李雙銘, 徐慶國, 楊 勇, 劉雪勇, 羅建章, 向佐湘, 胡龍興*

(1. 湖南涉外經(jīng)濟學院， 湖南 長沙 410205； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院草業(yè)科學系， 湖南 長沙 410128; 3. 長沙學院， 湖南 長沙 410022)

結縷草(ZoysiaWilld) 屬于禾本科結縷草屬多年生草坪草種，廣泛分布在熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區(qū)。在我國，結縷草的分布北至東北的遼寧、吉林和華北的山東、河南，南至華南的廣東、海南等地，具有抗旱、耐鹽、耐踐踏、低養(yǎng)護等諸多優(yōu)良特性，廣泛應用于城市園林綠化、運動場草坪、高爾夫球場、固土護坡和水土保持[1-2]。但結縷草為暖季型草坪草，其最適生長溫為26～36℃，低于12℃時就會休眠，零下溫度常造成凍害。因此，低溫是影響結縷草地理分布、草坪質量和推廣應用的主要限制因素[3]。

細胞膜是植物體細胞及細胞器與外界環(huán)境之間進行物質和能量交換的場所，同時也是細胞感應外界環(huán)境中各種逆境脅迫信號的細胞結構[4]。冷害和凍害常誘導植物體內活性氧(Reactive oxygen species，ROS)如O2-.、H2O2等顯著積累而造成細胞膜系統(tǒng)受到破壞，而植物體內存在有效清除ROS的酶保護系統(tǒng)如超氧化物歧化酶(Super oxidase dismutase,SOD)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)和過氧化氫酶(Catalase,CAT)等，可通過其含量或活性的增加來保護細胞膜免于ROS的傷害，使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境傷害[5]。舒必超等研究表明，低溫脅迫下狗牙根(Cynodondactylon)葉片抗氧化酶活性顯著升高，其中耐寒性好的運動百幕大(Cynodondactylon×C.transvalensis‘Tifsport’)升高更顯著[6]。已有的研究表明，細胞膜的結構及其穩(wěn)定性與植物對低溫脅迫的適應性密切相關，其耐寒性的大小主要體現(xiàn)在細胞膜的特性上，如膜脂的流動性和不飽和度，而脂肪酸是膜脂的主要成分[4]。脂肪酸含量的變化及其不飽和度與耐寒性的關系在多種植物中已有研究報道[7-10]。膜脂相變程度與不同脂肪酸的含量及比例關系密切，通常研究者都認為，植物的膜脂相變溫度降低是由于不飽和脂肪酸含量的增高，從而增加了膜的流動性，使得植物的耐寒性增加；因此，膜不飽和脂肪酸指數(shù)(Index of unsaturated fatty acid,IUFA)，即不飽和脂肪酸在總脂肪酸中的相對比值，可作為衡量植物抗冷性的重要生理指標[11]。

結縷草喜溫暖濕潤氣候，具有較強的耐熱性，抗寒性較差，但不同地理來源的結縷草由于其遺傳背景的不同而耐寒性差異較大，研究不同地理來源結縷草的低溫脅迫生理，對擴大其栽培區(qū)域具有重要的理論意義和實踐應用價值。關于結縷草低溫脅迫下的生理響應，前人大多只從冷害處理或凍害處理方面進行了研究探討[12-18]，但多個連續(xù)低溫處理的研究國內外報道較少，而自然界草坪草在秋冬季常處于一個逐漸從最適生長溫度、亞適溫、冷害和凍害逐漸降溫的過程。本試驗以采自我國不同地理來源的結縷草為材料，研究在人工控制梯度降溫條件下其葉片的抗性生理指標及脂肪酸含量的變化，以期闡明不同地理來源的結縷草在低溫脅迫下抗寒性相關生理指標的動態(tài)變化及其差異，為結縷草抗寒性的鑒定提供參考依據(jù)以及為優(yōu)異耐寒新品系的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

本研究根據(jù)前期研究結果[19]，選擇兩個不同緯度來源的結縷草品種為研究對象，分別為Latitude-40(LT-40，來源于遼寧)和Latitude-22(LT-22，來源于廣東)。

1.2 試驗設計與處理

兩個結縷草品種材料于2018年4月分別用草莖擴繁種植于湖南農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學系教學科研試驗基地。2018年7月，挖取致密的草皮塊洗凈其根部泥土，種植于裝填了1.2 kg河沙和市售花土(體積比為1:1)混合基質的塑料盆中，盆的上口徑為18 cm、下口徑15 cm、高20 cm。每個基因型材料種植16盆(4個處理×4次重復)，共計32盆，放置于湖南農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學系教學科研試驗基地玻璃溫室中培養(yǎng)。根據(jù)土壤基質水分狀況及時補充水分以保持水壤濕潤，每3天修剪一次保持冠層高度約為5 cm，每周每盆澆1/2Hongland養(yǎng)液200 ml。

在溫室中培養(yǎng)約45天冠層基本建成后，將各盆栽材料轉入人工氣候箱中按圖1所示進行梯度降溫處理：(1)適溫處理。初始溫度30℃/25℃(晝/夜)處理5 d；(2)亞適溫處理。經(jīng)初始處理材料再將氣候箱溫度降為18℃/12℃(晝/夜)處理5 d；(3)冷害處理。經(jīng)初始和亞適溫處理材料再在8℃/2℃(晝/夜)處理5 d；(4)凍害處理。經(jīng)初始、亞適溫和冷害處理材料再轉入溫度設為2℃/—4℃的生長箱中處理5 d。人工氣候箱相對濕度設為65%～75%，12 h光照時間和12 000 lx的光照強度。各處理設4次重復(4盆)，在各梯度降溫處理結束時，每盆取植株功能葉片混勻，其中一部分葉樣用于測定其電導率和葉綠素含量；另一部分鮮葉樣在液氮速凍后保存于—80℃冰箱，用于抗氧化酶活性和脂肪酸含量的測定分析。

圖1 溫度處理及取樣時間示意圖Fig.1 The schematic diagram for the temperature treatment and sampling date

1.3 測定項目與方法

(1)細胞膜穩(wěn)定性：用電導率(Electrolyte leakage,EL)表示，稱取約0.1 g葉片，去離子水沖洗兩次后剪成約1 cm的小段置于50 ml的離心管中，加去離子水10 ml后在搖床上以200 rpm振蕩24 h后測電導率(E1)，然后在高壓滅菌鍋中121℃滅菌15 min，待冷卻至室溫后測電導率(E2)，相對電導率(%)=[(E2-E1)/E2]×100。

(2)葉綠素含量(Chl)：用二甲基亞砜在室溫避光條件下浸提48 h后，采用分光光度計法于波長663、645和470 nm下測定吸光值[20]。

(3)丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活性測定：稱取約0.2 g新鮮葉片，用預冷的研缽研成粉后加3 ml預冷的酶提取液(50 mmol·L-1pH7.8的磷酸緩沖液)勻漿，勻漿經(jīng)在4℃，12 000 rpm離心15 min，轉移上清液至新的試管中用于MDA含量和抗氧化酶活性的測定。MDA采用硫代巴比妥酸法測定，SOD活性測定采用氮藍四唑NBT光化還原法，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法，CAT活性采用過氧化氫法測定，可溶性蛋白含量采用考瑪斯亮藍法測定，酶活性單位均以單位蛋白含量的酶活性表示[21]。

(4)脂肪酸提取與測定：參考Zhang[22]的方法進行。取0.2 g鮮樣用液氮研磨后轉至離心管中，加1 ml提取液(用甲醇配制的0.1 N鹽酸，含5%的2,2-二甲氧基丙烷)，同時添加十七碳酸(17:0)作為內標，在80℃水浴條件下提取90 min后冷確至室溫，然后分別先后加入1 ml 0.5%的NaCl和1.5 ml己烷后渦旋30 s，在5 000 rpm離心5 min，將分層后的己烷層轉移至新的試管中用于脂肪酸的測定。提取后的脂肪酸按Zhang[22]的方法，采用安捷倫5890A氣相色譜儀進行測定分析，脂肪酸含量以單個脂肪酸占所測總脂肪酸含量的百分比表示，脂肪酸不飽和指數(shù)(IUFA)計算公式為：

IUFA=0×([16∶0]+[18∶0])+1×([16∶1]+[18∶1])+2×([16∶2]+[18∶2])+3×[18∶3]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS for Windows (9.0版本)軟件進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用單因素方差分析，同溫度處理下兩個基因型間的差異采用t檢測，同基因型不同溫度間的差異采用Ducuan式多重比較檢驗(P<0.05).

2 結果與分析

2.1 低溫對結縷草葉片細胞膜穩(wěn)定性的影響

隨著溫度的降低，兩種結縷草葉片電導率均呈上升趨勢，但在亞適溫下兩個基因型葉片的電導率與適溫對照相比均無顯著性差異(圖2)；與適溫對照相比，冷害和凍害條件下兩個基因型葉片的電導率均顯著升高，但LT-40顯著低于LT-22，其中高緯度基因型LT-40的葉片電導率升高至適溫對照的4.5和8.5倍，而低緯度基因型LT-22則分別升高至適溫對照的6.1和9.2倍(圖2)。

圖2 低溫脅迫對不同緯度來源結縷草葉片電導率的影響Fig.2 Effect of low temperature stress on electrolyte leakage in the leaf of zoysiagrass collected from different latitudes注：圖柱上標注不相同小寫字母表示同基因型不同溫度處理間具有顯著性差異，*表示同一溫度理處下兩個基因型材料間具有顯著性差異(P<0.05)，下同Note:Vertical bars marked with different lower-case letters indicate significant difference among temperature treatment in a given genotype, bars marked with * indicate significant difference between two genotypes in a given temperature treatment at the 0.05 level,the same as below

2.2 低溫對結縷草葉綠素含量的影響

兩種結縷草葉綠素含量均隨著處理溫度的降低而呈下降趨勢(圖3)。高緯度基因型LT-40在亞適溫、冷害和凍害溫度處理下的葉綠素含量分別下降至適溫對照的89%，71%和46%，而低緯度基因型LT-22的葉綠素含量則分別下降至適溫對照的75%，41%和27%；在冷害和凍害條件下，高緯度基因型LT-40的葉綠素含量顯著高于低緯度基因型LT-22(圖3)。

圖3 低溫脅迫對不同緯度來源結縷草葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of low temperature stress on leaf chlorophyll content in zoysiagrass collected from different latitude

2.3 低溫對結縷草葉片丙二醛含量的影響

兩種結縷草葉片MDA含量均隨著處理溫度的下降而顯著升高(圖4)。高緯度基因型LT-40葉片的MDA含量在亞適溫、冷害和凍害溫度處理條件下分別升高至適溫對照的1.3，1.8和2.5倍，而低緯度基因型LT-22則分別升高至適溫對照的1.6，2.4和3.3倍；在冷害和凍害條件下，高緯度基因型結縷草LT-40葉片的MDA含量均顯著低于低緯度基因型結縷草LT-22(圖4)。

圖4 低溫脅迫對不同緯度來源結縷草葉片丙二醛含量的影響Fig.4 Effect of low temperature stress on MDA content in zoysiagrass collected from different latitude

2.4 低溫對結縷草葉片抗氧化酶活性的影響

由表1可知隨著處理溫度的下降，兩個不同緯度來源的結縷草葉片SOD活性均顯著升高。在亞適溫、冷害和凍害條件下，低緯度基因型LT-22的SOD活性分別升高至適溫對照的1.28，1.8和2.3倍，而高緯度基因型LT-40的SOD活性則分別升高至適溫對照的1.3，2.2和3.2倍。

兩個不同緯度來源結縷草葉片POD活性均隨著處理溫度的降低而顯著升高，在亞適溫、冷害和凍害條件下，低緯度基因型LT-22的POD活性分別升高至適溫對照的1.1，2.1和2.5倍，而高緯度基因型LT-40的POD活性則分別升高至適溫對照的1.7，2.9和4.0倍。

隨著處理溫度的下降，兩個不同緯度來源的結縷草葉片CAT活性均顯著升高。在亞適溫、冷害和凍害條件下，低緯度基因型LT-22的CAT活性分別升高至適溫對照的1.28，1.8和2.3倍，而高緯度基因型LT-40的CAT活性則分別升高至適溫對照的1.3，2.2和3.2倍。

在亞適溫、冷害和凍害條件下，高緯度基因型LT-40的CAT活性顯著高于低緯度基因型LT-22，而SOD和POD活性則僅在冷害和凍害下高于LT-22。

2.5 低溫對結縷草葉片脂肪酸含量的影響

結縷草葉片的膜脂脂肪酸主要由棕櫚酸(16∶0)、棕櫚油酸(16∶1)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)和亞麻酸(18∶3)6種脂肪酸組成。其中，飽和脂肪酸以棕櫚酸為主，占總脂肪酸的13.5%～28.5%；而不飽和脂肪酸中以亞麻酸的相對含量最高，占總脂肪酸的43.6%～62.6%。

由表2可知，隨著溫度的降低，飽和脂肪酸中的棕櫚酸在不同緯度來源的結縷草中均呈下降趨勢，其中在高緯度基因型LT-40中下降更為顯著，在亞適溫、冷害和凍害條件下LT22的棕櫚酸相對含量顯著高于LT-40；隨著溫度的下降，飽和脂肪酸中的硬脂酸在低緯度基因型LT-22中無顯著變化，但在高緯度基因型LT-40中則顯著下降。

隨著處理溫度的下降，不飽和脂肪酸中的棕櫚油酸、油酸和亞麻酸在低緯度基因型LT-22中均無顯著變化；在高緯度基因型LT-40中，棕櫚油酸、油酸的相對含量在凍害條件下顯著低于適溫，在亞適溫和冷害條件下則無顯著變化，而亞麻酸的相對含量在冷害和凍害條件下顯著高于適溫和亞適溫處理，亞適溫條件下的亞麻酸含量與適溫相比無顯著差異。

在適溫、亞適溫、冷害和凍害四個溫度處理條件下，脂肪酸的不飽和指數(shù)在低緯度基因型LT-22中均無顯著變，而在高緯度基因型LT-40中則隨著處理溫度的降低而呈上升趨勢，`其中在冷害和凍害溫度處理下的不飽和指數(shù)顯著高于適溫對照。

表1 低溫脅迫對不同緯度來源結縷草葉片抗氧化酶活性的影響Table 1 Effect of low temperature stress on leaf antioxidant enzyme activity in zoysiagrass collected from different latitude / U.min-1.mg-1 protein

注：同行中不同大寫字母表示同一基因型在不同溫度處理下差異顯著(Duncan’s多重比較，P<0.05)，同列中不同小寫字母表示同一溫度處理下不同基因型之間差異顯著(t檢驗，P<0.05)。下同

Note:Means in a row followed by different upper-case letters indicate significant difference among temperature treatments in a genotype,values followed by the different lower-case letters in a column indicate significant difference between two genotypes within a temperature treatment with t-test at the 0.05 level. The same as below

表2 低溫對結縷草葉片脂肪酸含量的影響Table 2 Effect of low temperature on fatty acid content in leaves of zoysiagrass/%

3 討論

在南北氣候過渡帶區(qū)域，冷害和凍害是暖季型草坪草常面臨的環(huán)境逆境。當自然環(huán)境溫度下降到最適生長溫度以下時草坪草生長減緩，草坪質量下降，當溫度降低到10℃以下時常發(fā)生冷害和凍害，但不同地理緯度來源的草坪草在自然選擇和進化過程中逐漸形成了相應的適應機制而耐寒性差異較大[13-15]。婁燕宏等[23]通過在大田自然降溫條件下對不同地理來源的狗牙根研究表明，高緯度來源的狗牙根具有較強的耐寒性。孫建明等[24]通過對在自然環(huán)境零下溫度條件下不同地理來源日本結縷草的低溫響應研究表明，來源于高緯度的日本結縷草具有較高的脯氨酸和可溶性糖含量而具有較好的耐低溫能力。本試驗通過人工控制模擬自然降溫過程，研究了不同緯度來源的結縷草基因型對低溫脅迫的響應，結果顯示在低溫處理下高緯度來源的基因型LT-40具有較高的細胞膜穩(wěn)定性和較低的膜脂過氧化水平，葉綠素含量較高，表明緯度來源與結縷草的耐寒性密切相關，高緯度來源的結縷草具有較好的耐寒能力，這與婁燕宏等[23]和孫建明等[24]在大田自然環(huán)境條件下對草坪草的研究結果一致。

在正常生長條件下，植物體內ROS的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡而不會導致植物細胞膜受到傷害。但在低溫逆境條件下，這種動態(tài)平衡常被打破而產(chǎn)生大量的ROS，造成細胞膜脂過氧化反應，導致質膜系統(tǒng)的損傷[25]。植物體為保護自身免受ROS的傷害，細胞內存在SOD,POD和CAT等抗氧化系統(tǒng)，使體內活性氧保持動態(tài)平衡，從而減輕或緩解逆境傷害[2]。在本研究中，兩個不同緯度來源的結縷草在低溫條件下，葉片的SOD,POD和CAT三種酶活性均顯著上升，表明低溫脅迫誘導了結縷草植株體內抗氧化防御系統(tǒng)的增強而提高了自身清除氧自由基的能力以減輕低溫對細胞膜的傷害。其中，來源于高緯度的結縷草LT-40在低溫條件下葉片的SOD,POD和CAT表現(xiàn)出更強的活性，表明高緯度來源的結縷草具有更好的耐低溫能力，這與舒必超等[6]和孫宗玖等[26]在狗牙根以及付娟娟等[27]在披堿草中的研究結果相一致，在低溫脅迫下抗寒性強的品種或材料具有較高的抗氧化酶活性。高緯度來源的結縷草具有更好的耐寒性，這可能是由于高緯度地區(qū)溫度較低，長期的低溫鍛煉和適應使其具有相對發(fā)達的抗氧化防御系統(tǒng)及其對低溫脅迫具有較高的響應水平有關[23-24]。但是，目前對植物在低溫脅迫下抗氧化酶活性的研究結論仍存有差異。周艷虹等[28]在黃瓜幼苗中研究表明，在低溫處理后SOD、POD活性上升，而彭金光等[29]在西瓜中研究認為，低溫提高了耐性品種SOD,POD活性，而在敏感品種中則呈現(xiàn)先增后減的趨勢。Back等[30]研究表明，短期的低溫鍛煉誘導了抗氧化酶活性的升高，有利于提高植株的抗寒性。玉米幼苗在短期低溫脅迫(2～3 d)下SOD和POD活性上升，而CAT活性則下降，較長時間脅迫(7 d)下SOD,POD和CAT活性均顯著下降[31]。這些在低溫脅迫下抗氧化酶活性的變化差異可能與植物種類、耐性、脅迫溫度和時間長短等不同有關。

植物體與外界環(huán)境相互作用時，生物膜是植物接受外界環(huán)境信息的受體，因而質膜的生理生化特性的變化是植物抵抗環(huán)境脅迫能力的直接反映[32]。本研究結果顯示，隨著溫度的下降，結縷草葉片脂肪酸組分中飽和脂肪酸棕櫚酸在兩個基因型中呈下降趨勢，不飽和脂肪酸中的亞麻酸在高緯度基因型LT-40中顯著提高；低溫脅迫下不飽和脂肪酸尤其是亞麻酸含量增加，這與前人在海濱雀稗[33]、冬青[34]的研究結果一致。不飽和脂肪酸含量與脂肪酸的不飽和指數(shù)直接相關，而不飽和指數(shù)直接影響質膜的流動性[32]。低溫脅迫下結縷草葉片不飽和脂肪酸含量的升高有利于增加脂肪酸不飽和度和不飽和指數(shù)，從而維持膜的穩(wěn)定性和流動性。脂肪酸不飽和指數(shù)在低緯度基因型LT-22中均無顯著變化，而在高緯度基因型LT-40中則隨著溫度的降低而顯著升高，表明不飽和脂肪酸的含量和不飽和指數(shù)與結縷草的耐寒性密切相關。張瑋等[35]研究表明，耐寒性弱的竹子在低溫下的不飽和脂肪酸含量及變化相對較低，且低溫馴化對竹種耐寒性的累積提高是一個關鍵過程。低溫脅迫可改變植物質膜脂肪酸的含量和組成比例，已有的研究大多數(shù)認為，低溫馴化(鍛煉)可以提高不飽和脂肪酸含量和不飽和脂肪酸指數(shù)，且與植物的耐寒性密切相關[7-10,36]。在本研究中，我們采用從適溫到亞適溫，再到冷害和凍害逐漸降溫的過程，對結縷草的耐寒性起到了馴化的作用，尤其是對來源于高緯度的結縷草，在降溫的過程逐漸通過提高不飽和脂肪酸含量和不飽和指數(shù)來提高細胞內束縛水含量而穩(wěn)定細胞內水分，維持原生質結構，防止結冰脫水而造成機械損傷，從而提高了耐低溫能力[32]。

4 結論

低溫脅迫可造成結縷草葉片細胞膜穩(wěn)定性喪失，電導率和MDA含量升高，葉片衰老而葉綠含量下降，進而影響結縷草的正常生長發(fā)育和草坪質量，同時造成細胞內自由基的平衡被破壞而誘導抗氧化酶活性的升高。來源于高緯度的結縷草在低溫下具有較好的耐寒性，主要與其具有較高的不飽和脂肪酸亞麻酸含量和較高的脂肪酸不飽和指數(shù)有關，表現(xiàn)出更強的膜流動性和穩(wěn)定性，以及抗氧化防御保護系統(tǒng)，因而其耐寒能力要顯著高于低緯度來源的結縷草。