劉 茜， 劉博文， 王 洋， 奧 寶， 田沛鑫， 文素蕓， 張旭虎， 苗彥軍， 許岳飛*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 2. 西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院， 西藏 林芝 860000)

紫外輻射是指波長范圍為10～400 nm的非照明光輻射。在該波長范圍內(nèi)根據(jù)不同波長和其所引起輻射效應(yīng)的不同，將紫外輻射分為UV-C(100～280 nm，短波)、UV-B(280～320 nm，中波)及UV-A(320～400 nm，長波)。西藏位于我國青藏高原地區(qū)的西南部，地形復(fù)雜多樣，海拔較高，大氣稀薄，是中國太陽輻射能最多的地方。而且平流層的臭氧量降低明顯，臭氧層吸收紫外輻射的能力大大減弱，導(dǎo)致到達(dá)地面的UV-B明顯增加。據(jù)有關(guān)資料顯示，拉薩當(dāng)?shù)叵募厩缈諘r的UV-B輻射強(qiáng)度可達(dá)6.0 W·m-2，其紫外輻射強(qiáng)度遠(yuǎn)高于平原地區(qū)[1-2]。然而光照作為植物生長發(fā)育必需的能量來源之一，其對植物的生長發(fā)育、生理生化和形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面都有著極其重要的影響，故研究該地區(qū)的紫外輻射具有十分重要的意義，尤其是關(guān)于UV-B對高等植物的形態(tài)、生物量積累等進(jìn)程的影響[3-4]。

垂穗披堿草(Elymusnutans)是禾本科(Poaceae)披堿草屬(Elymus)的一種多年生草本優(yōu)質(zhì)牧草[5]，分布于我國的西藏和西北等地區(qū)，且常在青藏高原地區(qū)海拔2 500～4 000 m的草地中擔(dān)任建群種的重要角色[6]，具有產(chǎn)量高、適口性好、適應(yīng)性強(qiáng)和生長可塑性廣泛等優(yōu)良特性，鑒于其良好的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價值，已被引入栽培利用[7]。垂穗披堿草還有著很好的抗逆性，例如抗病、抗蟲、抗旱、耐鹽等優(yōu)良抗逆基因。而關(guān)于垂穗披堿草抗UV-B輻射方面的研究較少[8]，但UV-B輻射對其他植物的影響已有研究報道，如水稻(OryzasativaL.)、甘草(GlycyrrhizauralensisF.)和大麥(HordeumvulgareL.)等[9-11]。UV-B輻射的相關(guān)研究普遍認(rèn)為：植物在經(jīng)受UV-B輻射后生物量的積累和光合系統(tǒng)會受到影響[12-13]，并且植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)也會進(jìn)行一系列反應(yīng)來減輕或避免活性氧對細(xì)胞膜的傷害。研究認(rèn)為超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)等抗氧化酶活性可作為植物抗逆性生理評價的重要指標(biāo)，輔以細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量、脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)活性和可溶性蛋白含量等指標(biāo)來進(jìn)行綜合分析，能更準(zhǔn)確地對植物的抗UV-B輻射進(jìn)行評價。因此本研究以2份不同生態(tài)型垂穗披堿草的幼苗為研究對象，采取人工模擬UV-B輻射處理，測定UV-B輻射對這2份垂穗披堿草幼苗的生物量、光合色素含量、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化酶產(chǎn)生的影響變化，旨在為優(yōu)良牧草的繁育和品種的改良提供技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)計

本實(shí)驗(yàn)于2014年10—11月在西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)所用的野生型垂穗披堿草種子(XZ)是于2012年9月采自于西藏申扎縣(91°41.960′ E，31°06′187′′ N)，商用型垂穗披堿草種子(ZD)是購自于北京正道生態(tài)科技有限公司。供試種子經(jīng)0.1%(W/V)次氯酸鈉溶液消毒，由蒸餾水沖洗數(shù)次后置于濕潤的石英砂(事先已高溫滅菌)培養(yǎng)皿中，并放置在人工氣候箱(MGC-450HP上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；光通量密度200 μmol·m-2·s-1、光期16 h、溫度25℃、濕度70%；暗期8 h、溫度20℃、濕度60%)中進(jìn)行培養(yǎng)。7 d后選擇生長整齊一致的幼苗分別移入黑色育苗盆(口徑為5×5 cm，深度為10 cm，總體積為100 mL)中，基質(zhì)為已滅菌的石英砂，每盆3株，移植深度為2 cm。隨后，將移植好的石英育苗盆置于人工氣候箱中培養(yǎng)21 d，期間幼苗每3 d更換一次Hoagland營養(yǎng)液。21 d后，2個生態(tài)型的垂穗披堿草幼苗均分別接受UV-B(標(biāo)記為ZD+和XZ+)和作為對照的正常光照處理(標(biāo)記為ZD-和XZ-)，采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計，在2個相同人工氣候箱中分別實(shí)施UVB處理和對照光照處理，每處理重復(fù)3次。在每天8:30～16:30使用12根40 W 1.2 m UV-B熒光燈對每個處理進(jìn)行照射，其余時間為正常光照(與育苗期人工氣候箱參數(shù)相同)。處理組用0.125 mm厚的二醋酸纖維素薄膜包裹過濾UV-C照射，為紫外處理組的幼苗提供UV-B照射，使處理組UV-B輻射水平為7.0 KJ·m-2·d-1，此輻射水平與Fisher (2007)等人關(guān)于UV-B輻射對冬小麥的研究中所使用的輻射劑量相同[14]。UV-B輻射采用紫外輻照計(TN-2340 紫外輻照計(UV-A/UV-B))在植株頂端部進(jìn)行測量。其他培養(yǎng)條件各組均一致。處理7 d后對幼苗進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.2 測定項(xiàng)目及方法

每個處理選取完整的植株，分別取每株植物的地上和地下部分，用自來水洗凈，再用蒸餾水沖洗3遍，吸干水分，于105℃殺青30 min，70℃下烘干至恒重測定其干重，其對應(yīng)比值為根莖比；葉片色素含量的測定參照許大全[15]的方法；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[16]；氧自由基產(chǎn)生速率采用Elstner Heupel等[17]方法測定；可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[18]；測定脂氧化酶(LOX)活性參照石勝堯的方法[19]。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[20]測定。過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外光度法[21]測定。過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[22]測定。谷胱甘肽還原酶(GR)活性采用Foyer and Halliwell法[23]測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以SPSS 22.0進(jìn)行雙因素方差分析，使用Duncan’s法對平均值進(jìn)行多重比較，作圖采用SigmaPlot 12.5軟件完成。

2 結(jié)果分析

2.1 UV-B輻射對2份垂穗披堿草幼苗生長的影響

垂穗披堿草的生態(tài)型種類和UV-B水平的交互效應(yīng)對其地上生物量的影響未達(dá)到顯著水平，但對地下生物量和根莖比影響顯著。由圖1-A可見，不同生態(tài)型之間和UV-B水平之間的地上生物量均有顯著差異(P<0.05)：經(jīng)UV-B輻射的地上生物量顯著下降了14.2%；而且XZ幼苗的地上生物量顯著低于ZD 15.2%；ZD在經(jīng)受UV-B輻射后幼苗的地下生物量(圖1-B)和根莖比(圖1-C)較對照分別顯著下降了61.7%和56.1%(P<0.05)，而XZ經(jīng)UV-B輻射后地下生物量(圖1-B)和根莖比(圖1-C)均無顯著性變化?？梢奤V-B對XZ垂穗披堿草幼苗影響較小，對ZD垂穗披堿草幼苗的影響較大。

圖1 UV-B對垂穗披堿草幼苗地上生物量(A)、地下生物量(B)和根莖比(C)的影響Fig.1 Effects of UV-B on above-ground biomass (A),below-ground biomass(B) and root-shoot ratio(C) of two ecological types of E. nutans注：-UV-B：無UV-B輻射處理；+UV-B：UV-B輻射處理；ZD-：ZD-UV-B；ZD+：ZD+UV-B；XZ-：XZ+UV-B；XZ+：XZ+UV-B；不同字母標(biāo)記的平均數(shù)間差異顯著(P<0.05)；ns表示差異不顯著；*,**和***分別表示0.05，0.01和0.001水平差異顯著；下同Note:-UV-B:without UV-B radiation treatment;+UV-B:UV-B radiation treatment;ZD-:ZD-UV-B;ZD+:ZD+UV-B;XZ-:XZ+UV-B;XZ+:XZ+UV-B;Different lowercase letters in the figure indicate significant difference at the 0.05 level;ns:not significant;*,** and*** indicate significant difference at the 0.05,0.01 and 0.001 level,respectively;the same as below

2.2 UV-B輻射對垂穗披堿草幼苗光合色素含量的影響

由圖2可知，不同生態(tài)型種類和UV-B水平的交互效應(yīng)對垂穗披堿草光合色素含量的影響并未達(dá)到顯著水平，但對各光合色素含量影響各不相同。其中UV-B輻射顯著影響了了2份垂穗披堿草幼苗的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量和葉綠素a/b值，但對類胡蘿卜素(圖2-C)的含量影響卻未達(dá)顯著水平。具體表現(xiàn)為：與對照組相比，UV-B輻射處理7 d后垂穗披堿草葉綠素a的含量顯著降低了11.8%(P<0.05)，葉綠素b含量顯著降低了16.8%(P<0.001)，總?cè)~綠素含量顯著降低了12.8%(P<0.01)，葉綠素a/b值則顯著增加3.9%(P<0.05)。不同生態(tài)型間的垂穗披堿草僅葉綠素b含量的差異顯著，以ZD顯著高于XZ的80.3%。

圖2 UV-B對垂穗披堿草幼苗光合色素的影響Fig.2 Effects of UV-B on chlorophyll concentration of two ecological types of E. nutans

2.3 UV-B輻射對垂穗披堿草幼苗丙二醛含量和超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率的影響

UV-B輻射水平和垂穗披堿草的生態(tài)型種類對于MDA含量和產(chǎn)生速率的影響不存在顯著的交互效應(yīng)，但是不同光照條件和不同生態(tài)型對垂穗披堿草幼苗MDA含量的影響均達(dá)到了顯著水平(P<0.001)，UV-B輻射處理顯著提高了垂穗披堿草的MDA含量(圖3-A)，而ZD的MDA含量顯著高于XZ的93.2%。然而UV-B輻射處理對的產(chǎn)生速率影響則無顯著差異(圖3-B)，但不同生態(tài)型間差異顯著(P<0.05)，以ZD顯著高于XZ的25.4%。

圖3 UV-B對垂穗披堿草幼苗MDA含量(A)和產(chǎn)生速率(B)的影響Fig.3 Effects of UV-B on MDA content (A) and generation of (B) of two ecological types of E. nutans

2.4 UV-B輻射對垂穗披堿草幼苗可溶性蛋白含量和脂氧合酶活性的影響

UV-B輻射水平對2份不同生態(tài)型垂穗披堿草的可溶性蛋白含量(圖4-A)和LOX活性(圖4-B)產(chǎn)生了不同的影響。不同生態(tài)型間垂穗披堿草的可溶性蛋白含量(圖4-A)沒有顯著差異，但不同的UV-B輻射水平對可溶性蛋白含量的影響差異顯著(P<0.01)，以有UV-B輻射顯著高于正常光照7.0%。UV-B輻射對2份垂穗披堿草幼苗的LOX活性(圖4-B)卻有著不同的影響。表現(xiàn)為：在UV-B輻射7 d后，ZD幼苗的LOX活性(圖4-B)較對照顯著提高了105.5%(P<0.05)，但XZ幼苗的LOX活性在經(jīng)受UV-B輻射后均無顯著性變化。

圖4 UV-B對垂穗披堿草幼苗可溶性蛋白含量(A)和LOX活性(B)的影響Fig.4 Effects of UV-B on soluble protein content (A) and LOX activities (B) of two ecological types of E. nutans

2.5 UV-B輻射對垂穗披堿草幼苗4種抗氧化酶活性的影響

方差分析結(jié)果表明，2因子互作效應(yīng)對4種抗氧化酶活性的影響均不顯著(圖5)。不同光照類型間SOD(圖5-A)和POD(圖5-C)活性均沒有顯著差異，而2個不同生態(tài)型間SOD和POD的差異卻都達(dá)到了顯著水平，以XZ的平均SOD活性顯著地遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ZD(P<0.001)，而ZD的POD顯著高于XZ的81.4%(P<0.05)。然而，CAT和GR(圖5-D)活性在2個不同生態(tài)型間沒有顯著差異，而在2個光照類型間差異顯著(P<0.05)，以有UV-B輻射的POD活性顯著高于正常光照29.6%，而正常光照的GR活性顯著高于UV-B輻射38.3%。

圖5 UV-B對垂穗披堿草幼苗對SOD(A)、POD(B)、CAT(C)和GR(D)活性的影響Fig.5 Effects of UV-B on the SOD(A),POD(B),CAT(C)and GR(D) activities of two ecological types of E. nutans

3 討論

UV-B輻射是牧草生長的重要應(yīng)激因子，對牧草的生長生理有著不同的影響。

許多研究發(fā)現(xiàn)，UV-B輻射能明顯影響到植物生長和生理狀態(tài)，植物可做出一系列應(yīng)激反應(yīng)來適應(yīng)UV-B輻射[24]。其中生物量是衡量植物受到逆境脅迫時的重要生理指標(biāo)，其變化反映了植物對不利環(huán)境因素的敏感性和耐受性程度。前人的研究發(fā)現(xiàn)，在受到UV-B輻射后植物的生物量積累會受到影響，其地上與地下生物量的分配也會發(fā)生變化，植物會將生物量的積累轉(zhuǎn)移到地上部分，從而出現(xiàn)根莖比降低等現(xiàn)象[25]，這與本試驗(yàn)UV-B顯著降低ZD垂穗披堿草幼苗地下生物量和根莖比的結(jié)果相似，并且UV-B降低了地上生物量，這可能是因?yàn)閆D垂穗披堿草幼苗在盡可能地修復(fù)植物地上部分以保留碳源，從而抵御不良環(huán)境。試驗(yàn)結(jié)果中UV-B輻射對XZ的地下生物量和根莖比影響較ZD小，可能是由于其長期在自然條件下的進(jìn)化使之更耐受于UV-B。

光合作用是綠色植物形態(tài)建成和生長發(fā)育的基礎(chǔ)，植物葉片中光合色素的含量變化直接影響到植物光合作用，包括植物對光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化。而逆境環(huán)境會破壞植物的光反應(yīng)和光合色素等來降低植物的光合作用的反應(yīng)速率。大量研究認(rèn)為UV-B輻射后植物的光合色素合成受到抑制而出現(xiàn)含量下降，從而導(dǎo)致光合作用降低。這與本試驗(yàn)的結(jié)果相符：UV-B輻射處理影響了2份垂穗披堿草幼苗的光合色素含量，其中UV-B輻射對垂穗披堿草幼苗的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b值的影響均有顯著差異。有研究分析這種現(xiàn)象可能是UV-B輻射導(dǎo)致供試垂穗披堿草幼苗的葉綠體部分結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而使葉片光合色素含量受到影響造成的[26]。相關(guān)研究結(jié)果表明UV-B可使綠色植物的葉綠素a含量出現(xiàn)顯著降低[27]，而這與本研究中葉綠素a含量的變化不相符，這可能與兩個研究中植物的種類不同和其所處生長發(fā)育階段不同有關(guān)系。另外，與對照相比，UV-B輻射依然對XZ的光合色素含量影響較小，可見XZ幼苗比ZD幼苗更耐受于UV-B輻射。

植物的生物膜透性對于逆境的反應(yīng)比較敏感，植物的抗逆性也與之密切相關(guān)。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，是鑒定植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受破壞程度的重要衡量指標(biāo)之一[28]，而其含量與產(chǎn)生速率有關(guān)[29]，會對植物生物膜造成極大威脅，且會使植物體內(nèi)正常代謝平衡被破壞。本試驗(yàn)中，UV-B輻射處理7 d后2份垂穗披堿草的MDA含量和產(chǎn)生速率不同程度地升高，其中MDA含量均出現(xiàn)顯著增加，而產(chǎn)生速率均有提高但并未達(dá)顯著水平。該現(xiàn)象可能是由于UV-B輻射破壞了垂穗披堿草幼苗的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)所致，從而使幼苗的生物膜脂質(zhì)過氧化加劇，故其產(chǎn)物MDA含量也呈增加趨勢。但XZ垂穗披堿草升高的較ZD少，可見UV-B輻射對XZ垂穗披堿草細(xì)胞膜透性的傷害較輕。

植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量亦可反映植物抗逆性能力的大小。由于可溶性蛋白有著較強(qiáng)的持水力，其含量增多可以降低細(xì)胞滲透勢，保持和穩(wěn)定大分子物質(zhì)，維持細(xì)胞膜的正常功能[30]可以在植物經(jīng)受逆境時起保護(hù)作用。本試驗(yàn)中經(jīng)UV-B輻射處理的2份垂穗披堿草的可溶性蛋白含量也均有增加，但是不同生態(tài)型間差異卻并未達(dá)到顯著水平。而LOX亦能促進(jìn)各種細(xì)胞膜不可逆損害的修復(fù)[31-32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示ZD垂穗披堿草的LOX活性顯著增加，可能是由于其抗UV-B性較弱所以其植物組織在受到傷害作出的應(yīng)激反應(yīng)較強(qiáng)，這與菜豆(PhaseolusvulgarisL.)在受到逆境時的LOX變化結(jié)果相一致[33]。同樣，UV-B處理下XZ幼苗的可溶性蛋白含量和LOX活性的變化幅度小于ZD，可見其具有較好的抗UV-B輻射性。

通常植物對逆境抵抗能力也與體內(nèi)的抗氧化酶活性水平關(guān)系密切。在逆境下SOD、POD、CAT以及其它酶類相互協(xié)調(diào)，有效地清除代謝過程產(chǎn)生的活性氧，使生物體內(nèi)活性氧維持在低水平上，從而防止了活性氧引起的膜脂過氧化及其它傷害過程。生物體內(nèi)SOD活性高低是植物抗逆性的重要標(biāo)志之一，其主要是將歧化成H2O2，而POD和CAT在植物清除體內(nèi)自由基過程中的第二步起主要作用，將轉(zhuǎn)化成的H2O2進(jìn)一步分解為H2O，從而消除H2O2對細(xì)胞的毒害[34]。而GR主要通過參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)而在細(xì)胞活性氧的清除中起重要作用，并與SOD、APX等相互作用共同清除植物體內(nèi)多余的活性氧。Kataria等人[35]通過研究發(fā)現(xiàn)，UV-B輻射顯著增強(qiáng)了葉片的SOD和POD活性。還有研究表明UV-B輻射可使蘆葦(Phragmitescommunis)葉片的SOD、CAT和GR活性出現(xiàn)顯著升高[36]。本試驗(yàn)供試的2份垂穗披堿草幼苗在UV-B輻射后，SOD活性的變化未達(dá)到顯著水平；然而其中XZ垂穗披堿草幼苗的SOD平均活性遠(yuǎn)高于ZD，且二者間差異達(dá)到極顯著水平；2個垂穗披堿草受UV-B輻射后的POD活性差異也并不顯著，CAT和GR的活性在UV-B處理下分別出現(xiàn)了顯著降低和顯著提高，且以ZD垂穗披堿草幼苗的變化最為顯著，可能是ZD體內(nèi)較低的SOD活性和較高的產(chǎn)生速率共同作用而致。而結(jié)果中二者的GR活性則均呈現(xiàn)出增加趨勢的現(xiàn)象，與許多前人研究得出的結(jié)果[35,37]類似，這也是GR積極響應(yīng)植物機(jī)體代謝途徑從而保護(hù)植物不受氧化脅迫的體現(xiàn)。垂穗披堿草體內(nèi)的抗氧化酶活性水平與抗UV-B輻射的能力有關(guān)，從抗氧化物酶水平受UV-B輻射的影響程度來看，也是XZ垂穗披堿草的抗UV-B輻射能力更強(qiáng)。

4 結(jié)論

綜上，UV-B不同程度地影響ZD和XZ垂穗披堿草幼苗的生長和抗氧化物酶活性。與ZD垂穗披堿草相比，西藏野生種XZ的植株形態(tài)和生理指標(biāo)受UV-B輻射影響較小，可見其對UV-B輻射具有較高的抗性，這可能與其較為穩(wěn)定的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如LOX活性等)以及保持在較高水平的SOD活性等有關(guān)。