雖然能有效地去除SDS，但也有很多的蛋白質(zhì)隨著SDS一同沉淀，造成很大的樣品損失。德國科學(xué)家Mann實(shí)驗(yàn)室在2009年發(fā)表了一種更為有效的從蛋白質(zhì)樣品中去除SDS的方法，稱之為濾膜輔助的樣品制備(filter aided sample preparation, FASP)[26]。該方法的基本原理是先利用高濃度的SDS裂解液，如2%或4% SDS裂解液，把蛋白質(zhì)溶解出來。這種高濃度的SDS裂解液幾乎能溶解所有的膜蛋白。含有SDS的蛋白質(zhì)樣品然后轉(zhuǎn)移到超濾管進(jìn)行溶液置換。超濾管的濾膜具有很多小孔，孔徑的大小決定可以濾過的蛋白質(zhì)分子的大小。通常用來做FASP實(shí)驗(yàn)的超濾膜其孔徑大小的域值小于30 kDa，也就是小于30 kDa的蛋白質(zhì)分子才能通過。域值越小，能通過的分子越小，但溶液置換所需的時(shí)間越長。其實(shí)30 kDa也是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)值。由于蛋白質(zhì)分子已經(jīng)結(jié)合了很多的SDS分子，且其空間構(gòu)象也發(fā)生了變化，因此30 kDa域值的超濾膜也能有效地阻擋10 kDa以上的蛋白質(zhì)通過。在超濾管中，可以向蛋白質(zhì)樣品加入8 mol/L的尿素來稀釋樣品。尿素作為一種很強(qiáng)的離水劑，可以把結(jié)合在蛋白質(zhì)上的SDS置換出來，同時(shí)保持蛋白質(zhì)的溶解狀態(tài)[27,28]。通過離心，讓置換出來的SDS透過濾膜而得到去除，同時(shí)樣品得到濃縮。濃縮后的樣品再次加入8 mol/L尿素稀釋以置換和去除殘余的SDS。重復(fù)數(shù)次，便能有效地去除樣品中的SDS。最后將樣品中的尿素稀釋到2 mol/L，便能進(jìn)行后續(xù)的DTT還原、碘乙酰胺烷基化以及蛋白酶消化等處理，得到的酶切肽段樣品能完全兼容LC-MS分析。FASP方法不但能有效地鑒定膜蛋白，事實(shí)上對所有的蛋白都非常有效。因此，F(xiàn)ASP方法已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)樣品處理的一種最常用的方法。需要指出的是，利用超濾管去除SDS的思想并不是Mann實(shí)驗(yàn)室第一個(gè)提出，在此之前，Manza等[29]也提出了類似的方法，但由于在其他細(xì)節(jié)上有所不同，該方法去除SDS的效率似乎沒有FASP方法好。兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)也因?yàn)樵摲椒ǖ脑瓌?chuàng)性有所爭議[12]，但就去除SDS的效率以及在該方法的推廣上，Mann實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該是貢獻(xiàn)更大。

FASP雖然在膜蛋白質(zhì)的處理上具有極大的優(yōu)勢，但也并非完美無缺，一方面該方法需要在超濾離心管中進(jìn)行多次的溶液交換，會增加實(shí)驗(yàn)的成本和時(shí)間，另一方面該方法會造成嚴(yán)重的樣品損失。事實(shí)上，第二個(gè)方面造成的后果更嚴(yán)重，正如Manza等[29]所指出的，該方法在處理小于50 g的樣品時(shí)，所能回收的肽段的量很少，很可能是肽段被吸附在濾膜上而造成了損失。為了克服這個(gè)問題，Ma等[13]提出了另外一種方法，即SCAD法(surfactant and ch-aotropic agent assisted sequential extraction/on pellet digestion)法。該方法同樣也是先用SDS溶液裂解細(xì)胞，往裂解液中加入冰冷的丙酮(80%，V/V)過夜沉淀蛋白質(zhì)，然后再用冰冷的80% 丙酮洗2 h。經(jīng)離心去除丙酮后干燥樣品，用8 mol/L尿素重新溶解蛋白質(zhì)。利用SCAD方法，作者聲稱能獲得更高的肽段回收率和媲美FASP方法的膜蛋白鑒定效率，該方法尤其適合微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。不過，本課題組在經(jīng)過多次嘗試后，發(fā)現(xiàn)SCAD方法和FASP法比起來并無明顯優(yōu)勢，尤其在處理微量樣品時(shí)，由于需要用丙酮沉淀蛋白質(zhì)，會造成一定的樣品損失。因此，在日常蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ASP方法還是處理樣品的首選方法。

3 光合模式藍(lán)藻集胞藻的膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

3.1 集胞藻簡介

集胞藻是一種單細(xì)胞的光合藍(lán)藻，也是一種重要的光合作用研究的模式生物。作為模式生物，集胞藻有如下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：第一，集胞藻和高等植物的葉綠體高度類似，都具有包括類囊體膜在內(nèi)的多種膜結(jié)構(gòu)，其光合電子傳遞鏈也和高等植物類似；第二，集胞藻的基因組在所有的藍(lán)藻中是第一個(gè)被測定的[30]，其遺傳背景相較其他藍(lán)藻更為清楚；第三，集胞藻具有天然的吸收外源DNA的能力，并能通過同源重組將外源DNA整合到自身的基因組上，非常容易進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[31]。因此，在研究基因功能時(shí)非常容易和方便地對基因進(jìn)行敲除和敲入。這些優(yōu)勢在進(jìn)行功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí)非常重要，可以方便地對新發(fā)現(xiàn)的具有潛在功能的蛋白質(zhì)進(jìn)行遺傳操作來驗(yàn)證功能。此外，集胞藻作為一種藍(lán)藻，在工業(yè)上也具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以利用其自養(yǎng)的特性，通過光能固定空氣中的CO2來生產(chǎn)清潔的可再生能源和其他有用的代謝物[32,33]。目前，在合成生物學(xué)方面，集胞藻正在作為一種重要的底盤生物進(jìn)行開發(fā)和利用[34]。

和其他藍(lán)藻一樣，集胞藻具有多種膜結(jié)構(gòu)，由外向內(nèi)，包括細(xì)胞壁的外膜、質(zhì)膜和多層的類囊體膜。其中質(zhì)膜根據(jù)其在密度梯度離心上的浮力密度不同，又可分為低密度質(zhì)膜和普通質(zhì)膜[35]。各種膜結(jié)構(gòu)上所含的蛋白質(zhì)在很大程度上決定其功能，如外膜上有很多通透性高的孔道蛋白(porin)，負(fù)責(zé)細(xì)胞與外界的物質(zhì)交換。質(zhì)膜上有很多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)有選擇性地把外界物質(zhì)如各種離子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。類囊體上有完整的光合電子傳遞鏈，負(fù)責(zé)光合作用。需要指出的是，藍(lán)藻類囊體上也有完整的呼吸電子傳遞鏈，且部分構(gòu)成成分與光合電子傳遞鏈重合[36]。這一點(diǎn)與高等植物的類囊體不同，后者只具有光合電子傳遞鏈，而呼吸鏈則位于線粒體中。當(dāng)然，各個(gè)膜組分上的蛋白質(zhì)構(gòu)成并非完全不同，如質(zhì)膜上也有部分呼吸鏈和光合鏈的蛋白[37]。因此，鑒定這些膜組分的蛋白構(gòu)成，對于理解其功能至關(guān)重要。利用膜蛋白質(zhì)預(yù)測軟件TMHMM預(yù)測，集胞藻的基因組編碼892個(gè)含有預(yù)測TMD的蛋白，當(dāng)然其中有一部分只含有一個(gè)TMD的蛋白質(zhì)可能并不是真正的IMP，而是含有信號肽的可溶性蛋白。

3.2 集胞藻膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

集胞藻的膜蛋白質(zhì)學(xué)的研究始于1997年，日本的研究團(tuán)隊(duì)在完成集胞藻基因組測序后，開始進(jìn)行其蛋白質(zhì)組學(xué)研究。他們利用2DE結(jié)合N-端測序和MS的方法，分析了集胞藻的全細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)組和分離出來的類囊體蛋白組，共鑒定了不到100個(gè)蛋白質(zhì)，只有少數(shù)幾個(gè)蛋白含有預(yù)測的TMD[38,39]。隨后，本文作者之一汪迎春研究員在做博士論文期間，利用2DE-MS方法，試圖系統(tǒng)地解析分離的集胞藻膜組分的蛋白質(zhì)組。需要指出的是，這個(gè)膜組分是經(jīng)過差異離心去除可溶性組分后獲得的膜組分沉淀，包含外膜、質(zhì)膜和類囊體膜，只不過類囊體膜占絕大部分[17]。在經(jīng)過長時(shí)間的方法優(yōu)化，嘗試了各種離水劑和去垢劑的組合后，他發(fā)現(xiàn)2DE對于溶解膜蛋白效率非常低，鑒定的蛋白只有少數(shù)幾個(gè)含有預(yù)測的TMD，而這些TMD還很有可能是信號肽[17,18]。由于2DE結(jié)合MALDI-TOF的方法是早期蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主流技術(shù)，因此可以預(yù)見早期集胞藻的膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究是困難重重。但在這領(lǐng)域也并非沒有亮點(diǎn)，這個(gè)時(shí)期最主要的亮點(diǎn)來自于對集胞藻各種膜組分的生化分離。1998年瑞典斯德哥爾摩大學(xué)的Norling等發(fā)明了一種液相二相分離法，二相分別為水溶性的多聚物Dextran-500 (5.8%)和polyethylene glycol 3350 (5.8%)組成，根據(jù)各種膜組分表面的物理化學(xué)性質(zhì)不同，對不同的膜組分進(jìn)行分離[40]。利用二相分離法結(jié)合密度梯度離心技術(shù)，Norling的學(xué)生黃芳博士(現(xiàn)為中國科學(xué)院植物研究所研究員)分離純化了質(zhì)膜和外膜，并進(jìn)行了基于2DE-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[41,42]。純化的類囊體膜蛋白質(zhì)組也隨后由Norling實(shí)驗(yàn)室分析并發(fā)表[43]。同樣，由于2DE-MS在分析膜蛋白質(zhì)上存在的先天性的技術(shù)缺陷，這些蛋白質(zhì)組學(xué)研究所鑒定的IMP數(shù)量也很少。鑒于這個(gè)原因，Norling實(shí)驗(yàn)室與韓國的Choi 團(tuán)隊(duì)合作，嘗試用不同的技術(shù)來解析膜蛋白質(zhì)組。他們開發(fā)了一種高溫酸剪切結(jié)合特異性酶切的技術(shù)[44]。該技術(shù)主要是用10 mmol/L TCEP與30%的乙腈和25%甲酸水溶液按1∶1比例混合而得到的溶液在95℃處理膜樣品，膜蛋白質(zhì)在溶解的同時(shí)，其天冬氨酸殘基的N-端和C-端都能得到剪切，產(chǎn)生小于10 kDa的肽段，這些肽段經(jīng)進(jìn)一步胰蛋白酶和chymo胰蛋白酶酶切后，產(chǎn)生更小的適合LC-MS分析的肽段。利用這種方法，他們一共鑒定了155個(gè)IMP[44]，和之前的報(bào)道相比，該方法所鑒定的IMP的數(shù)量有了很大的提高，但和集胞藻全基因組編碼的IMP比起來尚不足20%。

鑒于集胞藻在光合作用和清潔能源研究上的重要性以及在膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究上的挑戰(zhàn)性，本課題組建立蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室后又重新從事該領(lǐng)域的研究。2014年，本課題組利用FASP方法結(jié)合基于LC-MS的多維蛋白質(zhì)組學(xué)方法，定量分析了集胞藻ORF的一個(gè)敲除突變體的蛋白質(zhì)組，共鑒定了409 個(gè)IMP，占全基因組編碼的IMP的50%左右，這其中有232個(gè)IMP包含2個(gè)或以上的TMD。與以往的研究相比，在IMP鑒定覆蓋度方面有了巨大的提升。同時(shí)本課題組所鑒定的IMP在跨膜區(qū)數(shù)量的分布上沒有表現(xiàn)出明顯的偏好，從一個(gè)跨膜區(qū)到最多的18個(gè)跨膜區(qū)的IMP鑒定率都在50%左右[45]。這些結(jié)果也充分說明了FASP方法在膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究上的巨大優(yōu)勢。

盡管本課題組在集胞藻IMP鑒定的覆蓋度上取得了長足的進(jìn)步，但還有大約400個(gè)IMP不能在單次實(shí)驗(yàn)中得到鑒定。鑒于此，本課題組系統(tǒng)地分析了集胞藻所有從未被鑒定過蛋白的特性，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要是小蛋白和疏水性的蛋白，后者主要是IMP[46]。因此，推測這些未被鑒定的IPM太小，沒有合適的特異性蛋白酶切位點(diǎn)，從而逃脫了基于LC-MS的鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定；另一個(gè)可能的原因是IMP表達(dá)量太低，目前的LC-MS技術(shù)因靈敏度不夠而不能被鑒定到。對于該原因，我們推測如果將各個(gè)膜組分分離純化，這樣使得各個(gè)膜組分尤其是含量處于絕對劣勢的外膜和質(zhì)膜與含量上處于絕對優(yōu)勢的類囊體膜分開，這樣就可以使外膜和質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)得到富集，從而有可能使得一些低豐度的膜蛋白得到鑒定。本課題組和黃芳團(tuán)隊(duì)合作，從野生型的集胞藻中分離了外膜、低密度質(zhì)膜、普通質(zhì)膜、類囊體膜以及可溶性組分，利用基于LC-MS的無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對這5個(gè)組分進(jìn)行了分析，共鑒定到2167個(gè)蛋白，其中594個(gè)蛋白為IMP，使得單次實(shí)驗(yàn)集胞藻IMP鑒定的數(shù)量達(dá)到了前所未有的高度(待發(fā)表)。由于此次實(shí)驗(yàn)所用的膜組分樣品量較少，并沒有進(jìn)行樣品消耗量較大的多維蛋白質(zhì)組學(xué)分析。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將大量制備各個(gè)膜組分并對每個(gè)組分進(jìn)行多維蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定，預(yù)期所鑒定的IMP的數(shù)量還會有進(jìn)一步提高。需要指出的是，在某個(gè)特定的條件下并非所有的編碼蛋白的基因都會表達(dá)，因此在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下也就無法把集胞藻所有的IMP都鑒定出來。如果想要再進(jìn)一步提高IMP鑒定的覆蓋度，就需要在不同的條件下培養(yǎng)集胞藻。已有證據(jù)表明有些IMP的表達(dá)是環(huán)境誘導(dǎo)型的，如負(fù)責(zé)CO2轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白cmpABCD，其表達(dá)就是受低CO2濃度誘導(dǎo)[47,48]。利用此次無標(biāo)記定量的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題組對所鑒定的蛋白，包括IMP在各個(gè)組分上分布的相對豐度進(jìn)行了定量。依此定量信息，就能獲得某個(gè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位的信息，既可能特異性定位在某一個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也可能分布在多種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上。本課題組一共對2027個(gè)集胞藻蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，并將該信息儲存在一個(gè)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫以供從事藍(lán)藻研究的科學(xué)家檢索(http://protdb.genetics.ac.cn/atlas/index.html) (圖2)。

生物膜上除了含有IMP外，還有大量的PMP。在分離膜組分的時(shí)候，和膜結(jié)合穩(wěn)定的PMP一般會隨膜一起分離出來，而與膜結(jié)合不穩(wěn)定的有時(shí)會從膜上解離下來。此外，膜組分在分離時(shí)不可避免地會遭到一些可溶性蛋白的污染，這些污染蛋白并不是PMP，且與膜的結(jié)合是非特異性的。如何區(qū)分從膜組分中鑒定出來的PMP和污染蛋白一直是一個(gè)技術(shù)上的挑戰(zhàn)，也是開展對PMP功能的研究需要解決的首要問題。因此，本課題組設(shè)計(jì)了一個(gè)方法用于區(qū)分真正的PMP和污染蛋白。該方法基于如下的一個(gè)假想：所有的非IMP蛋白，在細(xì)胞內(nèi)都有兩個(gè)池 (pool)，一個(gè)是結(jié)合在膜上，一個(gè)是在可溶性組分。如果一個(gè)蛋白和膜結(jié)合得很緊密，那么它在膜上的池就較大，在可溶性組分中的池就較小，反之亦然。如果一個(gè)蛋白和膜結(jié)合得越緊密，那么它越有可能是PMP，反之則越有可能是可溶性污染蛋白?；谶@個(gè)假想，本課題組定量分析了野生型集胞藻膜組分和可溶性組分的蛋白質(zhì)組，并利用表征蛋白質(zhì)豐度的兩個(gè)質(zhì)譜學(xué)參數(shù)(質(zhì)譜信號強(qiáng)度和譜圖匹配數(shù))來計(jì)算蛋白質(zhì)在膜組分和可溶性組分中豐度的比值，并依此作出二維散點(diǎn)圖[16]。和膜結(jié)合越緊密的蛋白，其膜組分/可溶性組分的信號強(qiáng)度和譜圖匹配數(shù)的比值就越大，其在散點(diǎn)圖上的位置就越靠近右上角。如光合系統(tǒng)Ⅰ的非IMP組分PsaC、PsaD和PsaE等與膜結(jié)合非常緊密，因此位于右上角，ATP合酶的亞基AtpA和AtpB與膜的結(jié)合稍弱，處于中間，而藻膽體非常不穩(wěn)地，其多個(gè)亞基如CpcA和CpcB處于左下方(圖3)。污染蛋白和膜結(jié)合的緊密度一般較低，其比值較小，因此都分布于左下角[16]。該方法為判斷某個(gè)蛋白是否是PMP提供了定量依據(jù)。需要指出的是，PMP與膜結(jié)合的緊密度不是一成不變的，而是隨著環(huán)境的變化而變化。這也是細(xì)胞內(nèi)各種生理生化反應(yīng)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)重要調(diào)控方式。

4 結(jié)語與展望

現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使得大多數(shù)膜蛋白組研究上存在的難題正在被一一克服，在藍(lán)藻的膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展也同樣如此。這使得絕大數(shù)IMP都能被現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定到。但目前仍存在兩個(gè)主要的問題：第一是IMP跨膜區(qū)很難被鑒定到，這主要是由于跨膜區(qū)強(qiáng)疏水性以及缺少合適的特異性酶切位點(diǎn)造成的?？缒^(qū)一般不含胰蛋白酶特異識別的精氨酸和賴氨酸位點(diǎn)，因此需要選擇不同的特異性內(nèi)切酶才能獲得可用于質(zhì)譜分析的肽段；第二是很多IMP是只含一個(gè)跨膜區(qū)的小蛋白，沒有合適的酶切位點(diǎn)，也不適合基于鳥槍法的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。對于這種小蛋白，目前新興的從上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)(top-down proteomics)也許是個(gè)更好的技術(shù)選擇。從上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)方法在進(jìn)行質(zhì)譜分析前，不需要將完整的蛋白質(zhì)切成小的肽段，直接以蛋白質(zhì)本身為分析檢測對象，因此可以更完整、豐富和準(zhǔn)確地提供分析對象的生物學(xué)信息。同時(shí)，從上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)方法也彌補(bǔ)了鳥槍法蛋白質(zhì)組分析鑒定的一些不足，在小分子量或缺少蛋白酶酶切位點(diǎn)的蛋白質(zhì)鑒定方面也許會有更大的優(yōu)勢[49~51]。因此，有理由相信在不久的將來將會實(shí)現(xiàn)對膜蛋白質(zhì)組全覆蓋度的鑒定。

圖2 集胞藻可溶性蛋白與膜結(jié)合強(qiáng)度的評估

綠色箭頭線段所示，沿綠色箭頭方向，蛋白與膜結(jié)合的緊密程度依次遞增或遞減。圖中顯示光合系統(tǒng)Ⅰ的亞基(綠色散點(diǎn))、ATP合酶的亞基(藍(lán)色散點(diǎn))以及藻膽體的亞基(紅色散點(diǎn))與膜結(jié)合的強(qiáng)度依次遞減。

圖3 集胞藻蛋白質(zhì)地圖集網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)庫提供一個(gè)搜索引擎，用戶可以輸入要檢索的蛋白，如圖中所示的光合系統(tǒng)Ⅰ蛋白PsaA，該蛋白在各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的相對豐度(柱狀圖)以及其他結(jié)構(gòu)和功能信息被顯示出來。

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Advances of the technologies in large-scale membrane proteome identification

Dandan Lv, Yuanya Zhang, Haitao Ge, Xiahe Huang, Yingchun Wang

Membrane proteins play important functions not only as receptors and transporters, but also in many other important intracellular functions such as photosynthetic and respiratory electron transport. Identification of membrane proteins is a necessary step to understand their functions. Membrane proteins are generally highly hydrophobic and difficult to be resolved by aqueous solutions, and large-scale proteomic identification of membrane proteins has been a great technical challenge. Significant efforts have been invested in the field to improve the solubility of membrane proteins in aqueous solutions that are compatible for mass spectrometry analysis. This review summarizes the main technological achievements in the field of membrane proteomics particularly for the improvement of membrane protein identification, and uses the photosynthetic model cyanobacteriumsp. PCC6803 as an example to illustrate how technology advances push forward the field in terms of the increased coverage of membrane proteome identification.

membrane protein; proteomics; hydrophobicity; cyanobacterium

2019-09-08;

2019-09-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31670234)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31670234)]

呂丹丹，博士，工程師，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)。E-mail: ldd83@126.com

汪迎春，博士，研究員，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)。E-mail: ycwang@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.19-275

2019/9/16 15:50:28

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20190916.0912.002.html

(責(zé)任編委: 陳德富)