乙醇脅迫對植物乳桿菌膜生理及黏附性的影響

王婷婷，李 春，李佳棟，杜 鵬，劉麗波,*，徐占文，楊雨澤

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

植物乳桿菌具有益生特性，已被廣泛應(yīng)用于商業(yè)產(chǎn)品中[1]。益生菌只有通過口攝入并在人體胃腸道中定植足夠的濃度，才能發(fā)揮其生物活性并賦予宿主健康[2]。因此為能在人體胃腸道中長期定植并發(fā)揮其益生功能，益生菌必須對黏膜有一定的黏附能力[3]?，F(xiàn)普遍通過體外模擬實(shí)驗(yàn)近似反映益生菌在宿主體內(nèi)的黏附情況，目前最廣泛使用的體外黏附模型是人結(jié)腸癌腺細(xì)胞系[4]：Caco-2和HT-29。與其他乳酸菌相似，植物乳桿菌在產(chǎn)品生產(chǎn)和胃腸道中常遇到各種環(huán)境壓力[5-6]，其中乙醇脅迫是其存活的重要挑戰(zhàn)之一。乙醇作為有機(jī)溶劑，主要通過破壞菌體細(xì)胞膜抑制植物乳桿菌的正常生長代謝。細(xì)胞膜作為胞內(nèi)介質(zhì)與外部環(huán)境之間的第一道屏障，在細(xì)胞生長、代謝、能量傳導(dǎo)和維持恒定的胞內(nèi)環(huán)境中起著重要作用[7]。乙醇滲入細(xì)胞膜中可以改變膜結(jié)構(gòu)、破壞膜完整性，從而抑制膜功能，影響菌體的關(guān)鍵酶活性[8]，致使菌體正常生理代謝調(diào)控異常，存活率降低。而且，由于細(xì)胞膜受損，可能造成菌體特異性黏附能力降低，影響其發(fā)揮益生功能。

然而，微生物具有許多自我保護(hù)機(jī)制以適應(yīng)不利的環(huán)境，其中，膜狀態(tài)的調(diào)節(jié)是細(xì)菌抵抗惡劣環(huán)境最常見的反應(yīng)[9]。如Xiao Gong等[10]發(fā)現(xiàn)唾液乳桿菌對滲透壓力的抗性與膜不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸比例及油酸的環(huán)丙烷化有關(guān)。Heipieper等[11]發(fā)現(xiàn)，在乙醇脅迫下惡臭假單胞菌可通過改變順式脂肪酸和反式脂肪酸的比例增加膜強(qiáng)度，提高耐受性。目前涉及乙醇脅迫下的乳桿菌益生能力及細(xì)胞膜生理應(yīng)激反應(yīng)尚未完全明確。因此，本研究以植物乳桿菌為研究對象，利用人體結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29作為體外黏附模型，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇脅迫菌體，通過測定菌體對HT-29細(xì)胞的黏附能力及細(xì)胞膜表現(xiàn)出的應(yīng)激反應(yīng)，分析導(dǎo)致菌體失活及益生功能降低的主要因素，進(jìn)一步探究乙醇脅迫損傷的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus planturam）ZLC-18，保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

14%三氟化硼（BF3）-甲醇溶液 上海北諾生物科技有限公司；結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 上海中科院；LIVE/DEAD BacLightTMBacterial Viability Kit試劑盒 賽默飛世爾科技有限公司；無水乙醇及其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰公司；GI54WS高壓滅菌器 廈門致微設(shè)備有限公司；GL-21M離心機(jī)上海市離心機(jī)械研究所；EVOS FL Auto 2熒光顯微鏡賽默飛-世爾科技有限公司；飛納臺式掃描電鏡 上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司；GC7890/MS5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫（德國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

將植物乳桿菌ZLC-18接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～14 h，連續(xù)活化2 代。將活化好的供試菌株按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接到MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)末期，調(diào)節(jié)對數(shù)末期菌液的OD600nm值使菌體濃度為109CFU/mL，備用。

1.3.2 乙醇脅迫下植物乳桿菌存活率的測定

取10 mL上述固定OD值的菌液，離心后重懸于等體積乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0%、4%、6%、8%的MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.2 mol/L，pH 7.2～7.4）洗滌2 次并重懸于等體積生理鹽水中，取1 mL重懸液，稀釋不同梯度后涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，測定0～4 h內(nèi)菌體存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次做3 個平行。按照NB/NA計(jì)算存活率，其中，NA為未受乙醇脅迫的活菌數(shù)，NB為經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫后的活菌數(shù)[12]。

1.3.3 乙醇脅迫處理實(shí)驗(yàn)

取生長到對數(shù)末期、濃度為109CFU/mL的菌液10 mL，經(jīng)4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集菌泥，將菌泥加到等體積且乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0%、4%、6%、8%的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，調(diào)節(jié)OD600nm值使菌液濃度為108CFU/mL，用無菌PBS洗滌2 次后重懸于等體積PBS中，作為待測樣品。

1.3.4 細(xì)胞膜完整性測定

使用LIVE/DEAD試劑盒測定。將熒光染料碘化吡啶和SYTO9以等體積混合，取3 μL混合染料加到1 mL待測樣中，混合均勻后避光孵育15 min。取5 μL染色后的樣液滴加在干凈的載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，避免出現(xiàn)氣泡，立即在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 超微結(jié)構(gòu)測定

向不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫4 h后的菌泥中加入2.5%的戊二醛（pH 6.8）固定樣品，用0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）反復(fù)沖洗3 次。用50%、70%、90%、100%乙醇溶液逐級脫水10 min。再用乙醇-丁叔醇（1∶1，V/V）混合液、叔丁醇各置換15 min，4 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入0.5 mL叔丁醇，于-20 ℃冰箱中放置30 min后進(jìn)行冷凍干燥。在樣品表面上鍍一層金屬膜，掃描電鏡下觀察細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)。

1.3.6 黏附性改變

1.3.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出HT-29細(xì)胞凍存管并置于37 ℃水浴中復(fù)蘇，加入適量RPMI1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%雙抗），經(jīng)1 000 r/min離心5 min，將細(xì)胞收集于培養(yǎng)瓶中，并加入4 mL RPMI1640完全培養(yǎng)液，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)到80%時，用0.25%胰酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化傳代。2 d更換一次培養(yǎng)液，4 d傳代一次，約傳代5 次后可用于黏附實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.2 乳桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附觀察

向細(xì)胞瓶中加入1 mL 0.25%胰酶-EDTA，將培養(yǎng)好的HT-29細(xì)胞消化3 min，再加入適量的RPMI1640不完全培養(yǎng)液（含血清，不含雙抗）終止消化并調(diào)整細(xì)胞濃度約為5×105個/mL。在無菌條件下，將細(xì)胞爬片置于6 孔培養(yǎng)板中，并在爬片上滴加1 mL細(xì)胞懸液，靜置孵育1 h，補(bǔ)加1 mL不完全培養(yǎng)液繼續(xù)孵育至細(xì)胞長至單層，用無菌PBS洗滌2 次，向每個培養(yǎng)孔中加入1 mL細(xì)菌待測樣（108CFU/mL），在培養(yǎng)箱中孵育2 h后取出細(xì)胞爬片，用PBS洗滌3 次去除未黏附的細(xì)菌，并用0.4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，晾干后進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察植物乳桿菌的黏附情況，每個實(shí)驗(yàn)做4 次平行。

1.3.6.3 乳桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附計(jì)數(shù)[13]

細(xì)胞培養(yǎng)與處理同1.3.6.1、1.3.6.2節(jié)，除將細(xì)胞懸浮液滴在6 孔培養(yǎng)板上而不放置細(xì)胞爬片。經(jīng)PBS洗滌后，向板中加入0.7 mL胰酶作用3 min，再加0.3 mL不完全培養(yǎng)液以終止消化。加入0.5 mL 0.1%的Triton X-100，混合均勻后靜置10 min，以裂解細(xì)胞。將混合物梯度稀釋后利用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算黏附的細(xì)菌數(shù)。同時，選取長至單層的6 孔培養(yǎng)板，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算每個孔板中的細(xì)胞數(shù)。每個處理做4 個平行，根據(jù)下式計(jì)算平均每個細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)：

1.3.7 細(xì)胞膜脂肪酸組成比較

1.3.7.1 膜脂肪酸的提取、甲酯化

細(xì)胞膜脂肪酸的提取、甲酯化及氣相色譜-質(zhì)譜檢測條件參照文獻(xiàn)[14-15]，并稍作修改。取經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫4 h且濃度為108CFU/mL的待測樣各200 mL，經(jīng)3 000 r/min離心5 min棄上清液，用Milii-Q水反復(fù)洗滌細(xì)胞3 次后進(jìn)行液氮研磨，取0.3 g研磨后的菌體，加入1.5 mL氯仿和0.6 mL 0.05%乙酸溶液旋渦振蕩4 min，再加入3 mL溶液B（氯仿（含0.01%二丁基羥基甲苯）-甲醇為2∶1的混合液）振蕩4 min，2 000 r/min離心3 min，吸取下層清液于新的玻璃管中。此萃取過程（加入3 mL溶液B，振動離心并收集下層）重復(fù)3～5 次，直至細(xì)胞離心后沉降至離心管底。收集所有下層清液并加入1 mL 1 mol/L的KCl溶液，渦旋1 min，2 000 r/min離心1 min棄上清液。向保留的下層中加入2 mL水沖洗提取物，渦旋1 min，2 000 r/min離心1 min棄上清液。此時，下層清液中包含細(xì)胞總脂質(zhì)（但主要為細(xì)胞膜中磷脂），將下清液置于33 ℃的水浴旋蒸，并用1 mL氯仿-甲醇（1∶1）混合溶液溶解蒸干的樣品，冷凍干燥過夜。加入600 μL 14% BF3-甲醇溶液和10 μL十七烷酸（C17:0，溶于甲醇，2 mg/mL），于100 ℃沸水浴25 min后用流水使其迅速冷卻，加入600 μL正己烷萃取，充分混勻，經(jīng)2 000 r/min離心5 min，取正己烷相進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，每個取樣點(diǎn)取3 個平行樣品。

1.3.7.2 脂肪酸檢測

采用氣相色譜-質(zhì)譜對樣品進(jìn)行定性和定量分析。色譜柱：HP-5氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；升溫程序：70 ℃保持2 min，然后升至290 ℃（8 ℃/min），保持3 min；載氣（He）流速1 mL/min；恒壓9.1 kPa；進(jìn)樣量1 μL；不分流模式，流量50 mL/min；載氣節(jié)省，15 mL/min。質(zhì)譜參數(shù)：電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；掃描范圍m/z 50～800。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫對植物乳桿菌存活率的影響

圖1 乙醇脅迫對植物乳桿菌存活率的影響Fig. 1 Effect of ethanol stress on the survival rate of L. plantarum

由圖1可以看出，經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫0～4 h，植物乳桿菌的存活率均依次下降。經(jīng)4%乙醇脅迫處理0～3 h，菌體的存活率下降相對緩慢，在脅迫3 h后大幅度下降，4 h處菌體存活率為53.8%；經(jīng)6%乙醇脅迫處理1.5 h時，菌體存活率下降幅度較大，4 h處菌體存活率為48.7%；經(jīng)8%乙醇脅迫處理0.5 h時，菌體的存活率下降了21.7%，在2～2.5 h間出現(xiàn)二次大幅度下降，在4 h時菌體存活率僅為40.2%。結(jié)果說明，經(jīng)4%、6%乙醇處理1 h內(nèi)，植物乳桿菌能迅速適應(yīng)環(huán)境，維持自身活性，存活率在90%以上，但隨著脅迫時間的延長，菌體存活率均逐漸降低，可見長時間低體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫也會使菌體生長變緩，生長周期延長[16]。乙醇可引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，破壞膜功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)中心碳代謝受阻。同時，乙醇可通過刺激細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。由乙醇脅迫引起的這些聯(lián)合作用將抑制植物乳桿菌細(xì)胞的生長，但不一定殺死細(xì)胞；而經(jīng)8%乙醇脅迫0.5 h時，菌體生長受到顯著抑制，存活率明顯降低，隨后菌體產(chǎn)生適當(dāng)應(yīng)激反應(yīng)抗環(huán)境壓力，維持一定的存活率。然而，隨著脅迫時間延長，菌體難以通過其自身的保護(hù)機(jī)制抵抗惡劣環(huán)境而造成二次大量死亡。這一結(jié)果與朱敏[18]、李愛霞等[19]研究結(jié)果一致，乙醇脅迫會影響菌體正常的生長代謝，高體積分?jǐn)?shù)乙醇甚至?xí)斐删w大量死亡。

2.2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫對植物乳桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

圖2 乙醇脅迫對植物乳桿菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 2 Effects of ethanol stress on the cell membrane integrity of L. plantarum

細(xì)胞膜的完整性對維持細(xì)胞活力和代謝功能至關(guān)重要[20]，因此，微生物會調(diào)動許多機(jī)制抵抗來自環(huán)境的壓力，維持細(xì)胞膜的完整性。幾乎所有的對照組菌體都發(fā)綠色熒光（圖2a），說明其細(xì)胞膜完整性未受到損傷，菌體活力良好；經(jīng)4%乙醇脅迫處理后，菌體大部分仍發(fā)綠色熒光，有少數(shù)發(fā)紅色熒光（圖2b），說明大部分菌體可維持自身細(xì)胞膜完整性不被破壞，只有少數(shù)細(xì)胞膜完整性受到了一定程度的損傷，甚至造成細(xì)胞死亡；而經(jīng)6%、8%乙醇脅迫處理后，均有超過半數(shù)的菌體發(fā)紅色熒光（圖2c、d），說明菌體細(xì)胞膜完整性大部分都受到破壞，植物乳桿菌因難以抵御乙醇的毒害而造成大量死亡。細(xì)胞膜的穩(wěn)定性主要與膜疏水基相互作用有關(guān)，乙醇對菌體的毒害主要是破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的膜疏水核心，使這一區(qū)域的極性增強(qiáng)，破壞了細(xì)胞膜對極性分子自由通過的滲透屏障，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性受損[21]。此外，質(zhì)膜ATP酶（H+-ATPase）是質(zhì)膜中的主要蛋白質(zhì)，它的作用是維持細(xì)胞質(zhì)中離子的動態(tài)平衡[22]，乙醇可能通過降低質(zhì)膜ATP酶的活性使其功能失常，影響菌體膜的通透性，致使細(xì)胞膜完整性受損，細(xì)胞膜滲透性及流動性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，菌體生長受到抑制。

2.3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫對植物乳桿菌超微結(jié)構(gòu)的影響

圖3 乙醇脅迫下植物乳桿菌形態(tài)變化的掃描電鏡觀察Fig. 3 Scanning electron microscopy of the morphological changes of L. plantarum under ethanol stress

對照組菌體為長桿菌且結(jié)構(gòu)基本完好，細(xì)胞表面沒有明顯的細(xì)胞碎片（圖3a）；與對照組相比，經(jīng)4%乙醇脅迫后的菌體細(xì)胞表面粗糙、塌陷，有少數(shù)破裂，并出現(xiàn)許多稍粗且短的桿狀細(xì)胞（圖3b）；經(jīng)6%乙醇脅迫后，細(xì)胞表面更加粗糙，許多細(xì)胞破裂并有細(xì)胞質(zhì)流出，細(xì)胞間出現(xiàn)黏連的情況（圖3c）；8%乙醇脅迫處理后，不僅觀察到破碎的細(xì)胞，而且細(xì)胞周邊變得模糊，細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞聚集并彼此黏連（圖3d）。結(jié)果表明，植物乳桿菌對抗環(huán)境壓力的機(jī)制可能與菌體的形態(tài)變化有關(guān)[23]。低體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫時，植物乳桿菌可通過改變自身的長度、寬度及凹陷程度減少與乙醇的接觸面積，維持細(xì)胞的正常生命活動。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞通過相互聚集抵抗乙醇脅迫，但部分菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能已被破壞，致使中心碳代謝受阻，胞內(nèi)物質(zhì)流出，菌體生長受到顯著抑制，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值時可直接造成細(xì)胞裂解。

2.4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫對植物乳桿菌黏附性的影響

體外培養(yǎng)人體結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，當(dāng)在6 孔培養(yǎng)板中長至單層時，由血球計(jì)數(shù)板計(jì)得細(xì)胞數(shù)為（1.15±0.3）×106個。如圖4所示，未受乙醇脅迫的植物乳桿菌能夠很好地黏附在HT-29細(xì)胞周圍；經(jīng)4%乙醇脅迫后的乳桿菌仍能整齊地黏附在細(xì)胞周圍；經(jīng)6%、8%乙醇脅迫后，植物乳桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附變得沒有規(guī)則，黏附能力也顯著低于對照組。這與平板計(jì)數(shù)的結(jié)果一致，見圖5。其中，對照組黏附細(xì)菌數(shù)為（49.50±1.42）CFU/cell，經(jīng)4%、6%、8%乙醇脅迫處理后黏附數(shù)量分別為（3 1.2 5±0.9 3）、（2 7.2 5±0.7 4）、（19.75±0.82）CFU/cell。細(xì)菌的黏附可分為特異性黏附和非特異性黏附[24]。特異性黏附是通過細(xì)菌表面的黏附素與細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合；非特異性黏附則與菌體的表面性質(zhì)有關(guān)，特別是疏水性、表面電荷、自聚集能力等。乙醇等有機(jī)溶劑可以導(dǎo)致菌體細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的解聚或變性[25]，使菌體與細(xì)胞表面的特異性黏附受到抑制，同時還會引起細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層變?yōu)橄嗷ソ徊媾帕校档图?xì)胞膜表面電荷密度，改變脂雙分子層厚度，使疏水核心消失等[26]，因此造成植物乳桿菌黏附HT-29細(xì)胞的能力降低。實(shí)際上，當(dāng)益生菌進(jìn)入宿主腸道后，首先黏附于覆蓋在腸上皮細(xì)胞表面的黏液層，再結(jié)合在腸上皮細(xì)胞上。體外黏附模型沒有考慮到覆蓋在腸道上皮細(xì)胞最外層的黏液層，這點(diǎn)有異于人體腸道內(nèi)的真實(shí)環(huán)境[24]。但采用人體結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29作為黏附模型，能表現(xiàn)出人體成熟腸上皮細(xì)胞的特性，且具有快捷直觀的優(yōu)點(diǎn)。因此，由乙醇脅迫造成的植物乳桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附能力降低可在一定程度上反映出植物乳桿菌在胃腸道中定植的能力下降，影響其益生功能的正常發(fā)揮。

圖4 植物乳桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附能力（×1 000）Fig. 4 Adhesion ability of L. plantarum to HT-29 cell (× 1 000)

圖5 植物乳桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附分析Fig. 5 Adhesion capacity of L. plantarum to HT-29 cells

2.5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫對植物乳桿菌膜脂肪酸組成的影響

圖6 乙醇脅迫下植物乳桿菌細(xì)胞膜中脂肪酸的分布Fig. 6 Alteration in the distribution of fatty acids in the cell membrane of L. plantarum upon ethanol stress

不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比率的變化是用于調(diào)節(jié)膜流動性的最常見的細(xì)胞機(jī)制，脂肪酸鏈長度的增加是提高環(huán)境脅迫下菌體存活率的另一重要機(jī)制[27]。Guan Xueli等[28]通過破碎菌體細(xì)胞，選用極性提取溶劑，促使細(xì)胞膜中結(jié)合態(tài)脂類游離，并增大與磷脂等極性脂類的親和性，提出總極性脂質(zhì)（主要含有磷脂和鞘脂）作為細(xì)胞膜脂肪酸的提取方法。本實(shí)驗(yàn)選用氯仿-甲醇及0.05%乙酸溶液為提取液，提取菌體細(xì)胞膜脂肪酸。如圖6所示，經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫4 h后，植物乳桿菌細(xì)胞膜中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的組成發(fā)生了變化，其中最顯著的變化是飽和脂肪酸含量的大幅度下降和不飽和脂肪酸含量的增加，反映了在脅迫條件下不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比率的顯著變化（圖7a），不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比率隨著乙醇脅迫的體積分?jǐn)?shù)增大而增大，而且膜脂肪酸的平均碳鏈長度在乙醇脅迫下也逐漸增大（圖7b）。結(jié)果表明，植物乳桿菌通過增加其膜中長鏈不飽和脂肪酸的比例降低由乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞膜流動性增加，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定。這些變化與許多其他細(xì)菌報(bào)道的相似[29-30]。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞膜飽和脂肪酸合成途徑受阻[31]，以及不飽和脂肪酸合成的增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比率增大，而較長的鏈更容易跨越雙層膜，促進(jìn)?；溙畛洳⑹鼓きh(huán)境更像凝膠狀，通過減小游離?；溎┒说倪\(yùn)動降低膜的流動性和不穩(wěn)定性[32]，使植物乳桿菌在乙醇脅迫下保持自身的穩(wěn)定狀態(tài)，維持細(xì)胞活力。

3 結(jié) 論

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，植物乳桿菌存活率依次降低，經(jīng)8%乙醇脅迫處理后菌體的存活率僅為40.2%。乙醇脅迫引起的聯(lián)合作用可改變細(xì)胞形態(tài)，破壞細(xì)胞膜完整性，阻斷膜功能，造成菌體代謝活力減弱，降低黏附HT-29細(xì)胞的能力。通過比較不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫下細(xì)胞膜的應(yīng)激反應(yīng)，可以看出植物乳桿菌的抗乙醇脅迫能力與細(xì)胞膜的完整性有關(guān)，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比率及脂肪酸平均鏈長的增大在菌體抗乙醇脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。本研究提供了植物乳桿菌在乙醇環(huán)境中所作出的應(yīng)激反應(yīng)及經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫后的菌體對HT-29細(xì)胞黏附性的影響，為提高該菌種在乙醇脅迫下的工業(yè)效用提供幫助。