劉玉珊，汪 洋，李春筱，李寧浩，董書維，劉 麗

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

富營養(yǎng)化水體中藍(lán)藻水華頻繁發(fā)生，由此產(chǎn)生的嚴(yán)重生態(tài)危害已成為備受關(guān)注的重大水環(huán)境問題。水華的發(fā)生使水體感官性狀惡化、自凈能力降低，并破壞自然人文景觀，其中產(chǎn)毒藍(lán)藻產(chǎn)生釋放的藻毒素，對生態(tài)環(huán)境造成危害并危及人類健康[1-3]。

藍(lán)藻毒素是產(chǎn)毒藍(lán)藻產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，毒素種類繁多，其中肝毒素(hepatotoxins)和神經(jīng)毒素(neurotoxins)對人類危害最為嚴(yán)重[4]。微囊藻毒素(microcystin，MCs)是普遍存在于富營養(yǎng)化水體中的肝毒素，也是目前研究最為廣泛的毒素，主要由微囊藻屬(Microcystis)、浮絲藻屬(Planktothrix)和顫藻屬(Oscillatoria)等藻類產(chǎn)生[5]；魚腥藻毒素(anatoxin，AnTX)是魚腥藻屬(Anabaena)和束絲藻屬(Aphanizomenon)等藻類產(chǎn)生的神經(jīng)毒素；麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins， PSTs)是具有神經(jīng)毒性的小分子生物堿，主要由亞歷山大藻屬(Alexandrium)、束絲藻屬和魚腥藻屬等藻類產(chǎn)生[6]。

藍(lán)藻毒素類型多樣，分離困難，微量多變，監(jiān)測分析難度大，目前缺乏對藍(lán)藻水華及藍(lán)藻毒素危害的有效控制手段。常用的藍(lán)藻毒素檢測方法對樣品和檢測條件要求高，往往只能檢測水體中已產(chǎn)生并積累到一定濃度的毒素，無法對毒素產(chǎn)生、毒素種類和產(chǎn)毒藻種進(jìn)行預(yù)判。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對藻毒素合成酶基因的研究發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素、魚腥藻毒素和麻痹性貝類毒素的生物合成分別受mcy(microcystin synthesis gene)基因簇、ana(anatoxin synthesis gene)基因簇和sxt(saxitoxin synthesis gene)基因簇的調(diào)控[7-9]，這為針對性地開展產(chǎn)毒藍(lán)藻監(jiān)測和研究提供了重要手段，通過相關(guān)毒素酶合成基因檢測產(chǎn)毒藻類的方法目前已成功應(yīng)用于藍(lán)藻水華監(jiān)測和研究中[10]。VALéRIO等[11]采用多重PCR和高效液相色譜法對124株環(huán)境樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明多重PCR檢測結(jié)果靈敏性為92.3%，特異性高達(dá)100%。TILLETT等[12]針對微囊藻毒素合成酶基因mcyA設(shè)計特異性引物，運(yùn)用PCR技術(shù)檢測實(shí)驗室培養(yǎng)的37株微囊藻的產(chǎn)毒能力，結(jié)果表明有18株P(guān)CR結(jié)果呈陽性。LEGRAND等[13]采用巢式PCR方法擴(kuò)增環(huán)境樣品中魚腥藻毒素基因anaC，結(jié)果表明該方法擴(kuò)增效果顯著，并發(fā)現(xiàn)anaC基因廣泛分布在淡水湖泊中。BALLOT等[14]采用sxtA基因?qū)Φ聡鴸|北部湖泊中分離到的14株產(chǎn)麻痹性貝類毒素的束絲藻進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明14株束絲藻樣本均呈陽性。分子生物學(xué)方法簡單快捷，靈敏度高，成本較低，能夠在藍(lán)藻毒素釋放之前對其進(jìn)行定性檢測，可提升對環(huán)境水體中毒素的預(yù)警預(yù)測預(yù)防能力，具有廣闊應(yīng)用前景。

云南滇池是云南高原地區(qū)面積最大的淡水湖泊，是我國富營養(yǎng)化最嚴(yán)重的湖泊之一[15]，2017年滇池外海水質(zhì)由Ⅴ類降為劣Ⅴ類[16]，藍(lán)藻水華頻繁發(fā)生?；诔Ｒ?guī)PCR技術(shù)采用產(chǎn)毒藍(lán)藻特有的3種藻毒素合成酶基因mcyE、anaC和sxtA，檢測2017年3月—2018年2月云南滇池海埂水域產(chǎn)毒藍(lán)藻種類，并通過測序得到的序列構(gòu)建進(jìn)化樹分析產(chǎn)毒藍(lán)藻多樣性。研究富營養(yǎng)化湖泊產(chǎn)毒藍(lán)藻和藻毒素基因多樣性，能為科學(xué)評價富營養(yǎng)化湖泊產(chǎn)毒藍(lán)藻及其藻毒素生態(tài)環(huán)境危害提供理論依據(jù)，有助于建立有毒藻華預(yù)警方法，對降低藻華危害效應(yīng)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

于2017年3月—2018年2月每月中旬在滇池外海海埂水域3個采樣點(diǎn)(24°57′46″ N、102°39′58″ E，24°57′41″ N、102°39′26″ E，24°57′43″ N、102°39′08″ E)分別采集0.5 m深處表層和2 m深處底層水樣，同時測定樣點(diǎn)水溫、pH值和透明度。采集水樣后立即帶回實(shí)驗室，將表層和底層水樣混合后經(jīng)0.45和0.22 μm孔徑纖維濾膜過濾收集藻細(xì)胞，濾膜于-40 ℃條件下保存。

1.2 藻細(xì)胞基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用E.Z.N.A.?Water DNA Kit試劑盒(OMEGA)提取樣品藻類總DNA，并分別采用產(chǎn)毒藍(lán)藻特有的微囊藻毒素合成酶基因mcyE[17]、魚腥藻毒素合成酶基因anaC[18]和麻痹性貝類毒素合成酶基因sxtA[14]對DNA進(jìn)行PCR檢測，引物序列見表1，擴(kuò)增引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為Premix Taq (2×) (TaKaRa) 10.0 μL，正、反向引物各1 μL (10 μmol·L-1)，模板DNA 3.0 μL和ddH2O 5.0 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(表1)，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

表1 使用的引物序列

Table 1 Primers used in the study

引物名稱序列(5′-3′)目的片段長度/ bp退火溫度/℃mcyE-F2GAAATTTGTGTAGAAGGTGC81256mcyE-R4AATTCTAAAGCCCAAAGACGanxgenFATGGTCAGAGGTTTTACAAG86152anxgenRCGACTCTTAATCATGCGATCsxtafGCGTACATCCAAGCTGGACTCG68355sxtarGTAGTCCAGCTAAGGCACTTGC

1.3 膠回收、TA克隆和序列測定

將擴(kuò)增后的目的片段使用膠回收試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行純化，純化后采用pEASY?-T1 Cloning Kit (TransGen Biotech)連接與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，在培養(yǎng)過夜的LB平板上隨機(jī)挑取單克隆菌落(每個樣品20個)振蕩培養(yǎng)，對菌液陽性重組子菌落進(jìn)行鑒定，陽性菌液由昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測序得到的序列經(jīng)NCBI BLAST(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對后，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中mcyE、anaC和sxtA基因參考序列，采用ClustalX 1.83軟件將所有序列進(jìn)行匹配排列，采用MEGA 6.0軟件中NJ法分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap value設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇池海埂水域藻毒素基因PCR擴(kuò)增及克隆測序

從滇池海埂水域樣品中提取藍(lán)藻DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。如圖1所示，藻毒素合成基因mcyE、anaC和sxtA分別于812、861和683 bp處有明顯亮帶，這表明由滇池海埂水域水樣成功擴(kuò)增出mcyE、anaC和sxtA基因，共獲得184條mcyE基因有效序列、142條anaC基因有效序列和195條sxtA基因有效序列。

圖1 藻毒素基因瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 滇池海埂水域藻毒素基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.1微囊藻毒素mcyE基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

研究區(qū)獲得的184條mcyE基因有效序列中，春(3—5月)、夏(6—8月)、秋(9—11月)、冬(12月—次年2月)樣品序列分別為55、50、40和39條，在持續(xù)1 a的不同季節(jié)均被檢出。將這184條微囊藻毒素mcyE基因樣本序列與代表性mcyE基因參考序列在核苷酸水平上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖2所示，所有序列在進(jìn)化樹上可劃分為3個進(jìn)化簇(Cluster I～Ⅲ)。Cluster I中包括微囊藻屬中銅綠微囊藻和綠色微囊藻mcyE基因參考序列(序列號為AB032549、AF183408、JQ290085和EU151892)以及筆者研究獲得的184條mcyE基因序列，表明滇池海埂水域微囊藻毒素可能主要由微囊藻屬藻類產(chǎn)生。Cluster Ⅱ包括席藻屬(Phormidium)(序列號為JQ771645和JQ771644)和浮絲藻屬(序列號為EU151891、AJ441056和AM990462)mcyE基因參考序列。Cluster Ⅲ則包括魚腥藻屬(序列號為AJ536156和EU151887)、費(fèi)氏藻屬(Fischerella)(序列號為JQ771640、KX891213、KJ364645)、軟管藻屬(Hapalosiphon)(序列號為EU151886)、念珠藻屬(Nostoc)(序列號為KC699835)和節(jié)球藻屬(Nodularia)(序列號為AY382540～AY382542)mcyE基因參考序列。Cluster Ⅱ～Ⅲ均不含筆者研究樣本序列。由此推斷，滇池海埂水域mcyE基因遺傳多樣性較為單一，主要由微囊藻屬產(chǎn)毒藍(lán)藻產(chǎn)生，且全年不同季節(jié)均存在。

A包含微囊藻參考序列和該研究120條mcyE序列，B包含微囊藻參考序列和該研究64條mcyE序列。

2.2.2魚腥藻毒素anaC基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

研究區(qū)獲得的142條魚腥藻毒素anaC基因有效序列，其中春、夏、冬季樣品序列分別為53、44和45條，而秋季樣品未檢出。將這142條anaC基因序列與代表性anaC基因參考序列在核苷酸水平上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖3所示，所有序列在進(jìn)化樹上可劃分為3個進(jìn)化簇(Cluster I～Ⅲ)。Cluster I的克隆來自束絲藻屬anaC基因的參考序列和筆者研究獲得的全部142條anaC基因序列，形成兩個進(jìn)化亞簇，其中筆者研究獲得的一部分anaC基因序列與未經(jīng)培養(yǎng)的anaC基因參考序列形成一個進(jìn)化亞簇A(序列號為KR813863、KR813865、KR813868和KR813869)，且未經(jīng)培養(yǎng)的藍(lán)藻序列與束絲藻屬anaC基因序列高度同源；另一部分anaC基因序列與束絲藻屬和矛絲藻屬的anaC基因參考序列位于另一個進(jìn)化亞簇B(序列號為JF803655和KM245023～KM245025)，矛絲藻屬是部分束絲藻歸類的新藻屬，其根源應(yīng)屬于束絲藻[19]。Cluster Ⅱ包括魚腥藻屬anaC基因序列的參考序列(序列號為JF803645～JF803647和JF803657)。Cluster Ⅲ包括顫藻屬anaC基因序列的參考序列(序列號為JF803648、FJ477836、JF803651、JF803652和JF803656)。Cluster Ⅱ～Ⅲ均不含筆者研究樣本序列。這表明研究區(qū)anaC基因主要由束絲藻屬藍(lán)藻產(chǎn)生，且除秋季外其他季節(jié)均存在。

A包含束絲藻參考序列和該研究78條anaC序列，B包含束絲藻和矛絲藻參考序列以及該研究64條anaC序列。

2.2.3麻痹性貝類毒素sxtA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

研究區(qū)獲得的195條麻痹性貝類毒素sxtA基因有效序列中春、夏、秋、冬季樣品序列分別為57、39、53和46條，全年不同季節(jié)均有檢出。將這195條sxtA基因序列與代表性sxtA基因參考序列在核苷酸水平上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖4所示，所有序列在進(jìn)化樹上可劃分為4個進(jìn)化簇(Cluster I～Ⅳ)。Cluster I包括筆者研究獲得的195條麻痹性貝類毒素sxtA基因序列和束絲藻屬sxtA基因參考序列(序列號為EU603710、EU629175和LT549446～LT549449)，且同源性為99%。Cluster Ⅱ包括魚腥藻屬sxtA基因序列的參考序列(序列號為DQ787201、EU629176和EU629177)。Cluster Ⅲ包括擬柱胞藻屬sxtA基因序列的參考序列(序列號為DQ787200和EU629178)。Cluster Ⅳ包括鞘絲藻屬sxtA基因序列的參考序列(序列號為EU603711)。Cluster Ⅱ～Ⅳ均不含筆者研究樣本序列。由此推斷，研究區(qū)sxtA基因主要由束絲藻屬藍(lán)藻產(chǎn)生，且全年均存在。

A包含該研究161條sxtA序列。

3 討論

以微囊藻毒素合成酶基因mcyE、魚腥藻毒素合成酶基因anaC和麻痹性貝類毒素合成酶基因sxtA為靶標(biāo)基因，采用PCR技術(shù)檢測云南滇池海埂水域產(chǎn)毒藍(lán)藻種類。結(jié)果表明，2017年3月—2018年2月滇池海埂水域均檢測到mcyE基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，獲得的mcyE基因序列與微囊藻屬中銅綠微囊藻和綠色微囊藻的序列同源性為99%，滇池海埂水域微囊藻毒素主要由微囊藻屬水華藍(lán)藻產(chǎn)生。鮑忠祥[20]采用高效液相色譜法(HPLC)檢測微囊藻毒素并結(jié)合顯微計數(shù)獲得的優(yōu)勢種群發(fā)現(xiàn)，滇池中存在微囊藻毒素，并且其主要由微囊藻屬產(chǎn)生，筆者研究結(jié)果與之一致。滇池海埂水域光照、水溫、呈弱堿性的水體pH等環(huán)境因子都適合微囊藻生長。滇池藍(lán)藻水華以微囊藻水華為主，微囊藻已成為滇池藍(lán)藻水華的優(yōu)勢種群[21]，這可能導(dǎo)致mcyE基因多樣性較為單一，遺傳差異性不明顯。

魚腥藻毒素和麻痹性貝類毒素都屬于神經(jīng)毒素，對動物及人類危害很大。目前對藻毒素的研究以微囊藻毒素為主，有關(guān)其他類型藻毒素研究較少。加強(qiáng)其他毒素的研究，建立較完善的藻毒素研究體系勢在必行。筆者研究中滇池海埂水域產(chǎn)麻痹性貝類毒素的有毒束絲藻和產(chǎn)魚腥藻毒素的有毒束絲藻均被檢出。研究區(qū)sxtA基因序列于2017年3月—2018年2月不同季節(jié)水樣中均被檢出，而anaC基因序列于2017年秋季(9—11月)沒有被檢出，其他時間均被檢出，這可能與水體中藻毒素降解、生物吸收和環(huán)境因子等因素有關(guān)[22-24]，具體原因有待進(jìn)一步研究。劉永梅等[25]通過小白鼠生物檢測發(fā)現(xiàn)滇池束絲藻水華可能產(chǎn)生麻痹性貝類毒素。筆者研究獲得的anaC和sxtA基因均屬于束絲藻屬，與參考序列同源性較高，遺傳差異性也不明顯，這表明這些anaC和sxtA基因可能由束絲藻屬藻類產(chǎn)生。萬能等[21]研究表明，滇池藍(lán)藻水華的優(yōu)勢種群存在明顯的微囊藻—束絲藻季節(jié)性交替。研究區(qū)域anaC和sxtA基因多樣性較單一，這可能與束絲藻是滇池藍(lán)藻水華的優(yōu)勢種群有關(guān)。

4 結(jié)論

藍(lán)藻毒素在湖泊中廣泛存在，迫切需要建立準(zhǔn)確、快速、有效地預(yù)測水華尤其是有毒藍(lán)藻水華的方法，這需要檢測富營養(yǎng)化湖泊中產(chǎn)毒藍(lán)藻種類，分析藻毒素類型。滇池藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)，由此產(chǎn)生的藍(lán)藻毒素問題也不容小覷。筆者通過3種藻毒素合成酶基因檢測2017年3月—2018年2月滇池海埂水域藍(lán)藻產(chǎn)毒基因種類，發(fā)現(xiàn)研究區(qū)微囊藻毒素mcyE基因、魚腥藻毒素anaC基因和麻痹性貝類毒素sxtA基因均有檢出，且mcyE、anaC和sxtA基因多樣性均較為單一，遺傳差異性不明顯。筆者研究組采用16S rRNA和18S rRNA測序方法分別研究滇池海埂水域不同季節(jié)原核浮游生物和真核浮游生物，分析其藍(lán)藻群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)春、夏、秋和冬季研究區(qū)微囊藻屬占據(jù)優(yōu)勢，束絲藻屬等其他藻屬也均有存在，為后續(xù)研究產(chǎn)毒藍(lán)藻分子檢測提供參考，也為產(chǎn)毒藍(lán)藻預(yù)警機(jī)制提供技術(shù)支持。湖泊不同區(qū)域環(huán)境條件不同，富營養(yǎng)化程度不同，藍(lán)藻優(yōu)勢種群也不同，導(dǎo)致不同區(qū)域產(chǎn)毒藍(lán)藻種類可能存在差異，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，以期更加全面深入了解滇池產(chǎn)毒藍(lán)藻多樣性。僅采用有毒藍(lán)藻產(chǎn)毒基因的分子生物學(xué)檢測方法難以有效反映水體藻毒素水平，在實(shí)際應(yīng)用中可結(jié)合高效液相色譜法(HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等具體毒素分析方法共同使用。