海鮮菇多糖乙?；揎椆に嚰捌淇寡趸钚?/h1>
2019-09-24 01:16:58張春潔趙圓圓陸婷婷蘇樂樂陳義勇關(guān)彥明
常熟理工學院學報 2019年5期
張春潔，趙圓圓，陸婷婷，趙 文，蘇樂樂，徐 兵，陳義勇，關(guān)彥明
（1. 常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500；2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015）
海鮮菇（Hypsizygus marmoreus）隸屬擔子菌門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬，又名蟹味菇、真姬菇，富含蛋白質(zhì)、維生素、多糖、微量元素等多種營養(yǎng)素［1］. 多糖是海鮮菇的主要成分之一，目前對海鮮菇多糖（Polysaccharides fromhypsizygus marmoreus，HMP）的研究主要集中在生物活性如抗腫瘤、提高免疫力［2］、抗病毒［3］、抗氧化［4］、分子結(jié)構(gòu)特性［4］及提?。?-8］等方面，而對HMP化學結(jié)構(gòu)修飾的研究還未見報道. 隨著對多糖結(jié)構(gòu)的深入研究，發(fā)現(xiàn)用適當?shù)氖侄螌Χ嗵沁M行結(jié)構(gòu)上的化學修飾，對多糖生物活性有較大的影響［9］.
本研究采用乙?；椒▽MP結(jié)構(gòu)進行修飾，利用響應面法對HMP乙?；揎椆に囘M行優(yōu)化，并探討乙?；ｕr菇多糖（Acetylated polysaccharides fromhypsizygus marmoreus，Ac-HMP）的抗氧化活性，旨在為HMP乙酰化修飾并開發(fā)一種新型天然功能食品添加劑提供參考.
1 材料和方法
1.1 材料與試劑
海鮮菇（昆山正興食用菌有限公司提供）；DPPH（深圳欣博盛生物科技有限公司） ；Tris（蘇州亞科科技股份有限公司）； 乙酸酐、過氧化氫、水楊酸等試劑均為分析純.
1.2 主要儀器與設備
HH-2智能數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；小型高速粉碎機（山東維諾醫(yī)藥設備制造有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京成萌偉業(yè)科技有限公司）；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵（鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司）；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器（金壇市友聯(lián)儀器研究所）；722型數(shù)顯可見分光光度計（上海光學儀器五廠有限公司）；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；CR22GⅡ高速冷凍離心機（日本HITACHI公司）； Alpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥機（德國CHRIST公司）.
1.3 實驗方法
1.3.1 HMP的制備
海鮮菇經(jīng)過干燥（30 ℃，24 h）粉碎，將海鮮菇粉末（100 g）與蒸餾水（4 000 mL）混合，80 ℃條件下浸提8 h，然后將提取液離心（4 500 r/min，20 min）. 棄去沉淀，將上清液旋蒸濃縮至原來體積的1/4，用Sevage法［10］除去蛋白，然后加入4倍體積95%乙醇，4 °C條件下醇沉24 h后再離心，將沉淀冷凍干燥得到HMP.
1.3.2 Ac-HMP的制備［11］
稱取HMP 100 mg，用10 mL蒸餾水充分溶解，用NaOH溶液（5 mol/L）將其pH調(diào)至9.0. 向HMP溶液中加入一定體積的乙酸酐，攪拌均勻并充分反應，反應結(jié)束后用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，將反應液轉(zhuǎn)入截留分子量為15 000 Da的透析袋中，用蒸餾水透析48 h，透析完成后將反應液旋蒸濃縮至原來體積的1/4，然后加入4倍體積的95%乙醇沉淀24 h，沉淀經(jīng)過真空冷凍干燥后得到Ac-HMP.
1.3.3 乙?；〈龋―egree of substitution，DS）的測定［12］
取100 mg Ac-HMP，用10 mL 0.01 mol/L NaOH溶液充分溶解，加入兩滴酚酞指示劑，并用0. 01 mol/L HCl溶液滴定至紅色褪去，記錄所消耗鹽酸的體積，根據(jù)以下公式計算取代度.
乙?；?［（NaOH溶液體積×NaOH溶液濃度-消耗HCl溶液體積×HCl溶液濃度）×0.043］/樣品質(zhì)量×100%
取代度（DS）=（132×乙?；浚?（4 300-42×乙?；浚?/p>
1.3.4 單因素實驗
1.3.4.1 反應時間對Ac-HMP取代度的影響
取100 mg HMP，用10 mL蒸餾水充分溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，加入2.5 mL乙酸酐，反應溫度50 ℃，研究反應時間（1，2，3，4，5 h）對Ac-HMP取代度的影響來確定適宜的反應時間.
1.3.4.2 反應溫度對Ac-HMP取代度的影響
取100 mg HMP，用10 mL蒸餾水充分溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，加入2.5 mL乙酸酐，反應時間3 h，研究反應溫度（40，50，60，70，80 ℃）對Ac-HMP取代度的影響來確定適宜的反應溫度.
1.3.4.3 乙酸酐用量對Ac-HMP取代度的影響
取100 mg HMP，用10 mL蒸餾水充分溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，反應溫度50 ℃，反應時間3 h，研究乙酸酐用量（1.5，2，2.5，3，3.5 mL）對Ac-HMP取代度的影響來確定適宜的乙酸酐用量.
1.3.5 響應面分析實驗設計
在單因素實驗基礎上，以乙?；〈葹橹笜?，選擇反應時間、反應溫度、乙酸酐用量3個因素，通過三因素三水平的響應面分析法確定HMP乙?；揎椀淖罴压に?
1.3.6 HMP與Ac-HMP的紅外光譜表征
分別取1 mg經(jīng)過干燥的HMP和Ac-HMP，加入2 mg溴化鉀混勻，壓片，進行紅外光譜掃描，波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1.
1.3.7 抗氧化活性
1.3.7.1 HMP與Ac-HMP對羥自由基清除作用［13］
依次加入1.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，1.0 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，然后分別加入不同濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）的HMP和Ac-HMP溶液1.0 mL，最后加入9 mmol/L H2O2溶液1.0 mL，混合均勻后37 ℃下反應30 min，測定OD510值，記為Ai. 用蒸餾水替代過氧化氫重復上述操作，測定的OD510值計為Aj. 用蒸餾水替代HMP和Ac-HMP溶液重復上述操作，測定的OD510值計為A0，測定3次，根據(jù)以下公式計算羥自由基的清除率.
1.3.7.2 HMP與Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除作用［14］
分別加入HMP和Ac-HMP溶液（濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）1.0 mL，Tris-HCl緩沖液（50 mmol /L）4.5 mL和3.2 mL蒸餾水，混合均勻后，25 ℃條件下恒溫水浴20 min，然后分別加入3 mmol/L的鄰苯三酚0.3 mL，恒溫（25 ℃）水浴3 min. 待反應結(jié)束后，立即滴加HCl溶液（10 mol/L）終止反應. 測定OD325值，記為A；空白實驗組用蒸餾水替代多糖溶液重復上述操作，測定OD325值，記為A0. 測定3次，根據(jù)以下公式計算超氧陰離子自由基的清除率.
1.3.7.3 HMP與Ac-HMP對DPPH自由基清除能力的測定［15］
分別加入HMP和Ac-HMP溶液（濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）2.0 mL，然后分別加入DPPH溶液（無水乙醇配制，濃度為0.1 mmol/L）2.0 mL，室溫條件下避光反應30 min，測定OD517值，記為A2. 分別以蒸餾水代替DPPH溶液、多糖溶液測定OD517值，分別記為A1和A0，測定3次，根據(jù)以下公式計算DPPH自由基的清除率.
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素實驗
2.1.1 反應時間對Ac-HMP取代度的影響
反應時間對Ac-HMP取代度的影響如圖1所示. 從圖1可以看出，在1～3 h時間范圍內(nèi)，取代度隨著時間的延長而提高，在3 h之后取代度隨著時間的延長而下降，因此確定合適的反應時間為3 h.
2.1.2 反應溫度對Ac-HMP取代度的影響
反應溫度對Ac-HMP取代度的影響如圖2所示. 從圖2可以看出，隨著溫度的提高，取代度逐步增加然后呈下降趨勢，當溫度達到40 ℃時，取代度達到最大值，因此適宜的反應溫度為40 ℃.
2.1.3 乙酸酐用量對Ac-HMP取代度的影響
乙酸酐用量對Ac-HMP取代度的影響如圖3所示. 從圖3可以看出，取代度隨著乙酸酐用量增加而提高，當乙酸酐用量在3 mL時，取代度達到最大，因此適宜的乙酸酐用量為3 mL.
圖1 反應時間對Ac-HMP取代度的影響
圖2 反應溫度對Ac-HMP取代度的影響
2.2 HMP乙?；揎椆に噧?yōu)化
2.2.1 響應模型的建立與分析
在單因素實驗基礎上，以取代度為指標，反應時間（A）、反應溫度（B）、乙酸酐用量（C）3個實驗因素和水平設計見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3.
借助Design-Expert軟件進行二次響應面回歸分析，得到如下多元二次響應面回歸模型：
由表3回歸分析結(jié)果可得，模型的F值為14.12，P＜0.01，表明該模型差異極顯著，可以用于實際實驗. 失擬項P=0.087 1（＞0.05），說明失擬不顯著，實驗過程中未知因素對本實驗結(jié)果影響較小，模型選擇正確.R2為0.947 8，表明取代度的實際值與模型的預測值有較好的擬合度.
2.2.2 響應面圖分析
兩因素交互作用對Ac-HMP取代度的影響如圖4所示. 從圖4可以看出，溫度對Ac-HMP取代度影響明顯，乙酸酐用量的影響次之，反應溫度的影響最不顯著. 時間和乙酸酐用量對Ac-HMP取代度交互作用顯著，溫度與乙酸酐用量對Ac-HMP取代度交互作用相對弱一些，而反應溫度和反應時間對Ac-HMP取代度交互作用不明顯.
2.2.3 HMP乙?；揎椬罴压に嚧_定及驗證
通過借助Design-Expert 軟件對響應面設計實驗結(jié)果進行分析，得到HMP乙酰化修飾的最優(yōu)工藝條件為：時間3.85 h，溫度59.86 ℃，乙酸酐用量為2.88 mL. 在該優(yōu)化條件下，海鮮菇多糖乙?；〈瓤蛇_到0.602.
為了判斷優(yōu)化工藝參數(shù)預測結(jié)果的可靠性，在具體實驗中將最優(yōu)工藝條件進行適調(diào)整為反應時間4 h，反應溫度60 ℃，乙酸酐用量為3 mL. 在調(diào)整條件下，測定Ac-HMP的取代度為0.59，與預測取代度接近，從而驗證了該模型具有可行性.
2.3 HMP與Ac-HMP的紅外光譜分析
HMP與Ac-HMP的紅外光譜圖如圖5所示. 從圖5可以看出，HMP和Ac-HMP均有多糖類物質(zhì)紅外特征峰：在波數(shù)3 427 cm-1左右處出現(xiàn)的寬吸收峰主要是多糖中的-OH基團引起的；3 132.27 cm-1處出現(xiàn)的弱吸收峰是C-H伸縮振動引起的；Ac-HMP在波數(shù)1 724.13 cm-1處出現(xiàn)的弱吸收峰主要是由酯基C=O基團的伸縮振動引起的；1 247.78 cm-1處出現(xiàn)弱的酯基C-O基團伸縮振動峰，該振動峰和乙酰基相關(guān)，表明存在乙?；?6］. 由此可知在HMP中成功加上了乙?；鶊F，即乙?；揎棾晒?
圖3 乙酸酐用量對Ac-HMP取代度的影響
表1 實驗因素與水平
表2 響應面分析結(jié)果
表3 回歸模型方差分析
圖4 兩因素交互作用對Ac-HMP取代度的影響
2.4 抗氧化活性
2.4.1 HMP與Ac-HMP對羥自由基清除作用
HMP與Ac-HMP對羥自由基清除作用見圖6. 從圖6可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，HMP和Ac-HMP對羥自由基具有較強的清除作用，隨著濃度的增加不斷上升，呈濃度依賴關(guān)系. 與HMP相比，Ac-HMP對羥自由基清除作用顯著增強. 可能是因為多糖加入乙?；螅瑢е露嗵侵ф湷浞终归_，水溶性增加進而有助于抗氧化活性的發(fā)揮［17］. 梁少茹等人［11］研究發(fā)現(xiàn)與未修飾的茶多糖相比，乙酰化修飾后的茶多糖對羥自由基的清除作用明顯增強. 宋逍等人［18］研究發(fā)現(xiàn)乙?；揎椇蟮慕疸y花多糖清除羥基自由基的能力增強. 但是不是所有的多糖經(jīng)過改性后生物活性都會提高. 研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草多糖［19］、松樹蕈多糖［20］經(jīng)過乙?；揎椇罂寡趸钚苑炊档?，這可能是多糖種類及結(jié)構(gòu)不同造成抗氧化活性的差異［20］.
2.4.2 HMP與Ac-HMP對DPPH自由基清除作用
HMP與Ac-HMP對DPPH自由基清除作用見圖7. 從圖7可以看出，在選擇的實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HMP與Ac-HMP對DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除能力與濃度呈正相關(guān). 與HMP相比，Ac-HMP對DPPH自由基清除能力增強，這可能與乙?；髮е赂喽嗵莾?nèi)部的羥基或羧基暴露，使多糖水溶性增加有助于活性發(fā)揮有關(guān)［21］.
2.4.3 HMP與Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除作用
圖5 HMP和Ac-HMP紅外光譜圖
HMP與Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除作用見圖8. 從圖8可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，HMP和Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除能力逐步提高. 與HMP相比，Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除能力有一定程度的增強，這可能是因為HMP經(jīng)過修飾后導致Ac-HMP空間結(jié)構(gòu)變化，具體機理有待深入研究. 已有研究也表明黑木耳多糖［22］、二色補血草多糖［23］經(jīng)過乙?；揎椇髮Τ蹶庪x子自由基的清除能力有所增強.
圖6 HMP和Ac-HMP對羥自由基清除作用
圖7 HMP和Ac-HMP對DPPH自由基清除作用
圖8 HMP與Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除作用
3 結(jié)論
以海鮮菇為原料，采用熱水浸提法提取HMP，采用乙酸酐法制備Ac-HMP，采用響應面法對HMP乙?；揎椆に囘M行優(yōu)化，并探討了HMP與Ac-HMP的抗氧化活性. HMP乙?；罴压に嚄l件為：時間3.85 h，溫度59.86 ℃，乙酸酐用量2.88 mL. 在該優(yōu)化條件下，HMP乙酰化取代度達到0.602. 與HMP相比，Ac-HMP抗氧化活性明顯增強.
該研究通過對HMP乙?；揎?，進而改變HMP分子結(jié)構(gòu)，提高了HMP的抗氧化活性，說明乙酰化修飾是一種較為理想的HMP結(jié)構(gòu)改性方法. 這對進一步揭示多糖構(gòu)效關(guān)系及HMP在未來開發(fā)一種新型天然功能食品添加劑具有重要意義，但是對影響Ac--HMP抗氧化活性的結(jié)構(gòu)因素如乙?；〈恢?、空間構(gòu)象及取代度大小等尚不清楚，仍需進一步研究.
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1 材料和方法
1.1 材料與試劑
海鮮菇（昆山正興食用菌有限公司提供）；DPPH（深圳欣博盛生物科技有限公司） ；Tris（蘇州亞科科技股份有限公司）； 乙酸酐、過氧化氫、水楊酸等試劑均為分析純.
1.2 主要儀器與設備
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1.3 實驗方法
1.3.1 HMP的制備
海鮮菇經(jīng)過干燥（30 ℃，24 h）粉碎，將海鮮菇粉末（100 g）與蒸餾水（4 000 mL）混合，80 ℃條件下浸提8 h，然后將提取液離心（4 500 r/min，20 min）. 棄去沉淀，將上清液旋蒸濃縮至原來體積的1/4，用Sevage法［10］除去蛋白，然后加入4倍體積95%乙醇，4 °C條件下醇沉24 h后再離心，將沉淀冷凍干燥得到HMP.
1.3.2 Ac-HMP的制備［11］
稱取HMP 100 mg，用10 mL蒸餾水充分溶解，用NaOH溶液（5 mol/L）將其pH調(diào)至9.0. 向HMP溶液中加入一定體積的乙酸酐，攪拌均勻并充分反應，反應結(jié)束后用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，將反應液轉(zhuǎn)入截留分子量為15 000 Da的透析袋中，用蒸餾水透析48 h，透析完成后將反應液旋蒸濃縮至原來體積的1/4，然后加入4倍體積的95%乙醇沉淀24 h，沉淀經(jīng)過真空冷凍干燥后得到Ac-HMP.
1.3.3 乙?；〈龋―egree of substitution，DS）的測定［12］
取100 mg Ac-HMP，用10 mL 0.01 mol/L NaOH溶液充分溶解，加入兩滴酚酞指示劑，并用0. 01 mol/L HCl溶液滴定至紅色褪去，記錄所消耗鹽酸的體積，根據(jù)以下公式計算取代度.
乙?；?［（NaOH溶液體積×NaOH溶液濃度-消耗HCl溶液體積×HCl溶液濃度）×0.043］/樣品質(zhì)量×100%
取代度（DS）=（132×乙?；浚?（4 300-42×乙?；浚?/p>
1.3.4 單因素實驗
1.3.4.1 反應時間對Ac-HMP取代度的影響
取100 mg HMP，用10 mL蒸餾水充分溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，加入2.5 mL乙酸酐，反應溫度50 ℃，研究反應時間（1，2，3，4，5 h）對Ac-HMP取代度的影響來確定適宜的反應時間.
1.3.4.2 反應溫度對Ac-HMP取代度的影響
取100 mg HMP，用10 mL蒸餾水充分溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，加入2.5 mL乙酸酐，反應時間3 h，研究反應溫度（40，50，60，70，80 ℃）對Ac-HMP取代度的影響來確定適宜的反應溫度.
1.3.4.3 乙酸酐用量對Ac-HMP取代度的影響
取100 mg HMP，用10 mL蒸餾水充分溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，反應溫度50 ℃，反應時間3 h，研究乙酸酐用量（1.5，2，2.5，3，3.5 mL）對Ac-HMP取代度的影響來確定適宜的乙酸酐用量.
1.3.5 響應面分析實驗設計
在單因素實驗基礎上，以乙?；〈葹橹笜?，選擇反應時間、反應溫度、乙酸酐用量3個因素，通過三因素三水平的響應面分析法確定HMP乙?；揎椀淖罴压に?
1.3.6 HMP與Ac-HMP的紅外光譜表征
分別取1 mg經(jīng)過干燥的HMP和Ac-HMP，加入2 mg溴化鉀混勻，壓片，進行紅外光譜掃描，波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1.
1.3.7 抗氧化活性
1.3.7.1 HMP與Ac-HMP對羥自由基清除作用［13］
依次加入1.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，1.0 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，然后分別加入不同濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）的HMP和Ac-HMP溶液1.0 mL，最后加入9 mmol/L H2O2溶液1.0 mL，混合均勻后37 ℃下反應30 min，測定OD510值，記為Ai. 用蒸餾水替代過氧化氫重復上述操作，測定的OD510值計為Aj. 用蒸餾水替代HMP和Ac-HMP溶液重復上述操作，測定的OD510值計為A0，測定3次，根據(jù)以下公式計算羥自由基的清除率.
1.3.7.2 HMP與Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除作用［14］
分別加入HMP和Ac-HMP溶液（濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）1.0 mL，Tris-HCl緩沖液（50 mmol /L）4.5 mL和3.2 mL蒸餾水，混合均勻后，25 ℃條件下恒溫水浴20 min，然后分別加入3 mmol/L的鄰苯三酚0.3 mL，恒溫（25 ℃）水浴3 min. 待反應結(jié)束后，立即滴加HCl溶液（10 mol/L）終止反應. 測定OD325值，記為A；空白實驗組用蒸餾水替代多糖溶液重復上述操作，測定OD325值，記為A0. 測定3次，根據(jù)以下公式計算超氧陰離子自由基的清除率.
1.3.7.3 HMP與Ac-HMP對DPPH自由基清除能力的測定［15］
分別加入HMP和Ac-HMP溶液（濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）2.0 mL，然后分別加入DPPH溶液（無水乙醇配制，濃度為0.1 mmol/L）2.0 mL，室溫條件下避光反應30 min，測定OD517值，記為A2. 分別以蒸餾水代替DPPH溶液、多糖溶液測定OD517值，分別記為A1和A0，測定3次，根據(jù)以下公式計算DPPH自由基的清除率.
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素實驗
2.1.1 反應時間對Ac-HMP取代度的影響
反應時間對Ac-HMP取代度的影響如圖1所示. 從圖1可以看出，在1～3 h時間范圍內(nèi)，取代度隨著時間的延長而提高，在3 h之后取代度隨著時間的延長而下降，因此確定合適的反應時間為3 h.
2.1.2 反應溫度對Ac-HMP取代度的影響
反應溫度對Ac-HMP取代度的影響如圖2所示. 從圖2可以看出，隨著溫度的提高，取代度逐步增加然后呈下降趨勢，當溫度達到40 ℃時，取代度達到最大值，因此適宜的反應溫度為40 ℃.
2.1.3 乙酸酐用量對Ac-HMP取代度的影響
乙酸酐用量對Ac-HMP取代度的影響如圖3所示. 從圖3可以看出，取代度隨著乙酸酐用量增加而提高，當乙酸酐用量在3 mL時，取代度達到最大，因此適宜的乙酸酐用量為3 mL.
圖1 反應時間對Ac-HMP取代度的影響
圖2 反應溫度對Ac-HMP取代度的影響
2.2 HMP乙?；揎椆に噧?yōu)化
2.2.1 響應模型的建立與分析
在單因素實驗基礎上，以取代度為指標，反應時間（A）、反應溫度（B）、乙酸酐用量（C）3個實驗因素和水平設計見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3.
借助Design-Expert軟件進行二次響應面回歸分析，得到如下多元二次響應面回歸模型：
由表3回歸分析結(jié)果可得，模型的F值為14.12，P＜0.01，表明該模型差異極顯著，可以用于實際實驗. 失擬項P=0.087 1（＞0.05），說明失擬不顯著，實驗過程中未知因素對本實驗結(jié)果影響較小，模型選擇正確.R2為0.947 8，表明取代度的實際值與模型的預測值有較好的擬合度.
2.2.2 響應面圖分析
兩因素交互作用對Ac-HMP取代度的影響如圖4所示. 從圖4可以看出，溫度對Ac-HMP取代度影響明顯，乙酸酐用量的影響次之，反應溫度的影響最不顯著. 時間和乙酸酐用量對Ac-HMP取代度交互作用顯著，溫度與乙酸酐用量對Ac-HMP取代度交互作用相對弱一些，而反應溫度和反應時間對Ac-HMP取代度交互作用不明顯.
2.2.3 HMP乙?；揎椬罴压に嚧_定及驗證
通過借助Design-Expert 軟件對響應面設計實驗結(jié)果進行分析，得到HMP乙酰化修飾的最優(yōu)工藝條件為：時間3.85 h，溫度59.86 ℃，乙酸酐用量為2.88 mL. 在該優(yōu)化條件下，海鮮菇多糖乙?；〈瓤蛇_到0.602.
為了判斷優(yōu)化工藝參數(shù)預測結(jié)果的可靠性，在具體實驗中將最優(yōu)工藝條件進行適調(diào)整為反應時間4 h，反應溫度60 ℃，乙酸酐用量為3 mL. 在調(diào)整條件下，測定Ac-HMP的取代度為0.59，與預測取代度接近，從而驗證了該模型具有可行性.
2.3 HMP與Ac-HMP的紅外光譜分析
HMP與Ac-HMP的紅外光譜圖如圖5所示. 從圖5可以看出，HMP和Ac-HMP均有多糖類物質(zhì)紅外特征峰：在波數(shù)3 427 cm-1左右處出現(xiàn)的寬吸收峰主要是多糖中的-OH基團引起的；3 132.27 cm-1處出現(xiàn)的弱吸收峰是C-H伸縮振動引起的；Ac-HMP在波數(shù)1 724.13 cm-1處出現(xiàn)的弱吸收峰主要是由酯基C=O基團的伸縮振動引起的；1 247.78 cm-1處出現(xiàn)弱的酯基C-O基團伸縮振動峰，該振動峰和乙酰基相關(guān)，表明存在乙?；?6］. 由此可知在HMP中成功加上了乙?；鶊F，即乙?；揎棾晒?
圖3 乙酸酐用量對Ac-HMP取代度的影響
表1 實驗因素與水平
表2 響應面分析結(jié)果
表3 回歸模型方差分析
圖4 兩因素交互作用對Ac-HMP取代度的影響
2.4 抗氧化活性
2.4.1 HMP與Ac-HMP對羥自由基清除作用
HMP與Ac-HMP對羥自由基清除作用見圖6. 從圖6可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，HMP和Ac-HMP對羥自由基具有較強的清除作用，隨著濃度的增加不斷上升，呈濃度依賴關(guān)系. 與HMP相比，Ac-HMP對羥自由基清除作用顯著增強. 可能是因為多糖加入乙?；螅瑢е露嗵侵ф湷浞终归_，水溶性增加進而有助于抗氧化活性的發(fā)揮［17］. 梁少茹等人［11］研究發(fā)現(xiàn)與未修飾的茶多糖相比，乙酰化修飾后的茶多糖對羥自由基的清除作用明顯增強. 宋逍等人［18］研究發(fā)現(xiàn)乙?；揎椇蟮慕疸y花多糖清除羥基自由基的能力增強. 但是不是所有的多糖經(jīng)過改性后生物活性都會提高. 研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草多糖［19］、松樹蕈多糖［20］經(jīng)過乙?；揎椇罂寡趸钚苑炊档?，這可能是多糖種類及結(jié)構(gòu)不同造成抗氧化活性的差異［20］.
2.4.2 HMP與Ac-HMP對DPPH自由基清除作用
HMP與Ac-HMP對DPPH自由基清除作用見圖7. 從圖7可以看出，在選擇的實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HMP與Ac-HMP對DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除能力與濃度呈正相關(guān). 與HMP相比，Ac-HMP對DPPH自由基清除能力增強，這可能與乙?；髮е赂喽嗵莾?nèi)部的羥基或羧基暴露，使多糖水溶性增加有助于活性發(fā)揮有關(guān)［21］.
2.4.3 HMP與Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除作用
圖5 HMP和Ac-HMP紅外光譜圖
HMP與Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除作用見圖8. 從圖8可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，HMP和Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除能力逐步提高. 與HMP相比，Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除能力有一定程度的增強，這可能是因為HMP經(jīng)過修飾后導致Ac-HMP空間結(jié)構(gòu)變化，具體機理有待深入研究. 已有研究也表明黑木耳多糖［22］、二色補血草多糖［23］經(jīng)過乙?；揎椇髮Τ蹶庪x子自由基的清除能力有所增強.
圖6 HMP和Ac-HMP對羥自由基清除作用
圖7 HMP和Ac-HMP對DPPH自由基清除作用
圖8 HMP與Ac-HMP對超氧陰離子自由基清除作用
3 結(jié)論
以海鮮菇為原料，采用熱水浸提法提取HMP，采用乙酸酐法制備Ac-HMP，采用響應面法對HMP乙?；揎椆に囘M行優(yōu)化，并探討了HMP與Ac-HMP的抗氧化活性. HMP乙?；罴压に嚄l件為：時間3.85 h，溫度59.86 ℃，乙酸酐用量2.88 mL. 在該優(yōu)化條件下，HMP乙酰化取代度達到0.602. 與HMP相比，Ac-HMP抗氧化活性明顯增強.
該研究通過對HMP乙?；揎?，進而改變HMP分子結(jié)構(gòu)，提高了HMP的抗氧化活性，說明乙酰化修飾是一種較為理想的HMP結(jié)構(gòu)改性方法. 這對進一步揭示多糖構(gòu)效關(guān)系及HMP在未來開發(fā)一種新型天然功能食品添加劑具有重要意義，但是對影響Ac--HMP抗氧化活性的結(jié)構(gòu)因素如乙?；〈恢?、空間構(gòu)象及取代度大小等尚不清楚，仍需進一步研究.
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