覃開羽　吳敏　甘洋縈　張蓓　李俊偉　肖秀珍　張志

【摘?要】??目的：建立測定五味子合劑中五味子醇甲的含量測定方法。方法：采用HPLC法，色譜柱為Agilent EtlipseXDB-C18（5μm，4.6×150mm），流動相為乙腈-0.5%冰醋酸水溶液（60

∶40），流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為250nm，進(jìn)樣量為10μL，以外標(biāo)法定量。結(jié)果：五味子醇甲在進(jìn)樣量0.128～3.194μg之間與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，平均回收率為97.70%，RSD為1.6%（n=6）。結(jié)論：該法操作簡便快捷，重復(fù)性及穩(wěn)定性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為控制五味子合劑質(zhì)量的方法。

【關(guān)鍵詞】?五味子合劑;五味子醇甲;HPLC;含量測定

【中圖分類號】R284???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2019）11-0022-03

Determination of Schisandrin A in Wuweizi Mixture by HPLC

QIN Kaiyu1?WU Min1?GAN Yangying2?ZHANG Bei1?LI Junwei1?XIAO Xiuzhen1?ZHANG Zhi1*

1.Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangxi， Liuzhou 545001， China;?2.YuLin Center for Food and Drug Control，Yulin 537000，China

Abstract：Objective To establish a method for the determination of schisandrin A in Wuweizi Mixture.Methods The chromatographic column was Agilent Etlipse XDB-C18 （5μm，4.6×150mm）， the mobile phase was acetonitrile-0.5% glacial acetic acid aqueous solution （60∶40）， the flow rate was 1.0mL. min-1， the column temperature was 30℃， the detection wavelength was 250nm， the injection volume was 10μL， and the external standard method was used for quantitative analysis. Results There was a good linear relationship between schisandrin A and peak area in the range of 0.128～3.194μg. The correlation coefficient r=0.9993， the average recovery rate was 97.70%， and RSD was 1.6%（n=6）.Conclusions The method is simple， rapid， reproducible and stable. The results are accurate and reliable. It can be used as a method to control the quality of Wuweizi Mixture.

Keywords：Wuweizi Mixture ; Schisandrin A ; HPLC ; Determination

五味子合劑是柳州市中醫(yī)醫(yī)院的一代老中醫(yī)的驗(yàn)方，由五味子和黃芪等中藥提煉組成。為棕黃色澄明液體，味甜、微酸，具有補(bǔ)氣鎮(zhèn)靜的功效，常用于神經(jīng)衰弱、失眠、健忘、營養(yǎng)不良等疾病。其中，五味子在該配方中位列君藥，起主導(dǎo)作用。五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱北五味子，具有斂肺止咳、固腎納氣;滋養(yǎng)肝腎、強(qiáng)健筋骨;固精止遺、澀腸止瀉;生津止渴、益氣斂汗;滋腎寧心，調(diào)解酒毒的臨床功效[1-2]。五味子入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，后在《圖經(jīng)本草》和《名醫(yī)別錄》均有記載和考證，具有極高的藥用價(jià)值。現(xiàn)代研究表明[3-4]五味子具有增加機(jī)體免疫力，清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，升高白細(xì)胞等藥理作用。五味子中所含的木脂素類成分是其主要的有效活性成分，其中以含量較高的五味子醇甲為代表[5-6]，有研究表明[7]五味子醇甲對急性炎癥小鼠模型和免疫抑制小鼠模型增強(qiáng)效果顯著。鑒于五味子合劑療效確切、應(yīng)用廣泛，口碑較好，而原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有理化鑒別，無含量測定項(xiàng)，且未見報(bào)道以其有效成分五味子醇甲的含量測定為定量控制指標(biāo)，對其內(nèi)在質(zhì)量控制性不足，因此為了提高五味子合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)對五味子合劑中五味子醇甲的含量進(jìn)行初步研究，建立了五味子合劑中五味子醇甲的HPLC含量測定方法，為評價(jià)五味子合劑的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?U3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）;Synergy超純水機(jī)（美國Millipore公司）;XS-205Du電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。

1.2?試藥?五味子合劑（批號：20170121，柳州中醫(yī)院制劑室制備）。五味子醇甲對照品（批號：110857-200304，中國藥品生物制品檢定所）;甲醇（色譜純，批號：UN1230，默克股份兩合公司）、乙腈（色譜純，批號：UN1648，默克股份兩合公司），冰醋酸（優(yōu)級純，批號：10000218，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙酸乙酯（色譜純，批號UN1173，默克股份兩合公司），水為超純水。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)?色譜柱：Ag-ilent EtlipseXDB-C18柱（5μm，4.6mm×150mm）;流動相：乙腈-0.5%冰醋酸溶液（60∶40）;流速：1.0mL/min;柱溫：30℃;檢測波長：250nm;進(jìn)樣量為10μL。在此條件下，理論塔板數(shù)以五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2?對照品溶液制備?精密稱取五味子醇甲15.97mg，置25mL量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。（濃度為0.6388mg/mL）。

2.3?供試品溶液制備?精密量取五味子合劑10mL，用乙酸乙酯萃取兩次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中并定容，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4?陰性對照溶液制備?按處方比例分別稱取除五味子以外的其余藥味，按制備工藝制備陰性樣品，按“2.3供試品制備方法”制備陰性對照溶液。

2.5?干擾實(shí)驗(yàn)?分別精密吸取上述五味子醇甲對照品溶液、五味子合劑供試品溶液和陰性對照溶液各10μL，在上述色譜條件下，供試品中五味子醇甲與對照品色譜峰保留時(shí)間一致，并與相鄰色譜峰分離度大于1.5，陰性無干擾。色譜圖如圖1所示。

2.6?線性關(guān)系考察?分別精密量取上述五味子醇甲對照品溶液（濃度為0.6388mg/mL）0.2、0.5、1、2、5mL定容到10mL，精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀，測定五味子醇甲的峰面積，以五味子醇甲的濃度（x）為橫坐標(biāo)，其峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.426x-0.075，r=0.9993。結(jié)果表明五味子醇甲進(jìn)樣量在0.128～3.194μg之間與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.7?精密度試驗(yàn)?精密吸取五味子醇甲對照品溶液（濃度為0.6388mg·mL-1）10μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄五味子醇甲圖譜及峰面積，結(jié)果五味子醇甲平均峰面積值RSD為0.4%。表明該液相色譜儀的精密度良好。

2.8?穩(wěn)定性試驗(yàn)?精密量取五味子合劑（批號為20170121）10mL，按“2.3供試品制備方法”制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于1、2、4、6、12、24h進(jìn)樣，記錄圖譜及數(shù)據(jù)并計(jì)算其含量，考察五味子合劑供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：在24h內(nèi)五味子醇甲平均含量RSD為1.6%。表明五味子合劑供試品溶液在24h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.9?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一批五味子合劑6份（批號為20170121），分別精密量取10mL，按“2.3供試品制備方法”制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定五味子醇甲峰面積并計(jì)算其含量，考察方法的重復(fù)性。結(jié)果五味子醇甲平均含量為0.058mg/mL，RSD為1.8%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.10?加樣回收試驗(yàn)?取已知含量（含量為0.058mg/mL）的五味子合劑6份，每份精密量取5mL，置分液漏斗中，再加入濃度為0.6388mg/mL的五味子醇甲對照品溶液0.5mL，自“用乙酸乙酯萃取兩次”起，按“2.3供試品溶液制備”方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定五味子醇甲峰面積并計(jì)算回收率，平均回收率為97.70%，RSD為1.6%，表明該方法系統(tǒng)誤差較小。結(jié)果見表1。

2.11?樣品含量測定

分別取6個(gè)不同批次的五味子合劑各一份，每份精密量取10mL，按“2.3供試品制備方法”制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定五味子醇甲峰面積并計(jì)算其含量。結(jié)果見表2。

3?討論

五味子是五味子合劑中的君藥，五味子中有效成分的含量直接影響到藥品的療效。2015年版《中國藥典》一部將五味子醇甲作為評價(jià)五味子質(zhì)量的指標(biāo)成分，規(guī)定其含有量不低于0.4%[1]。藥典中含五味子的中成藥中也多采用五味子醇甲含量測定來作為質(zhì)量控制指標(biāo)[8-9]。故本實(shí)驗(yàn)以五味子醇甲為質(zhì)量控制指標(biāo)[10]。在對本品五味子醇甲的分離試驗(yàn)中，考察了甲醇-水為流動相進(jìn)行測定，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰分離不太理想，故改用乙腈-0.5%冰醋酸溶液（60∶40）為流動相，目標(biāo)峰五味子醇甲與雜質(zhì)峰分離效果比較理想，且與相鄰色譜峰分離度大于1.5。在200～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在218nm和250nm波長處有最大吸收，故以250nm為檢測波長，與2015版《中國藥典》一部規(guī)定一致。該法操作簡便快捷，重復(fù)性及穩(wěn)定性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為控制五味子合劑質(zhì)量的方法。

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