吳經(jīng)耀　馮瑛

【摘 要】 目的：測(cè)定并比較不同采收期兩年生長(zhǎng)期的鐵皮石斛中多糖含量、甘露糖含量、甘露糖與葡萄糖峰面積比及乙醇浸出物含量，尋找鐵皮石斛的最佳采收期。方法：

用紫外分光光度法進(jìn)行多糖含量測(cè)定，高效液相法測(cè)定甘露糖、甘露糖與葡萄糖面積比，熱浸法測(cè)定乙醇浸出物。結(jié)果：按照干燥品計(jì)，頭年10月、次年3月采收的鐵皮石斛中多糖含量（%）分別為（31.6±2.8）、（38.3±2.7），兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;甘露糖含量（%）分別為（32.3±3.6）、（35.0±3.5），兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;甘露糖與葡萄糖峰面積比為（3.2±0.7）、（2.0±0.6），兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;乙醇浸出物含量（%）分別為（12.6±1.8）、（6.4±1.7），兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;鐵皮石斛多糖含量增加，甘露糖與葡萄糖峰面積比呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，乙醇浸出物含量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。結(jié)論：鐵皮石斛頭年10月到翌年3月多糖含量最高，為最佳采收期。如中藥生產(chǎn)上需要以鐵皮石斛多糖為主要有效成分，兩年生的鐵皮石斛藥材采收時(shí)間為次年3月更科學(xué)合理。

【關(guān)鍵詞】 鐵皮石斛;多糖;甘露糖;甘露糖與葡萄糖峰面積比;乙醇浸出物

【中圖分類號(hào)】R282.6 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）10-0039-04

The Determination and Comparison of Main Components of Dendrobium officinale in Different Harvesting Periods

WU Jingyao FENG Ying

Institute of Traditional Chinese Medicine of Zhejiang province Co.Limited，Hangzhou 310023，China

Abstract：Objective To determine and compare the content of polysaccharide， mannose， peak area ratio of mannose and glucose and the content of ethanol extract in dendrobium candidum with different harvesting periods，to search for the best harvest period of dendrobium officinale.Methods The content of polysaccharide was determined by uv spectrophotometry， the area ratio of mannose， mannose and glucose was determined by HPLC， and the ethanol extract was determined by hot dip method. Results The polysaccharide content （%） of dendrobium officinalis collected in October of the first year and March of the next year were （31.6±2.8 ） and （38.3±2.7 ）， respectively. The mannose content （%） was （32.3±3.6 ） and （35.0±3.5 ）， respectively. There was no significant difference between the two groups. The peak area ratio of mannose to glucose was （3.2±0.7 ），? （2.0±0.6 ）， and there was a significant difference between the two groups. The content of ethanol extract （%） was （12.6±1.8 ） and （6.4±1.7 ）， respectively. The content of polysaccharide in dendrobium officinale increased， the peak area ratio of mannose and glucose decreased， and the content of ethanol extract decreased. Conclusion The content of polysaccharide in dendrobium officinale was the highest from October of the first year to March of the next year. If the polysaccharide of dendrobium candidum is the main active ingredient in the production of traditional Chinese medicine， the harvest time of the biennial dendrobium candidum in the following March should be more scientific and reasonable.

Key words： Dendrobium officinale; Polysaccharides; Mannose; The Ratio of the Sugar to the Glucose Peak; Ethanol Extract

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為石斛之極品，因其表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，被譽(yù)為“九大仙草”之首，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰“主傷中、除痹、下氣、補(bǔ)五臟虛勞羸瘦、強(qiáng)陰、久服厚腸胃”，現(xiàn)代研究表明鐵皮石斛的莖能夠益胃生津，滋陰清熱，對(duì)治療口干煩躁、食少干嘔、陰虛火旺有很好的療效。文獻(xiàn)報(bào)道[1]對(duì)鐵皮石斛藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及最佳采收期進(jìn)行研究，但其以總水溶性糖及總水溶性多糖含量為分析指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)11～3月期間含量較高，開(kāi)花期4～5月明顯下降，隨后又開(kāi)始回升，并且未參照最新版《中國(guó)藥典》進(jìn)一步對(duì)頭年11月份到次年3月份的差異開(kāi)展研究，故本實(shí)驗(yàn)在2015版《中華人民共和國(guó)藥典》指導(dǎo)下，測(cè)定了浙江某種植基地頭年11月份到次年3月份不同采收時(shí)間兩年生鐵皮石斛中的多糖含量、甘露糖含量、甘露糖與葡萄糖峰面積比及乙醇浸出物含量，從而為鐵皮石斛最佳采收期和藥材質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑 鐵皮石斛樣品采自浙江某種植基地，取自生長(zhǎng)期為兩年的鐵皮石斛的干燥莖，經(jīng)過(guò)浙江省中藥研究所教授級(jí)高工王志安鑒定為鐵皮石斛藥材，樣品干燥粉碎過(guò)三號(hào)篩。采收期分別為：浙1號(hào)到浙6號(hào)（2014年10月），浙7號(hào)到浙12號(hào)（2014年12月），浙13號(hào)到浙18號(hào)（2015年3月），浙19號(hào)到浙24號(hào)（2015年5月），浙25號(hào)到浙30號(hào)（2015年7月）。D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110833-201205，中國(guó)食品藥品檢研究院，含量99.5%）。5%苯酚溶液：稱取苯酚（分析純，批號(hào)：20141108，蘭溪市六洞山化工試劑廠）2.5g，加純水50mL，搖勻即得（臨用配制）。硫酸（分析純，批號(hào)：20141108，杭州雙林化工試劑廠），95%乙醇（批號(hào)：20150104，杭州化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器 Lambda 20紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)PERKIN ELMER公司），METTLER TOLEDOAB204-S電子天平（瑞士METTLER公司），TC-15套式恒溫鍋（浙江海寧新華醫(yī)療器械廠），Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 20RBAX SB-C18色譜柱。

2 方法

2.1 多糖含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.3g，加水200mL，加熱回流2h，放冷，轉(zhuǎn)移至250mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2mL，置15mL離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）30min，棄去上清液（必要時(shí)濾過(guò)），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取對(duì)照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置10mL具塞試管中，各加水補(bǔ)至1.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL（臨用配制），搖勻，再精密加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20min，取出，置冰浴中冷卻5min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（通則0401），在488nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 測(cè)定法 精密量取供試品溶液1mL，置10mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1mL起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的量，計(jì)算，即得[1]。

2.2 甘露糖含量測(cè)定

2.2.1 甘露糖色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.02mol/L乙酸銨溶液（20∶80）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。理論板數(shù)按甘露糖峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 校正因子測(cè)定 取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1mL含12mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取甘露糖對(duì)照品約10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1mL，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取400μL，加0.5mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液與0.3mol/L氫氧化鈉溶液各400μL，混勻，70℃水浴反應(yīng)100min。再加0.3mol/L的鹽酸溶液500μL，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2mL，棄去三氯甲烷液，水層離心后，取上清液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算校正因子。

2.2.3 測(cè)定法 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.12g，精密稱定，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開(kāi)置于燒杯中，加水100mL，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2mL，煎煮1h并時(shí)時(shí)攪拌，放冷，加水補(bǔ)至約100mL，混勻，離心，吸取上清液1mL，置頂空瓶中，加3.0mol/L的鹽酸溶液0.5mL，封口，混勻，110℃水解1h，放冷，用3.0mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，吸取400μL，照校正因子測(cè)定法，自“加0.5mol/L的PMP甲醇溶液”起，依法操作，取上清液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得[1]。

2.3 甘露糖與葡萄糖峰面積比 取葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1mL含50μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取0.4mL，按照2015版《中國(guó)藥典》一部鐵皮石斛項(xiàng)下含量測(cè)定甘露糖項(xiàng)下方法依法測(cè)定。

2.4 浸出物 按照2015版《中國(guó)藥典》通則2201的熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑。2.1～2.4結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同采收期鐵皮石斛莖的主要成分含量 見(jiàn)表1。

2.2 不同采收期鐵皮石斛莖主要成分含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》一部[2]：供試品溶液的制備流程其中一部分為“（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）離心20min，棄去上清液（必要時(shí)濾過(guò)）”，此處值得商榷。因?yàn)殡x心后容易出現(xiàn)白色沉淀，有一部分粘附離心管壁上，還有少量很淡的白色沉淀在上清液里，傾倒上清液時(shí)容易損失，造成多糖含量偏低，如果改為“（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）離心30min，上清液濾過(guò)，用少量熱水洗滌濾紙數(shù)次，合并濾液”，這樣較為妥當(dāng)。原因是離心時(shí)間延長(zhǎng)，可以把白色沉淀最大限度附著在離心管壁上，過(guò)濾可以保證很淡的白色沉淀得以留在濾紙上，最大限度減少不同采收時(shí)間多糖含量的差異。

比較表1和表2中采收期（2014.10與2015.3）的鐵皮石斛，多糖含量增加，乙醇浸出物含量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。一般情況乙醇浸出物是指用95%的乙醇采用熱浸法提取制得。高濃度的乙醇提取出的成分主要是脂溶性成分為主，而多糖易溶于熱水屬于水溶性成分。藥材多糖含量增加，意味著脂溶性成分占比下降，所以乙醇浸出物含量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。藥材多糖含量增加，甘露糖與葡萄糖峰面積比呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)可能原因是多糖含量增加，葡萄糖峰面積呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，甘露糖與葡萄糖峰面積比中的分母增加，所以兩者的面積比呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鐵皮石斛頭年10月到翌年3月多糖含量最高，這段時(shí)間為最佳采收期。此外鐵皮石斛（2015.3采收）比鐵皮石斛（2014.10采收）多糖含量高，從另一方面證實(shí)了本文結(jié)論如果中藥生產(chǎn)過(guò)程中，以鐵皮石斛多糖為主要有效成分，次年3月采收鐵皮石斛比頭年10月采收要更科學(xué)合理，符合石斛生長(zhǎng)過(guò)程中多糖含量變化的規(guī)律[3-15]。鐵皮石斛每年4～5月份為開(kāi)花期，多糖含量明顯下降后又開(kāi)始回升，最佳生長(zhǎng)期和最佳采收期基本符合。本研究可以為企業(yè)的石斛種植和采收提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

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