黑曲霉酸性果膠裂解酶的高效表達(dá)及其在果汁澄清中的應(yīng)用

何玉蘭，王 斌,2，潘 力,2,*

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

果膠酶是指降解果膠質(zhì)的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，根據(jù)其作用機(jī)理可分為3 大類(lèi)：聚半乳糖醛酸酶（E.C.3.2.1.2）、果膠甲酯酶（E.C.3.1.11.1）、果膠裂解酶（E.C.4.2.2.10）[1-3]。果膠裂解酶可直接作用于高度甲酯化果膠，不需要果膠甲酯酶的預(yù)先作用，從而避免了甲醇的生成[4]。酸性果膠裂解酶在果蔬汁加工行業(yè)中應(yīng)用十分廣泛，原因在于其最適反應(yīng)pH值與大多數(shù)果汁天然pH值接近，都為酸性[5-6]。目前文獻(xiàn)報(bào)道研究較多為最適反應(yīng)pH值為堿性或中性的果膠裂解酶，其在酸性條件下極不穩(wěn)定[7-10]，而對(duì)酸性果膠裂解酶的研究主要集中在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化和重組表達(dá)等方面[11-14]，謝茂芳等[15]實(shí)現(xiàn)了黑曲霉果膠裂解酶在大腸桿菌的異源表達(dá)，由于形成包涵體未能檢測(cè)到酸性果膠裂解酶活力；強(qiáng)慧妮等[16]將黑曲霉果膠裂解酶基因在畢氏酵母中進(jìn)行表達(dá)，得到酸性果膠酶裂解酶活力僅為2.3 U/mL；此外，Kitamoto等[17]報(bào)道的酸性果膠裂解酶活力較高為4 060.0 U/mL。但總體說(shuō)來(lái)，目前酸性果膠裂解酶表達(dá)水平不高，在較大程度上限制了其工業(yè)應(yīng)用。

曲霉表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白分泌量高、成本低、可進(jìn)行蛋白翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)，黑曲霉作為典型的絲狀真菌，被廣泛地用于重組蛋白的表達(dá)[18-20]。此外，黑曲霉作為Generally recognized as safe（GRAS）微生物被廣泛用作食品行業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌株。本研究使用黑曲霉自身強(qiáng)啟動(dòng)子（PglaA）實(shí)現(xiàn)酸性果膠裂解酶基因pelD的過(guò)量表達(dá)，通過(guò)融合6×His標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)重組果膠裂解酶的純化，研究了重組果膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)，并測(cè)定了其對(duì)3 種不同果汁（橙汁、蘋(píng)果汁和葡萄汁）的澄清效果，以期為酸性果膠裂解酶的工業(yè)化應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Match 1T1感受態(tài)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，黑曲霉（Aspergillus niger）菌株SH-2[21]、表達(dá)載體pMD18-TP均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 試劑

聚半乳糖醛酸鈉鹽、蘋(píng)果果膠（50%～75%酯化度）、柑橘果膠（≥85%酯化度） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；限制性?xún)?nèi)切酶、DNA聚合酶 日本TaKaRa公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1%蛋白胨，1%酵母膏；察氏培養(yǎng)基（Czapek-Dox，CD）培養(yǎng)基：2%葡萄糖，0.3% NaNO3，0.2% KCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.001% FeSO4·7H2O，2%瓊脂粉，pH 5.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：5%玉米淀粉，3%玉米漿，2%豆粕粉。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以黑曲霉C B S 5 1 3.8 8 基因組為模板，使用特異性引物使用特異性引物（p 1：5’-ATGAAGTACGCTGCTGGCTCTC-3’；p2：5’-tagcg aaatggattgattgtTTAGTGATGATGATGATGATGCAGGT TACCCTGACAGCG-3’）擴(kuò)增得到果膠裂解酶基因pelD（GenBank：M55657.1）。將目的基因pelD連接到表達(dá)載體pMD18-TP，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pMD18-pelD，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)抗性篩選及Apa I酶切驗(yàn)證，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.2 黑曲霉轉(zhuǎn)化及發(fā)酵培養(yǎng)

將宿主菌黑曲霉SH-2接種至YPD培養(yǎng)基，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)72 h。利用Apa I酶切線性化重組表達(dá)質(zhì)粒pMD18-pelD，采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)化宿主菌[22]。轉(zhuǎn)化子在CD培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，溫度30 ℃。提取基因組進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）鑒定及測(cè)序，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)144 h，每隔24 h取樣，測(cè)定酶活力。

1.3.3 酸性果膠裂解酶活力測(cè)定

參照Albersheim[23]方法進(jìn)行并作適當(dāng)調(diào)整。用濃度為1/15 mol/L KH2PO4-Na2HPO4（pH 5.2）緩沖液配制0.5 g/100 mL蘋(píng)果果膠。取500 μL底物預(yù)熱至40 ℃，加入250 μL適當(dāng)稀釋的粗酶液，40 ℃反應(yīng)10 min（pH 5.2），加入800 μL 0.02 mol/L H3PO4溶液終止反應(yīng)，235 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位定義為：在測(cè)定條件下，每分鐘使235 nm波長(zhǎng)處吸光度增加0.01所需的酶量。

1.3.4 重組酸性果膠裂解酶純化

由于重組酸性果膠裂解酶帶有6×His標(biāo)簽，故采用鎳柱親和層析純化重組蛋白，重組菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)144 h后，收集上清液用于純化。使用的層析柱為HisTrapTMHP，上樣量為30 mL，采用梯度洗脫法（咪唑濃度0～0.5 mol/L），流速2.0 mL/min。對(duì)收集到純化樣品進(jìn)行酶活力測(cè)定，采用BCA蛋白濃度測(cè)定方法測(cè)定蛋白含量，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)純化效果并進(jìn)行Western blot鑒定。

1.3.5 Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物

對(duì)純化后重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE結(jié)束后，將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)印跡至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉1 h；Western雜交膜清洗液洗3 次，每次5 min；用His-Tag抗體作為一抗（稀釋比例為1∶1 000）室溫孵育2 h；Western雜交膜清洗液洗3 次，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗（稀釋比例為1∶1 000）室溫孵育1 h；Western雜交膜清洗液洗3 次后，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)免疫反應(yīng)條帶。

1.3.6 重組酸性果膠裂解酶酶學(xué)特性分析

為研究重組酶的底物特異性，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，分別測(cè)定其對(duì)3 種不同酯化程度底物（聚半乳糖醛酸鈉鹽（酯化度為0%）、蘋(píng)果果膠（酯化度50%～75%）、柑橘果膠（酯化度≥85%））的酶活力，其中底物質(zhì)量濃度均為0.5 g/100 mL。

最適溫度和pH值測(cè)定：在pH 5.2條件下，測(cè)定不同溫度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）條件下的酶活力；在測(cè)得的最適反應(yīng)溫度條件下，測(cè)定不同pH值（3.0～8.0）條件下的酶活力，其中底物用相應(yīng)pH值的緩沖液溶解；以最大活力為100%。

溫度和pH值穩(wěn)定性測(cè)定：將酶液于不同溫度（30～70 ℃）處理2 h，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定剩余酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%；將酶液置于不同pH值（3.0～7.0）磷酸鹽-檸檬酸緩沖液中，40 ℃處理2 h后測(cè)定剩余酶活力；以未經(jīng)處理組的酶活力為100%。

金屬離子及表面活性劑SDS對(duì)酸性果膠裂解酶活力的影響：在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定體系中分別加入不同金屬離子及表面活性劑SDS使其終濃度為1 mmol/L，測(cè)定酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%。

1.3.7 重組酸性果膠裂解酶在果汁澄清中的應(yīng)用

將橙子（新奇士）、蘋(píng)果（富士）和葡萄（巨峰）用榨汁機(jī)制成果汁，蘋(píng)果汁需加0.2 g/100 mL抗壞血酸，3 種果汁的pH值分別為：橙汁3.76、蘋(píng)果汁4.0、葡萄汁4.03。將不同量的重組酸性果膠裂解酶（0、1、2、5、10、25、50 U）分別加入至1 mL果汁中，37 ℃保溫45 min后，2 000×g離心3 min，取上清測(cè)定在660 nm波長(zhǎng)處的透光度（%），以滅活的酶液作為對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性果膠裂解酶基因克隆及序列分析

以黑曲霉CBS513.88菌株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到酸性果膠裂解酶基因（pelD）序列。酸性果膠裂解酶基因pelD全長(zhǎng)為1 369 bp，編碼373 個(gè)氨基酸，經(jīng)SignalP4.1在線預(yù)測(cè)分析，表明該蛋白具有N-端信號(hào)肽，信號(hào)肽切割位點(diǎn)在第19～20個(gè)氨基酸之間。

2.2 重組酸性果膠裂解酶的表達(dá)

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pMD18-pelD的構(gòu)建Fig. 1 Schematic illustration of pMD18-pelD construction

圖2 重組菌發(fā)酵上清液酶活力測(cè)定（A）及SDS-PAGE分析（B）Fig. 2 Enzymatic activity (A) and SDS-PAGE analysis (B) of the culture supernatant of the recombinant strain at different culture times

將pelD基因用infusion酶連接到表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pMD18-pelD，重組表達(dá)質(zhì)粒示意圖如圖1所示，使用黑曲霉自身強(qiáng)啟動(dòng)子（葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子PglaA）實(shí)現(xiàn)酸性果膠裂解酶基因pelD的過(guò)量表達(dá)。將重組表達(dá)質(zhì)粒pMD18-pelD轉(zhuǎn)化宿主黑曲霉SH-2，獲得重組工程菌SH2-PelD。將重組工程菌SH2-PelD接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每24 h離心取上清液測(cè)定酸性果膠裂解酶活力，結(jié)果如圖2A所示。酸性果膠裂解酶活力隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在120 h時(shí)達(dá)到最高（8 822.6 U/mL）。同時(shí)，作為陰性對(duì)照的宿主菌未檢測(cè)到酸性果膠裂解酶活力。此外，對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)（圖2B），結(jié)果表明在大約40 kDa的位置出現(xiàn)一條明顯的電泳條帶，與預(yù)測(cè)的理論分子質(zhì)量大小（39.0 kDa）一致，說(shuō)明重組酸性果膠裂解酶在黑曲霉SH-2中成功實(shí)現(xiàn)了過(guò)量表達(dá)。

2.3 重組酸性果膠裂解酶的純化

圖3 純化后重組酸性果膠裂解酶的SDS-PAGE分析（A）及Western blot鑒定（B）Fig. 3 SDS-PAGE analysis (A) and Western blot (B) of purified rePelD

為更好地研究重組酸性果膠裂解酶的性質(zhì)，對(duì)帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白進(jìn)行鎳柱親和層析純化。經(jīng)一步純化后得到了單一條帶（圖3A）。經(jīng)鎳柱一步純化后，重組酸性果膠裂解酶純化倍數(shù)為4.9 倍，回收率為79.4%，比活力達(dá)到8 522.7 U/mg（表1）。此外，通過(guò)Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證了重組蛋白（圖3B）。

表1 純化發(fā)酵液上清中的重組酸性果膠裂解酶Table 1 Purification of rePelD from the culture supernatant

2.4 重組酸性果膠裂解酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 重組酸性果膠裂解酶的底物特異性

分別以0.5 g/100 mL聚半乳糖醛酸鈉鹽（酯化度為0%）、蘋(píng)果果膠（酯化度50%～75%）、柑橘果膠（酯化度≥85%）為底物，測(cè)定重組酶活力，以底物為柑橘果膠的酶活力為100%，計(jì)算其他底物的相對(duì)酶活力。如表2所示，重組酸性果膠裂解酶對(duì)柑橘果膠的酶活力最高為31 248.0 U/mL，其次為蘋(píng)果果膠（11 164.1 U/mL），而對(duì)聚半乳糖醛酸鈉鹽僅有微弱的酶活力。表明重組酸性果膠裂解酶能夠特異性降解高酯化程度的果膠。

表2 重組酸性果膠裂解酶的底物特異性Table 2 Substrate specificity of rePelD

2.4.2 最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

將重組酸性果膠裂解酶置于不同pH值（3.0～7.0）緩沖液中測(cè)定酶活力，結(jié)果表明該重組酶最適反應(yīng)pH值為5.0，當(dāng)pH值大于7時(shí)，酶活力基本為0（圖4A）。將重組酸性果膠裂解酶置于不同pH值（3.0～7.0）緩沖液中，40 ℃保溫2 h后測(cè)定殘余酶活力，結(jié)果表明該重組酶在酸性條件下穩(wěn)定性良好，在pH 3.0～6.5范圍內(nèi)能保持50%以上的相對(duì)酶活力（圖4B）。

圖4 重組酸性果膠裂解酶最適反應(yīng)pH值（A）和pH值穩(wěn)定性（B）Fig. 4 Effect of pH on the activity (A) and stability (B) of rePelD

2.4.3 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

將重組酶置于不同溫度（20～80 ℃）下測(cè)定酶活力，結(jié)果表明該重組酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃（圖5A）。將重組酸性果膠裂解酶置于不同溫度（30～70 ℃）保溫2 h后測(cè)定殘余酶活力，結(jié)果表明該重組酶在30～50 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，能保持80%以上的相對(duì)酶活力（圖5B）。

圖5 重組酸性果膠裂解酶最適反應(yīng)溫度（A）和熱穩(wěn)定性（B）Fig. 5 Effect of temperature on the activity (A) and stability (B) of rePelD

2.4.4 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)重組酶的影響

表3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)重組酸性果膠裂解酶活力的影響Table 3 Effects of metal ions and chemical reagents on the activity of rePelD

表3表明，在1 mmol/L濃度下，Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Ba2+對(duì)該重組酶具有不同程度的激活作用，其中Zn2+、Ni2+、Ba2+激活作用較為顯著；而表明活性劑SDS對(duì)重組酶有明顯的抑制作用，其他金屬離子對(duì)重組酶活力無(wú)明顯影響。

2.5 重組酸性果膠裂解酶在果汁澄清中的應(yīng)用

圖6表明，經(jīng)重組酸性果膠裂解酶處理后，橙汁、蘋(píng)果汁以及葡萄汁在660 nm波長(zhǎng)處的透光度顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明重組酸性果膠裂解酶對(duì)3 種果汁有顯著的澄清效果。其中橙汁的透光度從1.7%增加到30.5%，提高了16.9 倍；而蘋(píng)果汁的透光度從6.7%增加至77.0%，提高了10.5 倍；葡萄汁的透光度從13.9%增加至79.2%，提高了4.7 倍。此外，使橙汁、蘋(píng)果汁以及葡萄汁達(dá)到較好的澄清效果的加酶量分別為10、5、1 U/mL。

圖6 重組酸性果膠裂解酶對(duì)3 種果汁（橙汁、蘋(píng)果汁和葡萄汁）澄清應(yīng)用Fig. 6 Clarification of orange, apple and grape juice by using rePelD

3 討 論

黑曲霉作為重組蛋白表達(dá)的重要宿主，具有蛋白分泌量大、可進(jìn)行蛋白翻譯后修飾及高生物安全性等優(yōu)點(diǎn)。本研究利用黑曲霉自身強(qiáng)啟動(dòng)子PglaA實(shí)現(xiàn)了黑曲霉酸性果膠裂解酶基因pelD的過(guò)量表達(dá)，使得酸性果膠裂解酶活力在搖瓶培養(yǎng)120 h達(dá)到8 822.6 U/mL，顯著高于之前文獻(xiàn)報(bào)道[16-17,24-25]，為該重組酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論支持。

此外，以黑曲霉為蛋白表達(dá)宿主在純化方面存在一定的困難[26-27]，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)一步親和層析得到了高純度目的蛋白，回收率為79.4%，比活力達(dá)到8 522.7 U/mg。對(duì)重組酶的底物特異性研究表明，重組酸性果膠裂解酶可特異性降解高度甲酯化果膠，這與已有報(bào)道一致[24,28]。該重組酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，且在30～50 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；與來(lái)源于米曲霉（最適反應(yīng)pH 8.5）[29]和黃曲霉（最適反應(yīng)pH 8.0）[30]果膠裂解酶相比，重組酸性果膠裂解酶的最適反應(yīng)pH 5.0，接近大多數(shù)果汁的天然pH值，且在pH 3.0～6.5的范圍內(nèi)非常穩(wěn)定；此外，重組酸性果膠裂解酶對(duì)橙汁、蘋(píng)果汁和葡萄汁均表現(xiàn)出良好的澄清作用，且酶的添加量較少。綜上所述，該重組酶在果蔬汁加工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力。