香格里拉本土釀酒酵母冰酒發(fā)酵產(chǎn)香特征分析

秦偉帥，張?jiān)绖?，?娜，張 蕾

（1.泰山學(xué)院 生物與釀酒工程學(xué)院 葡萄酒微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；2.蓬萊市葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 蓬萊 265600）

葡萄酒品質(zhì)受葡萄品種和發(fā)酵過程中微生物種群的影響，而香氣物質(zhì)是決定葡萄酒品質(zhì)的重要因素之一。葡萄酒香氣由多種揮發(fā)性化合物構(gòu)成，包括醇類、酯類、酸類、萜烯類等物質(zhì)，主要來源于葡萄品種、發(fā)酵過程和后期陳釀[1]。這些揮發(fā)性化合物因其極性、揮發(fā)性和濃度的不同，從而使葡萄酒具有不同的風(fēng)味獨(dú)特性[2]。香格里拉產(chǎn)區(qū)赤霞珠冰酒是在自然溫度降到-8℃以下時(shí)（有的產(chǎn)酒規(guī)規(guī)定-7℃），對(duì)冰葡萄進(jìn)行采摘，以冰凍狀態(tài)進(jìn)行壓榨釀制而成。所釀酒通常具有蜂蜜、成熟的蜜瓜、菠蘿、玫瑰以及葡萄干等風(fēng)味，其風(fēng)味的形成與產(chǎn)區(qū)氣候環(huán)境、發(fā)酵工藝條件關(guān)系密切。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣物質(zhì)對(duì)葡萄酒風(fēng)味有重要影響，是葡萄酒揮發(fā)性化合物的重要組分[3]。由酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物主要包括高級(jí)醇、中鏈和長鏈脂肪酸、脂肪酸乙酯、乙基酯、醛類等物質(zhì)[4]。酵母產(chǎn)香能力不僅受菌種影響，而且與產(chǎn)糖苷酶性能強(qiáng)的菌株存在一定聯(lián)系[5]。不同酵母發(fā)酵同一葡萄酒所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)差異明顯[6]，主要由于酵母釋放葡萄品種風(fēng)味前體和從頭合成的能力不同[7]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，本土酵母能增加葡萄酒的口感復(fù)雜性和圓潤度，更好的適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂蚝桶l(fā)酵環(huán)境，保證葡萄酒發(fā)酵的順利進(jìn)行[8]。因此，篩選合適的本土酵母對(duì)葡萄酒生產(chǎn)至關(guān)重要。

本研究采用4株香格里拉本土酵母（CZ10、CZ11、BZL10、BZL12）與商業(yè)酵母DV10發(fā)酵赤霞珠冰酒，通過頂空-固相微萃?。╤ead space-solid phase microextraction，HP-SPME）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)檢測分析冰酒的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，并利用感官評(píng)定比較其感官品質(zhì)優(yōu)劣，旨在探究香格里拉本土酵母和進(jìn)口商業(yè)干酵母發(fā)酵赤霞珠冰酒的香氣物質(zhì)和感官差異性，為香格里拉產(chǎn)區(qū)特色冰酒的挖掘和適宜冰酒釀造的酵母菌株選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和原料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株CZ10、CZ11、BZL10、BZL12：均篩選于香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)梅里冰酒莊葡萄園（泰山學(xué)院微生物菌種保藏中心）；商業(yè)酵母菌株DV10：法國拉曼公司。

赤霞珠葡萄：選自云南香格里拉太陽魂酒莊產(chǎn)業(yè)有限公司梅里冰酒莊。

1.1.2 化學(xué)試劑

乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、2-苯乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸、己酸、辛酸和癸酸（純度均＞98%）：美國Sigma公司；內(nèi)標(biāo)物4-甲基-2-戊醇（純度＞98%）：美國Aldrich公司；氯化鈉（分析純）：國藥化學(xué)試劑有限公司；果膠酶（酶活4 150 U/g）：法國拉曼公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，pH自然，在121℃條件下滅菌15 min。固體YPD培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

QP2010Plus氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司；5417C型離心機(jī)：德國Eppendorf公司；MP220K pH計(jì)：瑞士METTLER TOLEDO公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 赤霞珠冰酒工藝流程及操作要點(diǎn)

成熟葡萄→除梗破碎→低溫浸漬→酒精發(fā)酵→皮渣分離→自然澄清→陳釀→過濾→灌裝→包裝

操作要點(diǎn)：葡萄原料含糖量達(dá)到350 g/L時(shí)進(jìn)行采摘，除梗破碎，添加總二氧化硫達(dá)到30 mg/L；如桶浸漬，浸漬溫度5℃，浸漬時(shí)間120 h；果膠酶添加量30 mg/L；接種酵母（取試管斜面酵母于三角瓶中37℃活化30 min，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵醪中），接種量1×107個(gè)/mL；進(jìn)行發(fā)酵（發(fā)酵溫度12℃）；酒精發(fā)酵期間每12 h取樣檢測酒精度，每次3個(gè)重復(fù)；酒精度達(dá)到13%vol時(shí)，分離皮渣，生葡萄酒轉(zhuǎn)入新罐，添加總二氧化硫60 mg/L；低溫2℃冷凍處理15 d；分離酒腳，澄清酒轉(zhuǎn)入新罐，檢測游離二氧化硫，保證其含量20 mg/L；葡萄酒密封陳釀（溫度13℃），利用惰性氣體（氮?dú)猓┓夤?，持續(xù)到來年10月發(fā)酵季節(jié)；過濾灌裝得冰酒。

1.3.2 理化指標(biāo)測定

酒樣的pH、總酸、揮發(fā)酸、總糖和酒精度測定參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的pH計(jì)法、酒精計(jì)法、總糖直接滴定法、總酸測定指示劑法、揮發(fā)酸測定方法。

1.3.3揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測定[9-10]

冰酒香氣物質(zhì)測定采用HS-SPME-GC-MS法。揮發(fā)性香氣物質(zhì)的提取：萃取頭放入進(jìn)樣口280℃老化30 min。在20 mL頂空瓶中，加入8 mL葡萄酒，2 g NaCl和20 μL內(nèi)標(biāo)物（4-甲基-2-戊醇，質(zhì)量濃度為2 g/L）。放置于45℃的可加熱磁力攪拌器上，預(yù)熱10 min。將老化好的萃取針插入頂空瓶，45℃進(jìn)行萃取，萃取50 min后插入GC-MS進(jìn)樣口，250℃解吸10 min。

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：40℃下保持2 min，然后以1℃/min的速度升到45℃，保持2 min，3℃/min的速度升到84℃，保持2 min，5℃/min的速度升到230℃，保持5 min，載氣為氦氣（He）。平均線速度為25 cm/s；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；檢測器溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍30～400 m/z。

定性定量分析：分析結(jié)果美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究（national institute of standards and technology，NIST）08和WILEY7譜庫進(jìn)行初步檢索及資料分析，再結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)香氣物質(zhì)的各個(gè)化學(xué)成分。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

不同酵母發(fā)酵的酒樣放在通風(fēng)良好、無任何氣味的房間內(nèi)，分別由專業(yè)人員采用定量描述分析法（quantitative descriptive analysis，QDA）進(jìn)行酒樣感官的定性和定量評(píng)價(jià)[11]，整體評(píng)價(jià)滿分為100分，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 冰酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of ice wine

續(xù)表

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠葡萄冰酒理化指標(biāo)分析

對(duì)釀酒酵母菌株CZ10、CZ11、BZL10、BZL12及商業(yè)酵母DV10發(fā)酵赤霞珠冰酒樣品進(jìn)行理化指標(biāo)測定，結(jié)果見表2。由表2可知，各酵母發(fā)酵酒樣的基本理化指標(biāo)差別不大，均符合相關(guān)國標(biāo)要求。本土酵母所發(fā)酵酒樣較商業(yè)酵母DV10具有較低的揮發(fā)酸和總酸含量，其中本土酵母BZL10揮發(fā)酸含量最低，為0.54 g/L；CZ10的總酸含量最低，為6.3 g/L?？偺菧y定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本土酵母發(fā)酵酒樣的總糖含量整體較高，其中CZ10總糖含量為126.7 g/L，BZL12為121.82g/L，均高于商業(yè)酵母DV10發(fā)酵酒樣總糖含量110g/L。

表2 不同酵母發(fā)酵冰酒理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 2 Determination results of physicochemical indexes of ice wines fermented by different yeasts

2.2 赤霞珠葡萄冰酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

發(fā)酵醪接種酵母后進(jìn)行糖度的測定，結(jié)果見圖1。由圖1可知，本土酵母BZL12接種2 d后糖度開始下降，起酵迅速；商業(yè)酵母DV10在接種4 d后起酵；酵母BZL10在第5天起酵；酵母CZ10、CZ11在第6天起酵。當(dāng)酒精度接近13%vol的終止發(fā)酵，此時(shí)酵母BZL12糖度為7.8°Be，發(fā)酵周期最短，共35 d；其次是菌株BZL10糖度為7.1°Be，發(fā)酵周期共37 d；酵母CZ10和CZ11糖度分別為8 °Be和7.5 °Be，發(fā)酵周期分別為45 d和41 d；酵母DV10發(fā)酵周期最長，為47 d，糖度為7.2°Be。因此，本土釀酒酵母發(fā)酵周期都較短，可能與本土酵母更加適應(yīng)當(dāng)?shù)氐陌l(fā)酵環(huán)境有關(guān)系，其中釀酒酵母BZL12表現(xiàn)最佳（發(fā)酵周期35 d）。

圖1 五株酵母的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Fermentation kinetics curves of five yeasts

2.3 赤霞珠葡萄冰酒揮發(fā)性化合物分析

試驗(yàn)對(duì)五株酵母發(fā)酵冰酒樣進(jìn)行香氣物質(zhì)的定性定量分析，檢測結(jié)果見表3。由表3可知，五種釀酒酵母發(fā)酵赤霞珠葡萄冰酒共檢測到67種揮發(fā)性化合物，主要包括醇類、酯類、酸類、酮類、萜烯類。其中酵母BZL12檢測到62種香氣物質(zhì)，種類最多，含量最高（490.02 mg/L）；酵母BZL10次之，檢測到60種香氣物質(zhì)，含量474.06 mg/L；酵母CZ11檢測到59種香氣物質(zhì)，含量434.80 mg/L；酵母DV10和CZ10種類較少，分別檢測到56和54種香氣物質(zhì)，含量分別為469.05 mg/L、410.67 mg/L。

酵母BZL12酯類物質(zhì)含量最高，為145.31 mg/L，酵母CZ10、CZ11及BZL10酯類物質(zhì)含量分別為78.24 mg/L、96.58 mg/L及130.22 mg/L，均比酵母DV10酯類物質(zhì)含量（125.14 mg/L）低。酯對(duì)葡萄酒香氣中的花香和果香貢獻(xiàn)非常大[12-13]。其中，乙酸乙酯能產(chǎn)生愉悅的、甜的水果香，己酸乙酯產(chǎn)生果香或蘋果香，辛酸乙酯產(chǎn)生菠蘿、梨的果香，癸酸乙酯產(chǎn)生花香，月桂酸乙酯與果香有關(guān)，乙酸異戊酯則產(chǎn)生香蕉味，這些酯類是酵母發(fā)酵酒中的主要酯類[14]。

酵母BZL12、CZ10、CZ11及BZL10醇類物質(zhì)含量在323.80～337.66 mg/L之間，均與酵母DV10醇類物質(zhì)含量（335.22 mg/L）差別不大。正丙醇、異丁醇、異戊醇和2-苯乙醇是酵母合成的主要高級(jí)醇[15]，其中，異戊醇是主要的高級(jí)醇，5株酵母異戊醇含量229.68～236.85 mg/L，差異不大。

酵母BZL12、CZ10、CZ11及BZL10萜烯類物質(zhì)含量在0.11～0.18mg/L之間，均與酵母DV10醇類物質(zhì)含量（0.16mg/L）差別不大。

酵母CZ10酮類物質(zhì)含量最高，為2.75mg/L，酵母CZ11、BZL10及BZL12酮類物質(zhì)含量分別為1.82 mg/L、1.64 mg/L及1.73 mg/L，均比酵母DV10酮類物質(zhì)含量（2.28 mg/L）低。

表3 不同酵母菌株發(fā)酵冰酒揮發(fā)性香氣化合物Table 3 Volatile aroma compounds of ice wine fermented by different yeast strains mg/L

續(xù)表

酵母BZL12酸類物質(zhì)含量最高，為490.02 mg/L，其次是酵母BZL10（474.06 mg/L），酵母CZ10、CZ11酸類物質(zhì)含量分別為410.67 mg/L、434.80 mg/L，均比酵母DV10酸類物質(zhì)含量（469.05 mg/L）低。

綜上所述，酵母BZL12發(fā)酵冰酒揮發(fā)性香氣化合物檢測到香氣物質(zhì)種類最多，含量最高，適合作為冰酒制備的優(yōu)良菌株。

2.4 赤霞珠葡萄冰酒的感官分析

對(duì)5種酵母發(fā)酵的赤霞珠葡萄冰酒樣品進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，各酵母在相同的感官特性上所表達(dá)的每種特性的強(qiáng)度不同。整體感官評(píng)價(jià)得分由高到低依次為：BZL12（95分）、CZ11（90分）、BZL10（80分）、CZ10（74分）、DV10（56分）；酵母BZL12發(fā)酵的酒樣花香、黑色漿果香、蜂蜜香比較明顯，具有較低的生青味，可能與酵母合成大量的酯類有關(guān)[16]；CZ11發(fā)酵的酒樣堅(jiān)果香、奶油香比較明顯；CZ10和DV10菌株發(fā)酵酒樣的生青味較大；而菌株BZL10具有較突出的奶油香。酵母菌株影響葡萄酒的香氣[17-20]。不同酵母發(fā)酵赤霞珠葡萄酒香氣物質(zhì)存在差異性[18]。

圖2 各酵母菌株的二次判別分析數(shù)據(jù)蜘蛛網(wǎng)形圖Fig.2 Spider web chart of quadratic discriminant analysis data of yeast strains

3 結(jié)論

本土酵母BZL12發(fā)酵冰酒生成的香氣物質(zhì)種類最為豐富，香氣物質(zhì)含量最高，酯類和醇類總量均高于商業(yè)酵母DV10。感官分析結(jié)果表明，酵母BZL12發(fā)酵葡萄酒的整體評(píng)價(jià)最高，理化指標(biāo)滿足相關(guān)國標(biāo)要求。在香格里拉產(chǎn)區(qū)冰葡萄酒釀造中，可以利用本土酵母BZL12替代商業(yè)酵母DV10增加冰酒香氣的復(fù)雜性。此外，不同本土酵母具有生產(chǎn)不同風(fēng)味特征葡萄酒的應(yīng)用潛力，可以根據(jù)酵母的發(fā)酵性能、產(chǎn)香特性等釀造特定類型的葡萄酒。還可以用不同類型酵母按一定比例混合發(fā)酵，根據(jù)市場需求生產(chǎn)不同風(fēng)味葡萄酒。