低能N+離子注入誘變選育金耳多糖高產(chǎn)菌株的研究

蔣 益 鄭惠華 劉廣建* 薛 璟 季宏更 張 蕾

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

金耳（Tremella aurantialba）為食藥用菌中的珍稀品種之一，又稱黃木耳，隸屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、銀耳目、銀耳科、銀耳屬。金耳多糖是金耳的重要化學(xué)成分之一，研究證實金耳多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力、抑制腫瘤、降血糖、降血脂的作用，同時在抗?jié)?、抗氧化、保肝、抗輻射、抗炎等方面具有良好的保健功效[1]。金耳子實體是由外層的金耳和內(nèi)層的毛韌革菌組成的異質(zhì)復(fù)合體，我國從20世紀(jì)80年代開始分離馴化金耳菌種，由于金耳寄生的特殊性及栽培的需求，目前金耳菌種多數(shù)為復(fù)合菌株[2]，用于液體發(fā)酵的純金耳菌種稀缺，因此，金耳菌種選育方面的研究顯得尤為重要。在潮濕的條件下，金耳成熟的擔(dān)孢子不容易發(fā)芽產(chǎn)生芽管，但容易似酵母菌那樣以芽殖方式產(chǎn)生大量酵母狀的分生孢子，這種分生孢子能像酵母菌那樣，以芽殖的方式再產(chǎn)生大量酵母狀的芽孢，使分生孢子的數(shù)量不斷增多[3]，這種生長速度快的酵母狀分生孢子是誘變的理想材料。離子注入微生物是通過離子注入誘變出發(fā)菌株，通過對目標(biāo)性狀的生物效應(yīng)分析，篩選獲得高產(chǎn)、高效的突變菌株[4]。此方法在金耳人工誘變育種中尚未見報道，筆者進(jìn)行了低能氮離子注入誘變選育金耳的試驗，旨在為金耳選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試金耳菌株:金耳酵母狀分生孢子菌株TA08，由江蘇省蘇微微生物研究有限公司分離得到，改良PDA培養(yǎng)基4℃保存。

培養(yǎng)基:改良PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，加水1000 mL，瓊脂粉20 g，pH自然。金耳液體培養(yǎng)基為蔗糖10 g，葡萄糖 20 g，酵母膏 2 g，蛋白胨 2 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，加水1000 mL，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉30 g，豆餅粉10 g，蔗糖5 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，加水1000 mL，pH自然。

主要設(shè)備:LZD-900型離子注入機(jī)（南京工業(yè)大學(xué)生物工程中心）。

1.2 試驗方法

1.2.1 低能N+離子注入誘變

1.2.1.1 離子注入前處理

將金耳TA08接種于金耳液體培養(yǎng)基中，150 r∕min，25 ℃搖床培養(yǎng)2 d，然后用無菌水調(diào)整成濃度為105個∕mL級的金耳酵母狀孢子懸液。吸取0.1 mL的孢子懸液于無菌空培養(yǎng)皿中，于超凈工作臺中快速涂勻風(fēng)干，立即注入低能氮離子。

1.2.1.2 低能N+離子注入

低能N+離子注入前，LZD-900型離子注入機(jī)開機(jī)預(yù)熱2 h，用紫外線對靶室持續(xù)消毒30 min，調(diào)節(jié)靶室真空度為10-3Pa，注入物質(zhì)N+提前加速到20 KeV，對樣品注入劑量分別為10×1014、20×1014、30×1014、60×1014、80×1014、100×1014、120×1014ions∕cm2。試驗組采用間歇式脈沖注入低能N+離子，連續(xù)注入5 s后間隔15 s，對照組置于靶室真空中，不注入低能N+離子。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.2 存活率統(tǒng)計

將經(jīng)過氮離子注入的培養(yǎng)皿和對照處理（僅抽真空而沒有離子注入）的培養(yǎng)皿用1 mL無菌水洗脫，取0.1 mL涂布于金耳固體培養(yǎng)基平板上，25℃避光培養(yǎng)4 d后計數(shù)，然后以注入劑量為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，繪制金耳在不同劑量的N+離子注入下的存活率曲線。

存活率=某劑量下離子注入組菌落數(shù)∕對照組平板上生長的菌落數(shù)×100%

1.2.3 低能N+離子注入對金耳菌株突變率的影響

以出發(fā)菌株作為對照，隨機(jī)挑取接受離子注入誘變后形成的菌落分別進(jìn)行液體發(fā)酵試驗，每個劑量挑取30個菌株，考察菌株的多糖產(chǎn)量。高于對照5%以上的為正突變，低于對照5%以上的為負(fù)突變，正突變的菌株數(shù)占所取菌株總數(shù)的比值為正突變率，負(fù)突變的菌株數(shù)占所取菌株總數(shù)的比值為負(fù)突變率。

1.2.4 誘變金耳菌株的篩選

1.2.4.1 初篩

將經(jīng)離子束注入后的培養(yǎng)皿用1 mL無菌水洗脫，取0.1 mL涂布于固體平板上，待菌落長成后，挑取生長較快、菌落較大的保存于試管中。根據(jù)以上步驟2最終確定的劑量，選擇該劑量下保存的菌株，接種于金耳液體培養(yǎng)基，150 r∕min，25℃，搖床培養(yǎng)3 d后，再按5%接種量與出發(fā)菌株同步接種到金耳液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，150 r∕min，25℃培養(yǎng)4 d后用血球計數(shù)法統(tǒng)計酵母狀孢子數(shù)量。

1.2.4.2 復(fù)篩

將初篩得到的優(yōu)勢菌株接種于金耳液體培養(yǎng)基中，150 r∕min，25 ℃，搖床培養(yǎng)3 d后，按5%接種量與出發(fā)菌株同步接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，與出發(fā)菌株同時進(jìn)行液體發(fā)酵。測定多糖產(chǎn)量，選擇多糖產(chǎn)量高于對照菌株5%以上的菌株作為復(fù)篩后的誘變高產(chǎn)菌株。

1.2.4.3 多糖測定

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液（包含菌體）收集后，超聲30 min，而后煮沸處理2 h，離心收集上清后殘渣加等體積水繼續(xù)煮沸2 h，合并兩次提取液，濃縮至原體積1∕5，加入4倍體積的無水乙醇靜置沉淀，后采用硫酸-蒽酮法[5]測定多糖含量，再計算多糖產(chǎn)量。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗

對篩選所得的優(yōu)勢誘變菌株進(jìn)行發(fā)酵性能穩(wěn)定性試驗。誘變菌株連續(xù)傳代20代，取第10代和20代發(fā)酵，測定生物量和多糖產(chǎn)量，與第一代比較，選擇多糖產(chǎn)量穩(wěn)定、性狀無變化的菌株作為最終的誘變多糖高產(chǎn)金耳菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 低能N+離子注入誘變對存活率的影響

不同N+注入劑量下金耳的存活率曲線（圖1）顯示，在注入劑量10×1014～120×1014ions∕cm2，隨著注入劑量的增加，存活率呈現(xiàn)先降低、后升高再降低的“馬鞍型”變化趨勢?？赡苁怯捎诘蛣┝侩x子注入細(xì)胞的射程較短，離子只對細(xì)胞表面造成損傷和刻蝕，因而存活率較高；隨著注入劑量的增加，細(xì)胞表面的刻蝕嚴(yán)重，離子損及細(xì)胞內(nèi)部并產(chǎn)生大量的自由基等，致使存活率急劇下降；但下降到一定值時出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，當(dāng)劑量累積到一定值時，細(xì)胞某種修復(fù)機(jī)制被激活，存活率有所回升；當(dāng)劑量繼續(xù)增加時，細(xì)胞損傷將無法修復(fù)，存活率繼續(xù)下降。研究發(fā)現(xiàn)，在“馬鞍型”區(qū)域菌株最容易出現(xiàn)較高的正突變。

圖1 不同N+離子注入劑量下金耳的存活率曲線

2.2 低能N+離子注入對菌株突變率的影響

圖2 不同N+離子注入劑量對金耳突變率的影響

在低能N+離子注入劑量60×l014～80×1014ions∕cm2內(nèi)正突變率較高，在劑量 60×l014ions∕cm2時，正突變率最高（圖2）。有研究表明，當(dāng)誘變致死率達(dá)70%～80%時，產(chǎn)生較高的正突變，試驗中正突變占優(yōu)勢的注入劑量范圍正對應(yīng)存活率19.3%～26.2%的曲線段（圖1），綜合圖1及圖2的結(jié)果，低能N+離子注入最適誘變劑量為 60×l014ions∕cm2。

2.3 誘變菌株的篩選結(jié)果

2.3.1 初篩

選擇60×l014ions∕cm2注入劑量下的誘變菌株進(jìn)行初篩，選取生長快、菌落大的單菌落與出發(fā)菌株（TA08）進(jìn)行液體發(fā)酵，結(jié)果篩選到29株孢子量高于對照5%的菌株，部分菌株（前9位）結(jié)果見表1。其 中 菌 株 TAY6034、TAY6042、TAY60104、TAY60108、TAY6048、TAY6098具有較高的產(chǎn)量，較出發(fā)菌株TA08均有20%以上的提升，而4 d內(nèi)生長速度最快的為TAY6048。

表1 誘變菌株的初篩結(jié)果

2.3.2 復(fù)篩

對初篩菌絲量前9的優(yōu)勢菌株進(jìn)行復(fù)篩，以多糖產(chǎn)量為考察依據(jù)，篩選得到多糖產(chǎn)量高于對照菌株5%的有5株，其中3株優(yōu)勢菌株TAY60104、TAY6048、TAY6098（圖 3），其多糖產(chǎn)量分別為2.55 g∕L，2.66 g∕L，2.58 g∕L，比出發(fā)菌株分別提高了7.59%，12.34%，8.87%。

圖3 誘變菌株的復(fù)篩結(jié)果

2.4 遺傳穩(wěn)定性試驗

將復(fù)篩所得3株優(yōu)勢菌株與對照菌株一起進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗，結(jié)果見表2。由表2可知，多次傳代后菌株TAY60104多糖產(chǎn)量下降較明顯，菌株TAY6048與TAY6098從初代到20代，多糖產(chǎn)量變化不大，其中TAY6048產(chǎn)量穩(wěn)定，基本上維持在2.7 g∕L左右，說明其遺傳穩(wěn)定性較好，故選定其為適宜于液體發(fā)酵的金耳多糖高產(chǎn)菌株。

表2 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

3 小結(jié)與討論

經(jīng)過多年的研究實踐，食用菌菌種選育己從最初的選擇育種、雜交育種發(fā)展到物理化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合育種以及運用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行育種等[6]，但目前金耳的誘變選育研究開展較少。離子注入技術(shù)是我國自主研發(fā)且具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的技術(shù)，以其獨特的誘變機(jī)理和較顯著的生物學(xué)效應(yīng)受到廣泛關(guān)注，離子注入的能量、劑量、脈沖次數(shù)等參數(shù)可以按需要進(jìn)行不同組合，這種聯(lián)合作用不但使誘變具有較高的方向性和可控性，還可使產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)比單一輻射更為豐富，為篩選有利的突變型提供了較大空間[7]。該技術(shù)在食藥用真菌誘變中已有應(yīng)用。汪維云[8]采用20×1013～100×1013ion∕cm2劑量的 N+離子注入灰樹花菌株，發(fā)現(xiàn)注入劑量在 40×1013～60×1013ion∕cm2時，能促進(jìn)其菌體生長、提高纖維素酶活性，同時提高多糖產(chǎn)量，并用紙層析和GC法對離子注入處理和對照菌的產(chǎn)物進(jìn)行比較鑒定，結(jié)果顯示多糖性質(zhì)與結(jié)構(gòu)一致。凡啟超[9]采用低能氮離子束注入松乳菇，篩選到誘變菌株Ld-135，其液體發(fā)酵生物量為1.24 g∕100 mL，胞內(nèi)多糖的含量為1.27%，粗蛋白含量為26.13%，較出發(fā)菌株均具有顯著性提高。董先茹等[10]采用氮離子束誘變蟹味菇菌株，篩選出了相對于出發(fā)菌株麥角甾醇顯著提高的突變菌株X-004，其菌蓋中麥角甾醇含量為 4.228 mg∕g，菌柄中為1.690 mg∕g，蛋白質(zhì)和粗纖維含量分別達(dá)到35.41%和23.29%。

金耳子實體是由外層的金耳和內(nèi)層的毛韌革菌組成的異質(zhì)復(fù)合體，金耳菌絲的生長必須借助于有親和性的伴生菌（毛韌革菌）菌絲體的幫助，才能正常地生長發(fā)育。用金耳子實體提取或混合菌株發(fā)酵生產(chǎn)的金耳多糖已少量投放市場，但由于金耳菌種寄生的這種特殊性，固體栽培金耳子實體產(chǎn)量小，周期長，易受季節(jié)影響以及病蟲害侵襲，沒有足夠的金耳子實體進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)；而用混合菌株發(fā)酵時，條件不同導(dǎo)致金耳菌和毛韌革菌消長也會不同，常常粗毛韌革菌占優(yōu)勢，金耳少，所獲得二次代謝物的多糖有差異，產(chǎn)量與品質(zhì)不穩(wěn)定。因而可以利用金耳酵母狀分生孢子發(fā)酵生產(chǎn)多糖，在適宜條件下得到恒定的多糖成分。筆者采用氮離子注入技術(shù)對金耳進(jìn)行誘變，提高了誘變的效率和正突變的概率，經(jīng)不同劑量的氮離子注入后，在最適劑量 60×1014ions∕cm2下，篩選到一株遺傳性狀穩(wěn)定的金耳新菌株，其液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量遠(yuǎn)高于出發(fā)菌株，且誘變后的金耳菌株不易發(fā)生退化，遺傳性狀穩(wěn)定，填補(bǔ)了金耳菌種誘變方面的空白，為金耳多糖的生產(chǎn)提供了一種新的高效高產(chǎn)菌株。