王萍 岳文勝 唐雪梅 羅玉群 李祖坤

[摘要] 目的 制備一種可載竹紅菌素（H）并具有葉酸（FA）分子靶向性的納米級超聲分子探針，探討其基本特性及體外尋靶能力。 方法 按一定比例將H、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）溶解于有機(jī)溶劑中，采用雙乳化法制備載有H的納米級超聲造影劑（PLGA/H），觀察測量PLGA/H的基本特性、包封率及載藥量，并優(yōu)化H的最佳劑量。通過添加偶聯(lián)葉酸的磷脂DSPE-PEG（2000）Floate在PLGA表面連接FA分子后，采用雙乳化法制備出既載有H，又具有FA分子靶向功能的納米微粒（PLGA-FA/H）。將PLGA/H和PLGA-FA/H分別作用于體外培養(yǎng)的人鼻咽癌（NPC）細(xì)胞株CNE2（FA受體高表達(dá)）和CNE2（FA受體低表達(dá)），觀察并比較其靶向性。 結(jié)果 成功制備了載有H的納米微粒PLGA/H，該納米微粒的平均粒徑為（220.50±91.37）nm，形態(tài)圓整，大小均勻且分散性好。PLGA-FA/H納米微?？膳c人NPC細(xì)胞株（FA受體高表達(dá)）的CNE2細(xì)胞靶向結(jié)合，而與NPC細(xì)胞株（FA受體低表達(dá)）的CNE2細(xì)胞靶向結(jié)合不明顯。 結(jié)論 成功制備了一種可載有H且具有FA分子靶向功能的超聲造影納米微?！狿LGA-FA/H，其對人NPC細(xì)胞株（FA受體高表達(dá)）的CNE2細(xì)胞具有靶向性。

[關(guān)鍵詞] 超聲;納米微粒;竹紅菌素;葉酸;靶向

[中圖分類號] R739.8? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（a）-0016-05

Experiment study of preparation of homomycin nanoparticle targeting probe and its ability to target NPC cells in vitro

WANG Ping? ?YUE Wensheng? ?TANG Xuenei? ?LUO Yuqun? ?LI Zukun

Department of Ultrasound， the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College， Sichuan Province， Nanchong? ?637000， China

[Abstract] Objective To prepare a nano-scale ultrasound molecular probe carrying hypocrellin （H） and targeting folic acid （FA） molecule， and to investigate its basic characteristics and in vitro targeting ability. Methods H and polylactic acid-glycolic acid （PLGA） were dissolved in organic solvents in a certain proportion. Nano-scale ultrasound contrast agent （PLGA/H） containing H was prepared by double emulsification method. The basic characteristics， entrapment efficiency and drug loading of PLGA/H were observed and measured， and the optimal dosage of H was optimized. After the FA molecule was attached to the surface of PLGA by adding folate-conjugated phospholipid DSPE-PEG （2000） Floate， nanoparticles with both H and FA molecular targeting function （PLGA-FA） were prepared by double emulsion method.? PLGA/H and PLGA-FA/H were respectively applied to human nasopharyngeal carcinoma （NPC） cell lines CNE2 （high expression of FA receptor） and CNE2 （low expression of FA receptor） in vitro to observe and compare their targeting. Results The nanoparticle PLGA/H carrying H was successfully prepared. The average particle size of the nanoparticles was （220.50±91.37） nm， the shape was round， the size was uniform and the dispersion was good. PLGA-FA/H nanoparticles can be targeted to CNE2 cells （high expression of FA receptor） of human NPC cell line， while CNE2 cells （low expression of FA receptor） with NPC cell line have no targeted binding. Conclusion PLGA-FA/H， a kind of contrast-enhanced ultrasound nanoparticle with H and FA molecular targeting function， has been successfully prepared， and it can target CNE2 cells （high expression of FA receptor） of human NPC cell line.

[Key words] Ultrasound; Nanoparticle; Hypocrellin; Folic acid; Targeted

起源于鼻咽部最常見的癌癥是鼻咽癌，其在中國南方和東南亞發(fā)病率較高[1-2]。放射治療目前是早期鼻咽癌的首選治療方法，大多數(shù)鼻咽癌是低分化的癌癥，對輻射的敏感性很高，而且放射治療領(lǐng)域很容易包括原發(fā)和頸部淋巴引流區(qū)。復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的臨床治療比原發(fā)性鼻咽癌更為困難。這些患者的常規(guī)治療是基于鉑的化療，其平均無進(jìn)展生存時間為7個月[3]。因此，對于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者，迫切需要確定一種更有效的治療方案。分子靶向超聲造影研究是近年來有關(guān)腫瘤的新興技術(shù)研究，該研究已在腫瘤、心肌缺血及周圍血管疾病等方面顯示出明確的診斷價值，而葉酸（folic acid，F(xiàn)A）受體因在鼻咽癌中高表達(dá)[4]而成為研究的重點(diǎn)之一。本研究以可載有竹紅菌素（H）且具有FA分子靶向功能的超聲造影納米微粒為目的，觀察該納米微粒的基本特性及體外尋靶能力，為進(jìn)一步進(jìn)行動物體內(nèi)的超聲造影研究奠定基礎(chǔ)。

1 主要試劑及設(shè)備

竹紅菌素（中國科學(xué)院化學(xué)研究所提供），聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，LA∶GA=50∶50，分子量為10 000，贏創(chuàng)-德固賽公司，批號：2018101508），F(xiàn)A和聚乙烯醇（PVA）（Sigma，美國，貨號：JP1763）。SONICS超聲聲振儀、ZNCL-BS智能數(shù)顯磁力攪拌器、高速離心機(jī)、UV-2600紫外分光光度儀、激光粒徑測量儀、掃描電鏡和、透射電鏡。

2 方法與結(jié)果

2.1 載H的納米微粒的制備及優(yōu)化

本研究采用雙乳化法制備納米微粒：①取50 mg PLGA溶于5 mL二氯甲烷。②H母液用二甲基亞砜（DMSO）溶解成濃度為100 mmol/L母液，再用去離子水中，配制成終濃度為2.5 mmol/L的儲存液，將其加入到溶有PLGA的二氯甲烷溶液中;③采用超聲制備初乳（功率為200 W），采用2s-2s-3個水平的初乳乳化次數(shù)，獲取白色乳化液（初乳，W/O微粒），將初乳轉(zhuǎn)移到5% PVA水溶液中，按上述超聲條件（2s-2s-3次），再次采用超聲制備復(fù)乳W/O/W微粒），攪拌去除可揮發(fā)的有機(jī)溶劑，凍干備用;④雙蒸水高速離心洗滌后收集PLGA/H納米微粒。通過添加偶聯(lián)葉酸的磷脂DSPE-PEG（2000）Floate在PLGA表面橋接FA分子，采用上述相同的方法制備PLGA-FA/H，將制備的PLGA/H和PLGA-FA/H納米微粒置于4℃冰箱保存。將制成的納米微泡與普通Sonovue超聲造影微泡進(jìn)行比較研究。

2.2 PLGA/H包封率和載藥量的測定

實(shí)驗(yàn)根據(jù)H的含量共分為四組，即空白組、2 mg H組、4 mg H組、8 mg H組。取新制備的PLGA/H納米溶液1 mL，分別溶于1 mL DMSO中，將溶解的懸液離心，取上清液，加入氫氧化鈉溶液（pH=12）0.5 mL溶解，再加入二氯甲烷渦旋5 min，二次離心后取上清液，采用Zetasizer Nano ZS90激光粒徑測量儀測定納米溶液的粒徑，高效液相色譜法檢測PLGA/H納米微粒的包封率及載藥量，檢測波長為283 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次。計(jì)算公式：

載藥量=H的質(zhì)量/納米粒的總質(zhì)量×100%

2.3 納米微粒的體外尋靶實(shí)驗(yàn)

將人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2（FA受體高表達(dá)）和CNE2（FA受體低表達(dá)）在置于無FA的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。選取對數(shù)生長期的CNE2（FA受體高表達(dá)）和CNE2（FA受體低表達(dá)）細(xì)胞，按照1×107/mL種瓶，1×104/mL種于6孔板中，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，孵育4 h后，棄培養(yǎng)液后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次。加入納米微粒后，實(shí)驗(yàn)分為4組：CEN2細(xì)胞（FA受體高表達(dá)）+PLGA/H組、CNE2（FA受體低表達(dá)）+PLGA/H組、CEN2細(xì)胞（FA受體高表達(dá)）+PLGA-FA/H組、CNE2（FA受體低表達(dá)）+PLGA-FA/H組。每孔追加2 mL 10%無FA的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)30 min，采用PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次，在光鏡下觀察納米微粒與各組細(xì)胞的結(jié)合情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);納米微粒結(jié)合細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)用線性回歸分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 結(jié)果

2.5.1 PLGA/H納米微粒的粒徑和形態(tài)觀察? PLGA/H納米微粒的平均粒徑為（220.50±91.37）nm，粒徑分布系數(shù)（PDI）為0.184，呈單峰分布，而Sonovue的平均粒徑為（1702.50±164.30）nm[7]，兩者粒徑大小差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。納米微粒呈球形、大小均勻，微粒間無黏連。見圖1～2。

2.5.2 PLGA/H納米微粒包封率和載藥量的測定? 實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明，8 mg H組的PLGA/H包封率及載藥量最高，因此選擇8 mg H作為制備PLGA/H納米微粒的最佳劑量。見表1。

2.5.3 各組納米微粒體外尋靶實(shí)驗(yàn)結(jié)果? PLGA-FA/H組可見較多納米粒結(jié)合在CNE2（FA受體高表達(dá)）周圍，并部分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而其他組均未見明顯的納米微粒與CNE2細(xì)胞靶向結(jié)合的現(xiàn)象。見圖3。PLGA-FA/H納米微粒結(jié)合細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)分析結(jié)果顯示，結(jié)合于細(xì)胞表面的納米粒會隨著細(xì)胞數(shù)量的增加而增加，兩者呈正相關(guān)：Y=0.098X+0.07（R2 = 0.95，P < 0.05）。見圖4。

A：CNE2細(xì)胞（FA受體低表達(dá)）+PLGA/H組;B：CNE2細(xì)胞（FA受體高表達(dá)）+PLGA/H組;C：CNE2細(xì)胞（FA受體低表達(dá)）+PLGA-FA/H組;D：CNE2細(xì)胞（FA受體高表達(dá)）+PLGA-FA/H組。箭頭所示為CNE2細(xì)胞（FA受體高表達(dá)）與PLGA-FA/H納米微粒結(jié)合并可見其進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)。PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物;H：竹紅菌素

3 討論

新型超聲造影技術(shù)是在以聲諾維為代表的氟碳聲學(xué)超聲造影劑及新的超聲造影成像模式基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新興技術(shù)。該技術(shù)受到醫(yī)學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域的關(guān)注，已在腫瘤、心肌缺血及周圍血管疾病等方面顯示出明確的診斷價值，并已進(jìn)入臨床研究。超聲造影劑不僅是一種良好的器官顯影劑，而且能作為一種重要的藥物傳輸載體[5-9]。應(yīng)用超聲儀器的動態(tài)探查，可以直觀地觀察到載藥微泡經(jīng)靜脈、淋巴管等傳輸途徑迅速聚集于腫瘤靶器官的內(nèi)部及周圍組織情況。小粒徑的納米造影劑較微米級的造影劑有更強(qiáng)的組織穿透能力，為超聲造影在特異性診斷領(lǐng)域中開辟了嶄新的研究領(lǐng)域，為新型超聲造影劑的研制開辟了新的研究方向。因此，以脂質(zhì)殼膜包裹H為基礎(chǔ)，研制一種穿透力強(qiáng)的納米級聲敏性聲學(xué)造影劑，將為鼻咽癌尤其是復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的鼻咽癌治療提供新的思路和新手段。

H是一種中草藥光敏劑，單純的H對細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用，前期工作發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲活化竹紅菌素B介導(dǎo)的聲動力作用后，對鼻咽癌細(xì)胞CNE2有明顯的殺傷作用。基于這一發(fā)現(xiàn)而興起的H納米聲學(xué)造影劑的靶向鼻咽癌治療技術(shù)為解決上述困難帶來了希望[10]。國內(nèi)外研究學(xué)者[4]證明人鼻咽癌細(xì)胞表面存在高表達(dá)的FA受體（陽性率達(dá)85%，其中近50%為高表達(dá)），而臨床晚期病人的FA表達(dá)陽性率更高，故本實(shí)驗(yàn)研究選擇FA受體作為鼻咽癌細(xì)胞上的靶點(diǎn)，希望通過制作一種帶可載竹紅菌素H的納米級超聲微泡靶向連接于鼻咽癌細(xì)胞的FA受體上，從而在后期的實(shí)驗(yàn)中達(dá)到對鼻咽癌細(xì)胞的治療作用。

既往微米級超聲靶向微泡直徑大于血管內(nèi)皮間隙（380～780 nm），因此微米級的載藥微粒無法透過血管達(dá)到血管外腫瘤所在區(qū)域。而且大多數(shù)針對靶向微泡的治療作用是關(guān)于其被動靶向治療作用的研究，即載藥微粒達(dá)到腫瘤區(qū)域時，外在加以超聲輻照、電荷或化學(xué)等特性，使載藥微泡破裂并釋放所載藥物，作用于指定腫瘤組織，這種方法在一定程度上具有靶向作用[11]。

而納米微粒經(jīng)具有穩(wěn)定性好、不易變形、在血流的剪切力的沖擊沖擊下不易破裂等優(yōu)點(diǎn);尤其是其體積小能透過血管內(nèi)皮間隙到達(dá)血管外組織內(nèi)，有效避免在體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性，不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，延長其在體內(nèi)的半衰期。如今大量的納米級靶向微粒的研究使得載藥納米微粒可以實(shí)現(xiàn)血管外腫瘤細(xì)胞的分子顯像及主動靶向治療作用，所謂主動靶向治療是指利用納米粒表面能連接可以特異表達(dá)的抗原、抗體或配體，產(chǎn)生特異識別腫瘤細(xì)胞的原理，可以制成各種針對腫瘤細(xì)胞表達(dá)的特異納米微粒，比如腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的FA、低密度脂蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等[12-19];或者采用親和素-生物素法將納米粒與腫瘤靶細(xì)胞特異結(jié)合，比如納米微泡-Affibody微粒的構(gòu)建，在體外能特異靶向各種HER2（+）腫瘤細(xì)胞[20-21]。本研究制備的PLGA-FA/H納米微粒能特異的識別腫瘤細(xì)胞鼻咽癌表面的FA受體并成功進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，達(dá)到主動靶向的作用。

本研究通過篩選H的劑量，采用雙乳化法成功制備納米微粒PLGA/H，該納米微粒呈球形，大小均勻，分散性良好;通過添加偶聯(lián)葉酸的磷脂DSPE-PEG（2000）Floate在PLGA表面連接FA分子后成功制備了具有FA分子靶向功能的納米微粒PLGA-FA/H，為后期動物實(shí)驗(yàn)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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