周兆明 馬思聰 文磊 成杰 劉浩 陳龍華 周美娟 周平坤 蔡林波 周成

1廣東三九腦科醫(yī)院腫瘤科，廣州 510510；2德國(guó)癌癥研究中心，海德堡69120；3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科 200127；4南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)系，廣州 510515；5南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科，廣州 510515；6軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

以X射線為代表的光子射線在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像學(xué)檢查與腫瘤治療中有著不可替代的作用[1]，包括CT、數(shù)字化X射線成像在內(nèi)的多種影像學(xué)檢查已成為各種胸部、縱膈、心血管疾病以及介入治療中最常用的輔助檢查手段。值得注意的是：一方面，隨之而來的正常組織射線暴露風(fēng)險(xiǎn)近年來也被廣泛關(guān)注[2]；另一方面，放療是肺癌及縱膈腫瘤、淋巴瘤的重要治療手段之一。放射性肺損傷（radiationinduced lung injury, RILI）是胸部放療的常見并發(fā)癥，也是限制腫瘤根治劑量的關(guān)鍵因素之一[3-4]。肺部作為輻射敏感器官，經(jīng)電離射線作用后可能引起放射性肺炎及肺纖維化等并發(fā)癥[5-6]。

目前，臨床上或輻射防護(hù)領(lǐng)域仍然缺乏有效監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)RILI晚期改變的分子生物學(xué)標(biāo)志物。當(dāng)前對(duì)放射性肺炎或合并肺纖維化疾病的診斷主要依賴于臨床生化指標(biāo)、影像學(xué)以及肺功能等檢查手段。受肺部的代償功能影響，這些常規(guī)檢查往往在靈敏度、特異度方面相對(duì)不足，而且結(jié)果容易出現(xiàn)滯后性，尚不能及時(shí)、準(zhǔn)確地反映晚期慢性肺部病理生理學(xué)改變。纖維支氣管鏡結(jié)合有效基因標(biāo)志物檢查可顯著提高早期輻射相關(guān)肺損傷的檢出率，從而為肺損傷相關(guān)疾病的精準(zhǔn)診療提供有力證據(jù)。此外，RILI小鼠模型因其與人類有極為相似的慢性炎癥和纖維發(fā)生改變特征，是研究放射性肺部不良反應(yīng)、特發(fā)性肺纖維化等疑難疾病機(jī)制的理想模型。本研究基于不同劑量X射線全肺野照射晚期小鼠肺組織，使用全基因組芯片研究輻射相關(guān)的差異表達(dá)基因，結(jié)合信號(hào)通路富集分析探討RILI潛在的基因標(biāo)志物，并進(jìn)行數(shù)學(xué)建模來預(yù)測(cè)與提示放射性肺疾病的發(fā)生、發(fā)展程度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及照射

8周齡C57BL6雌性小鼠共96只，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002]，無特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度(23±1)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，壓力差≤10 Pa，每日光照12 h，自由攝食飲水。①X射線單次照射實(shí)驗(yàn)共分3組（12只/組）：對(duì)照組（未接受照射）、中等劑量組（MD組，小鼠接受10 Gy單次照射）、高劑量組（HD組，小鼠接受20 Gy單次照射）。②X射線全肺野分次劑量爬坡（梯度劑量照射）實(shí)驗(yàn)共分5組（12只/組）：未接受照射（0 Gy組）、5次3 Gy照射（15 Gy組）、5次4 Gy照射（20 Gy組）、5次6 Gy照射（30 Gy組）和5次8 Gy照射（40 Gy組）。每日照射1次，連續(xù)照射5 d。使用異氟烷誘導(dǎo)配合氯胺酮麻醉小鼠，妥善固定后采用醫(yī)用直線加速器（德國(guó)西門子公司，6MVX型）進(jìn)行全肺野照射，劑量率為3 Gy/min。

1.2 RNA樣本的處理及檢測(cè)

所有小鼠均于照射后24周予以斷頸處死，取新鮮肺部組織并用TRIzol試劑（賽默飛世爾中國(guó)）處理，置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。采用RNeasy Mini Kit （德國(guó)Qiagen公司）提取肺部RNA，使用DNase I（德國(guó)Qiagen公司）去除DNA，排除DNA污染，無核酸酶水洗脫純化RNA，樣本置于-20°C冰箱凍存?zhèn)溆?。采用NanoDrop ND-1000 分光光度計(jì)（德國(guó)PEQlab GmbH公司）初步測(cè)定RNA濃度，使用美國(guó)安捷倫科技（中國(guó)）有限公司的2100生化分析儀進(jìn)一步測(cè)定RNA濃度以確認(rèn)樣本的完整性和純度。采用全基因組表達(dá)芯片（美國(guó)Illumina公司的小鼠Sentrix-6 V2 全基因組芯片,BD-201-0202）進(jìn)行RNA檢測(cè)，使用自帶軟件包處理芯片信號(hào)并生成基因表達(dá)矩陣。

1.3 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換與差異基因的分析

采用R語言軟件（3.4.2版本）進(jìn)行基因表達(dá)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，使用Limma軟件包[7]進(jìn)行數(shù)據(jù)背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)匯總并報(bào)告差異表達(dá)基因，包括表達(dá)值log2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，設(shè)定基因表達(dá)變化倍數(shù)（fold change, FC）≥2，即log2(FC)＞1或log2(FC)＜-1，且P＜0.05為差異表達(dá)基因，得到小鼠受到不同劑量X射線照射后肺部差異表達(dá)基因，所有熱圖的圖例均為log2（FC）值。使用R語言軟件包對(duì)差異基因進(jìn)行聚類分析，分析小鼠在接受梯度X射線照射后上述差異基因的表達(dá)情況。

1.4 質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)

使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)裂解物，將得到的凝膠切成13個(gè)切片，用胰蛋白酶消化并依文獻(xiàn)[8]所述進(jìn)行質(zhì)譜分析，即蛋白提取后，使用納升級(jí)超高效液相色譜（美國(guó)特世公司）連接至美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司的LTQ Orbitrap質(zhì)量分析器，將所得肽混合物進(jìn)行在線偶聯(lián)。使用MaxQuant軟件（http://www.coxdocs.org，版本1.5.3.8）和小鼠UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）分析串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）原始數(shù)據(jù)。使用MaxQuant內(nèi)置MaxLFQ算法進(jìn)行蛋白定量并采用Perseus軟件（http://www.coxdocs.org，版本1.5.2.4）進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和評(píng)估。

1.5 基因表達(dá)劑量-效應(yīng)曲線

為進(jìn)一步驗(yàn)證與研究基因標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平的改變與輻射劑量的直接關(guān)聯(lián)，對(duì)小鼠進(jìn)行分次梯度劑量照射后，小鼠肺部上述RILI特征性基因標(biāo)志物表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證與數(shù)學(xué)建模，采用Mathematica 8.0軟件（http://www.wolfram.com/mathematica）與OriginPro 8.0軟件 （https://www.originlab.com）進(jìn)行建模。根據(jù)基因芯片結(jié)果，分別取上調(diào)、下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄水平改變log2（FC）的平均值為縱坐標(biāo)，不同梯度照射劑量為橫坐標(biāo)，建立劑量-效應(yīng)曲線。上調(diào)基因表達(dá)水平與X射線劑量關(guān)系擬合方程式為y = A1 + (A2-A1)/(1 + 10^((LOGx0-x)*p))，其中A1 = -0.06553±0.18433（最低點(diǎn)），A2 =1.48593±0.15206 (最高點(diǎn))，LOGx0=19.9841±2.74032 (中心點(diǎn))，p=0.07618±0.0284 (曲線斜率)。下調(diào)基因表達(dá)水平與X射線劑量呈明顯負(fù)相關(guān)，擬合方程式為y=a+b*x，其中a= 0.02218±0.13125(截距) 、b=-0.03551±0.00434(斜率)。

1.6 生物信息學(xué)分析

對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行基因集富集分析[9]，進(jìn)行基因本體論[10]與京都基因和基因組百科全書通路[11]的基因集富集分析，采用聚類分析識(shí)別相關(guān)基因的表達(dá)水平。采用R語言軟件clusterProfiler軟件包[12]進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以P＜0.01且Q＜0.01作為篩選條件，使用ggplot2軟件包作圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Limma軟件包[7]中經(jīng)典貝葉斯檢驗(yàn)方法進(jìn)行組間差異表達(dá)基因分析，采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行輻射劑量相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析及作圖。采用線性回歸模型分析兩組獨(dú)立數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)程度，以皮爾森R2表示兩者關(guān)聯(lián)系數(shù)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RILI差異表達(dá)基因的篩選

不同劑量X射線照射后小鼠肺組織基因芯片的分析結(jié)果顯示，MD組出現(xiàn)125個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中32個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、93個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖1中A、C、D）。HD組接受單次照射后，基因表達(dá)差異表現(xiàn)更為明顯，共出現(xiàn)414個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中263個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、151個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖1中B、E、F）。

2.2 RILI基因標(biāo)志物的分析結(jié)果

對(duì)MD組、HD組小鼠已篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行韋恩圖分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13個(gè)共同差異表達(dá)基因（圖2中A）。選取其中差異性表達(dá)最顯著的5個(gè)基因作為RILI潛在特征性基因標(biāo)志物，包括3個(gè)顯著上調(diào)基因[PH同源域家族A成員3（pleckstrin homology like domain family A member 3，Phlda3）、纖維蛋白原γ鏈（fibrinogen gamma chain，F(xiàn)gg）、激肽原1（kininogen 1，Kng1）]和2個(gè)下調(diào)基因[蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，B型受體（protein tyrosine phosphatase, receptor type B，Ptprb），KIT原癌基因受體酪氨酸激酶（KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase，Kit）]（表1）。該基因標(biāo)志物組合在不同劑量照射組的表達(dá)趨勢(shì)差異明顯（圖2中B-C）。選取其中兩個(gè)上調(diào)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)驗(yàn)證后結(jié)果顯示，HD組相比對(duì)照組Fgg 、Kng1的表達(dá)差異倍數(shù)上升約為2倍左右（圖2中D）。

圖1 中等劑量（MD）組、高劑量（HD）組差異表達(dá)基因的火山圖（A-B）與基因表達(dá)熱圖（C-F） 圖中，MD組：10 Gy單次照射；FC：變化倍數(shù)；HD組：20 Gy單次照射。Fig.1 Volcano plots(A-B) and heatmaps of differentially expressed genes (C-F) in medium dose(MD) and high dose(HD) groups

2.3 基于RILI基因標(biāo)志物表達(dá)水平的數(shù)學(xué)建模

梯度劑量照射后肺組織基因芯片結(jié)果顯示，3個(gè)特征性上調(diào)表達(dá)基因（Phlda3、Fgg、Kng1）均隨X射線劑量的增加而表達(dá)增強(qiáng)；2個(gè)特征性下調(diào)表達(dá)基因（Ptprb、Kit）則隨劑量的上升而表達(dá)降低（圖3中A）。這一結(jié)果與單次照射實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示該基因標(biāo)志物組合對(duì)不同劑量、不同分次X射線照射均具有較強(qiáng)的輻射敏感性。上調(diào)基因（Phlda3、Fgg、Kng1）的平均值通過邏輯回歸模型建模，模型擬合程度較高（χ2=11.66,R2=0.88）（圖3中B）。下調(diào)基因（Ptprb、Kit）進(jìn)行線性回歸分析后結(jié)果顯示，下調(diào)基因表達(dá)水平與X射線劑量呈明顯負(fù)相關(guān)（R=-0.95，R2=0.89）（圖3中C）。

圖2 MD組和HD組共同差異表達(dá)基因分析結(jié)果 圖中，A：韋恩圖分析獲得13個(gè)差異基因；B：表達(dá)熱圖及聚類分析(對(duì)照組：未接受照射；MD組: 10 Gy單次照射；HD組：20 Gy單次照射)；C：MD、HD組共同差異基因與對(duì)照組比較的表達(dá)倍數(shù)變化。D：HD組與對(duì)照組Kng1 、Fgg蛋白表達(dá)水平的比較。Phlda3：PH同源域家族A成員3；Fgg：纖維蛋白原γ鏈；Kng1：激肽原1；Ptprb：蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，B型受體；Kit：KIT原癌基因受體酪氨酸激酶。Fig.2 Analysis of common difference genes in medium dose(MD) and high dose(HD) groups

表1 小鼠經(jīng)X線全肺野照射后MD、HD組最顯著共同表達(dá)基因的信息Table 1 The most significant co-expression genes in medium dose(MD) and high dose(HD) groups after whole lung X-ray irradiation in mice

圖3 顯著差異基因表達(dá)差異倍數(shù)與梯度X射線照射劑量的相關(guān)性分析 圖中，A：基因表達(dá)熱圖；B、C： 差異表達(dá)基因與分次照射劑量擬合曲線。0 Gy組：未接受照射；15 Gy組：5次3 Gy照射；20 Gy組：5次4 Gy照射；30 Gy組：5次6 Gy照射；40 Gy組；5次8 Gy照射。Phlda3：PH同源域家族A成員3；Fgg：纖維蛋白原γ鏈；Kng1：激肽原1；Ptprb：蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，B型受體；Kit：KIT原癌基因受體酪氨酸激酶。Fig.3 Correlation analysis between expression fold changes of difference genes and gradient X-ray exposure dose

2.4 基因集富集分析

2.4.1 KEGG通路集富集分析

對(duì)MD組和HD組小鼠基因表達(dá)水平進(jìn)行KEGG通路基因集富集分析，結(jié)果顯示2組小鼠上調(diào)表達(dá)差異基因在p53、氧化磷酸化等多條信號(hào)通路出現(xiàn)富集（圖4中A），這提示X射線照射后小鼠肺部可能出現(xiàn)上述信號(hào)通路上調(diào)。p53信號(hào)通路先導(dǎo)基因分析結(jié)果顯示，MD、HD組分別有23個(gè)、26個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)對(duì)p53信號(hào)通路上調(diào)產(chǎn)生作用（圖4中B、C）。

2.4.2 基因本體論基因集富集分析

對(duì)HD組小鼠基因表達(dá)水平進(jìn)行基因本體論生物學(xué)功能基因集富集分析，結(jié)果顯示上調(diào)基因富集于固有免疫反應(yīng)激活生物學(xué)過程（圖5中A），下調(diào)基因則富集于肺部發(fā)育和氣管發(fā)育等生物學(xué)過程（圖5中B、C）。先導(dǎo)基因分析結(jié)果顯示，49個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)對(duì)激活固有免疫反應(yīng)生物學(xué)過程產(chǎn)生作用，分別有11個(gè)基因、12 個(gè)基因的下調(diào)表達(dá)對(duì)抑制肺泡發(fā)育及肺細(xì)胞分化的生物學(xué)過程產(chǎn)生作用。

3 討論

針對(duì)疾病進(jìn)展過程尋找可靠的生物標(biāo)志物是“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”不可或缺的組成部分。基因標(biāo)志物作為最直接快速有效的診斷手段之一，其篩選與應(yīng)用可在疾病診斷、發(fā)展、治療以及療效監(jiān)測(cè)等多個(gè)方面發(fā)揮顯著作用。尋找放射性肺疾病相關(guān)基因標(biāo)志物一直以來也是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[13]。迄今為止，臨床和放射防護(hù)領(lǐng)域針對(duì)間質(zhì)性肺疾病的分子標(biāo)志物檢測(cè)主要依靠血清學(xué)或蛋白質(zhì)水平，如涎液化糖鏈抗原-6、表面活性蛋白A、基質(zhì)金屬蛋白酶7、骨橋蛋白和東氨蛋白酶等，尚未開展基于轉(zhuǎn)錄水平基因標(biāo)志物改變的肺損傷監(jiān)測(cè)和診斷[14-15]。本研究借助已建立成熟的小鼠RILI模型，為尋找可靠基因標(biāo)志物開展臨床前實(shí)驗(yàn)研究，分別從中、高等兩個(gè)輻照劑量入手，首先尋找肺組織輻射相關(guān)差異表達(dá)基因，并在此基礎(chǔ)上，根據(jù)已篩選出的敏感基因進(jìn)一步尋找RILI潛在的基因標(biāo)志物，并借助蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行蛋白水平的表達(dá)驗(yàn)證。

圖4 MD組和HD組基因表達(dá)KEGG通路基因集富集分析結(jié)果 圖中，A: KEGG通路集富集分析結(jié)果圖，紅色點(diǎn)代表上調(diào)通路，綠色點(diǎn)代表下調(diào)通路，點(diǎn)的大小代表富集于該信號(hào)通路的基因數(shù)目。NES>0表示該信號(hào)通路上調(diào)，NES<0表示該信號(hào)通路下調(diào)。B～C: p53信號(hào)通路富集分析結(jié)果圖及相關(guān)基因表達(dá)熱圖，深紅色至深藍(lán)色代表基因表達(dá)水平由高到低。對(duì)照組：未接受照射；MD組：10 Gy單次照射；HD組：20 Gy單次照射；NES：標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)。FDR：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。Fig.4 Gene set enrichment analysis for KEGG in high dose (HD), medium dose (MD) groups and heatmap for associated genes in certain pathways

臨床醫(yī)師根據(jù)經(jīng)典放射生物學(xué)4R原則（Repair，Reoxygenation，Redistribution ，Repopulation），普遍采用分次照射對(duì)腫瘤病灶進(jìn)行根治或姑息治療[16-17]。本研究第2部分實(shí)驗(yàn)?zāi)M分割照射的方式，采用梯度劑量爬坡、分次照射條件下的小鼠全肺野照射，對(duì)潛在RILI基因標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)該基因標(biāo)志物組合與輻射劑量具有顯著相關(guān)性。上述結(jié)論也為基于該敏感基因組合進(jìn)行劑量-效應(yīng)建模奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。擬合模型結(jié)果顯示，上調(diào)基因（Phlda3、Fgg、Kng1）平均表達(dá)倍數(shù)超過1倍以上提示有較嚴(yán)重的肺損傷風(fēng)險(xiǎn)，其對(duì)應(yīng)于約接受25 Gy（分5次照射）或以上劑量水平；當(dāng)下調(diào)基因組合（Ptprb、Kit）平均表達(dá)差異倍數(shù)減少超過0.75時(shí)，提示有嚴(yán)重肺損傷風(fēng)險(xiǎn)，其相對(duì)的輻射劑量也在25 Gy（分5次照射）水平。

近年來的研究報(bào)道，X射線在腫瘤放療過程中，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA造成損傷，同時(shí)也會(huì)造成炎癥激活及促有絲分裂等信號(hào)通路激活[18]。本實(shí)驗(yàn)采用基因集富集分析的方法，進(jìn)行了KEGG信號(hào)通路富集和基因本體論生物學(xué)功能基因富集分析，結(jié)果顯示上調(diào)表達(dá)的差異基因往往與凋亡、溶酶體及吞噬體等信號(hào)通路激活相關(guān)，可引起急性免疫應(yīng)答、白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、髓系白細(xì)胞增殖及其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答等一系列生物學(xué)過程激活。而下調(diào)表達(dá)的基因則富集于細(xì)胞代謝關(guān)鍵酶細(xì)胞色素P450，維生素A（抗腫瘤）代謝等諸多細(xì)胞代謝通路，這表明在高劑量X射線照射后，肺部細(xì)胞代謝通路受抑制。此外，肺部發(fā)育、氣管發(fā)育、上皮細(xì)胞增殖及血管發(fā)生等重要的肺部生物學(xué)過程，也受到抑制，上述信號(hào)通路及生物學(xué)過程提示了晚期RILI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

圖5 HD組基因表達(dá)的基因本體論生物學(xué)功能基因集富集分析結(jié)果 圖中，A：固有免疫反應(yīng)生活學(xué)過程相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)；B：肺泡發(fā)育生物學(xué)過程相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)；C：肺細(xì)胞分化生物學(xué)過程相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。基因表達(dá)熱圖中，深紅色至深藍(lán)色代表基因表達(dá)水平由高到低。GO：基因本體論；對(duì)照組：未接受照射；HD組：20 Gy單次照射；NES：標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)。FDR：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。Fig.5 Gene set enrichment analysis for GeneOntology terms in high dose (HD) group and heatmap for associated genes in certain biological processes

綜上所述，本研究通過全基因組芯片檢測(cè)X射線照射后24周小鼠肺部基因并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了可客觀反應(yīng)RILI嚴(yán)重程度的潛在基因標(biāo)志物，其中包括上調(diào)基因Phlda3、Fgg、Kng1與下調(diào)基因Ptprb、Kit。這些基因均屬首次報(bào)道，為將來開展臨床與輻射防護(hù)相關(guān)應(yīng)用奠定前臨床基礎(chǔ)。此外，差異表達(dá)基因的富集分析提示炎癥、凋亡等通路激活，細(xì)胞代謝、肺部發(fā)育等通路受到抑制，同時(shí)對(duì)引起上述信號(hào)通路和生物學(xué)過程變化的相關(guān)基因進(jìn)行了表達(dá)水平分析，確認(rèn)了相關(guān)信號(hào)通路和生物學(xué)過程的決定基因簇。這些與晚期RILI相關(guān)的差異表達(dá)基因、信號(hào)通路及生物學(xué)過程改變有關(guān)，為進(jìn)一步深入地研究RILI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。