羅天淇，郭 婷，余志堅(jiān)，陳 超，曹永強(qiáng)，楊貞耐,,*

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東 德州 253000）

藏靈菇（又稱開菲爾粒）是由多種乳酸菌、酵母菌和醋酸菌穩(wěn)定共生形成的特殊粒狀或片狀化合物[1]，能夠同時(shí)進(jìn)行乳酸、乙酸、乙醇發(fā)酵[2]，是開菲爾傳統(tǒng)乳制品的發(fā)酵劑，同時(shí)也是潛在功能性乳品發(fā)酵劑來源[3]。研究表明，藏靈菇發(fā)酵乳中含有大量的乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS），該類多糖對(duì)機(jī)體安全無毒副作用[4]且具有多種生理功能，如調(diào)節(jié)血脂血壓、提高免疫力[5]、減少氧化損傷[6]、抗腫瘤、改善調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境[7]、抑制有害菌的黏附等。產(chǎn)EPS的乳酸菌應(yīng)用到發(fā)酵食品中，可以改善食品的質(zhì)構(gòu)、口感、流變學(xué)特性和風(fēng)味等指標(biāo)，如防止乳清析出、提高黏稠度、凝乳強(qiáng)度等，同時(shí)賦予產(chǎn)品一定的營(yíng)養(yǎng)保健功效[8-9]。除了可以對(duì)腸道微生物起到益生元的作用外，Russo等[10]發(fā)現(xiàn)將乳酸菌EPS加入培養(yǎng)基中，能夠?qū)χ参锶闂U菌WCFS1和嗜酸乳桿菌NCFM的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。這些功能使得乳酸菌EPS在食品和非食品工業(yè)倍受青睞，正日益引起人們的廣泛關(guān)注。

近年來，研究表明菊粉、低聚半乳糖等糖類物質(zhì)能夠在發(fā)酵乳制品中對(duì)發(fā)酵菌株起到促進(jìn)作用[11-13]，而乳酸菌EPS受限于實(shí)際生產(chǎn)中轉(zhuǎn)化效率較低[8]，目前研究主要集中在EPS的生理活性以及高產(chǎn)乳酸菌EPS的篩選應(yīng)用上，關(guān)于EPS直接應(yīng)用于乳制品發(fā)酵的研究比較少見，尤其是EPS對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的貢獻(xiàn)還沒有明確結(jié)論。因此，本研究分離純化藏靈菇發(fā)酵產(chǎn)生的EPS，采用紅外光譜、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用、掃描電鏡、原子力顯微鏡等研究其結(jié)構(gòu)特性，并將此EPS應(yīng)用于切達(dá)干酪中，進(jìn)一步研究其對(duì)發(fā)酵過程以及干酪品質(zhì)的影響，以期為深入研究藏靈菇EPS在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏靈菇 實(shí)驗(yàn)室保藏；生牛乳（蛋白質(zhì)3.09%，脂肪3.43%，乳糖3.91%） 北京市沙河春山奶牛場(chǎng)；脫脂乳粉 新西蘭恒天然乳業(yè)集團(tuán)；商品發(fā)酵劑R-704、商品凝乳酶CHY-MAX 丹麥科漢森公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖） 美國(guó)Sigma公司；DEAE-Sepharose Fast Flow離子色譜柱 英國(guó)Waterman公司；Sepharose CL-6B凝膠柱美國(guó)Amersham Bioscience公司；透析袋（截流分子質(zhì)量為8 000～14 000 Da） 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；恒溫培養(yǎng)箱上海一恒儀器科技有限公司；數(shù)顯pH計(jì) 上海Mettler-Toledo儀器有限公司；SU8020場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、紫外-可見分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；TENSOR 27紅外光譜儀、原子力顯微鏡 德國(guó)布魯克儀器公司；7890A-7000 GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

脫脂乳培養(yǎng)基 將質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的脫脂乳粉用蒸餾水還原制成脫脂乳培養(yǎng)基，115 ℃滅菌15 min。

SDM液體培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g、YNB（酵母氮源）6.7 g、K2HPO42 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸鈉5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL，1 mol/L乙酸調(diào)pH值為6.6，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 EPS的提取與產(chǎn)量測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)室保藏藏靈菇中，根據(jù)藏靈菇發(fā)酵乳凝乳時(shí)間、黏度及拉絲長(zhǎng)度選取7 個(gè)較優(yōu)樣品，使用脫脂乳培養(yǎng)基活化后，取5 g于100 mL無菌SDM液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫發(fā)酵18 h，然后100 ℃水浴加熱15 min以滅活可能降解多糖的酶類。EPS的提取參考Rimada等[14]的方法，向藏靈菇發(fā)酵液中加入80%的三氯乙酸溶液至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，室溫下攪拌2 h后，10 000 r/min、4 ℃條件下離心45 min，去除細(xì)胞和蛋白。取上清液并加入兩倍體積的無水乙醇，4 ℃冷藏靜置12 h，10 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min。沉淀用蒸餾水溶解，裝入透析袋中透析24 h，每8 h換一次蒸餾水。之后使用苯酚-硫酸法測(cè)定EPS產(chǎn)量。

1.3.3 EPS的分離純化與鑒定

1.3.3.1 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子色譜柱純化EPS

使用超純水配制20 mg/mL的粗多糖凍干粉，依次用超純水（第1～30管）、0.2 mol/L NaCl緩沖液（第31～70管）、0.5 mol/L的 NaCl緩沖液（第71～100管）在陰離子交換柱上以1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，洗脫液收集量為5 mL/管，檢測(cè)每管洗脫液的OD490nm，合并含有多糖的洗脫液，透析凍干，4 ℃保存。

1.3.3.2 Sepharose CL-6B凝膠柱層析純化EPS

將上一步得到的多糖組分使用0.9%的NaCl緩沖液配制成2 mg/mL的多糖溶液。使用0.9% NaCl溶液在Sepharose CL-6B凝膠柱上以1 mL/min的流速對(duì)多糖樣品再進(jìn)一步純化，每管收集5 mL并檢測(cè)OD490nm，合并含有多糖的洗脫液，透析凍干，4 ℃保存。

1.3.3.3 紅外光譜分析

將2 mg純化的EPS凍干粉末和200 mg溴化鉀粉末混合均勻，并用壓片法壓成薄片狀，記錄并觀察4 000～400 cm-1范圍內(nèi)EPS樣品的紅外光譜。

1.3.3.4 掃描電鏡觀察EPS分子形貌

將5 mg純化的EPS凍干粉樣品，均勻粘在云母片表面，噴金后使用掃描電鏡在2 000 倍和4 000 倍下觀察多糖分子形貌。

1.3.3.5 原子力顯微鏡觀察EPS分子形貌

使用超純水制備質(zhì)量濃度為1 mg/mL的純化EPS，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌至充分溶解后，梯度稀釋成10 μg/mL的溶液并使用原子力顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.3.6 單糖組成

單糖組成的分析方法采用Wang Ji等[15]的方法。

1.3.4 EPS對(duì)發(fā)酵劑的作用研究

1.3.4.1 EPS對(duì)發(fā)酵劑生長(zhǎng)的影響

在EPS添加量分別為0%、0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中添加0.1 g/100 mL的商品發(fā)酵劑R-704，連續(xù)培養(yǎng)24 h并檢測(cè)OD630nm值[12]。

1.3.4.2 EPS含量對(duì)發(fā)酵乳pH值的影響

在生牛乳中分別添加0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%的EPS，65 ℃殺菌30 min，冷卻至室溫，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的商品發(fā)酵劑R-704，37 ℃培養(yǎng)6 h后測(cè)定pH值。

1.3.5 干酪的理化及微生物指標(biāo)測(cè)定

1.3.5.1 切達(dá)干酪的制作

切達(dá)干酪制作參考郝曉娜等[16]的方法。生牛乳65 ℃殺菌30 min，室溫冷卻至31 ℃后添加0.1%的商品發(fā)酵劑R-704，并在菊粉組、EPS組分別添加1%的菊粉和EPS。在37 ℃保溫發(fā)酵，pH值降至6.5后以0.002 5 g/L的比例添加凝乳酶CHY-MAX，32 ℃靜置40 min待乳凝固后用干酪刀切割成小塊，升溫至41 ℃順時(shí)針緩慢攪拌30 min，便于乳清析出，當(dāng)pH值降至6.2時(shí)排乳清，并于40 ℃堆釀，當(dāng)pH值為5.5時(shí)，絞碎凝塊，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的食鹽，然后裝入干酪模具壓榨。真空包裝，并于4 ℃條件下成熟12 周。

1.3.5.2 干酪得率的測(cè)定

干酪得率作為判斷干酪制作方法、設(shè)置工藝參數(shù)是否合理，是否適合生產(chǎn)應(yīng)用的重要指標(biāo)，其計(jì)算公式如下：

式中：M0為干酪質(zhì)量；M1為牛乳質(zhì)量；M2為發(fā)酵劑質(zhì)量；M3為鹽質(zhì)量。

1.3.5.3 干酪含水量的測(cè)定

干酪含水量的測(cè)定：參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》[17]。

1.3.5.4 干酪保水率的測(cè)定

各組取3 g干酪樣品，4 500 r/min離心15 min，去上清液，稱量并作記錄，計(jì)算公式如下：

式中：M0為空離心管質(zhì)量；M1為離心管加樣品的質(zhì)量；M2為樣品離心除去上清液后的離心管加樣品質(zhì)量。

1.3.5.5 干酪微生物指標(biāo)與pH值的測(cè)定

干酪成熟期間每2 周取樣一次，采用MRS平板涂布法檢測(cè)干酪樣品中乳酸菌的活菌數(shù)。準(zhǔn)確稱取1 g干酪磨碎后加入9 mL無菌生理鹽水中攪拌至溶解，梯度稀釋至一定倍數(shù)，吸取100 μL稀釋液均勻涂布于MRS培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

準(zhǔn)確稱取10 g磨碎的干酪加入12 mL的蒸餾水中，勻漿處理使其混合均勻后，4 500 r/min離心15 min后去除上層脂肪，取下層溶液測(cè)pH值。

1.3.5.6 干酪風(fēng)味的測(cè)定

固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）法提取揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)：萃取前將SPME纖維置于GC-MS進(jìn)樣口老化。取10 g干酪和1 μL內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮于30 mL萃取瓶中，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL，加蓋密封，在60 ℃恒溫水浴下平衡30 min后，將SPME萃取纖維通過瓶蓋插入樣品中的頂空部分，推出纖維，頂空吸附30 min后拔出；快速插入GC-MS進(jìn)樣口解吸5 min，進(jìn)行GC-MS聯(lián)用分析。

GC條件：采用DB-5（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱進(jìn)行分析。升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升溫到200 ℃；以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；載氣（He）流速1.2 mL/min，不分流進(jìn)樣。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 40～250。

1.3.5.7 風(fēng)味物質(zhì)香氣活性值（odor activity value，OAV）的計(jì)算：

式中：Ci為化合物的含量/（μg/g）；OTi為該化合物在水中的嗅覺閾值/（mg/kg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏靈菇EPS產(chǎn)量測(cè)定

綜合藏靈菇發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間、黏度及拉絲長(zhǎng)度，從30 種藏靈菇樣品中篩選出的7 個(gè)較優(yōu)樣品的EPS產(chǎn)量如圖1所示，確定藏靈菇KW1具有最高的EPS產(chǎn)量，為624.82 mg/L，與其他組有顯著差異（P＜0.05）。在相似培養(yǎng)、檢測(cè)條件下，與其他類似研究報(bào)道的EPS產(chǎn)量相比[15,18-20]，也處于較高水平，同時(shí)Bouzar等[21]指出乳酸菌EPS的產(chǎn)量一般都比較低（50～425 mg/L），因此藏靈菇KW1具有良好的EPS生產(chǎn)前景。

圖1 藏靈菇EPS產(chǎn)量Fig. 1 Production of EPS from Tibet kefir

2.2 EPS的分離純化

圖2 EPS經(jīng)陰離子交換色譜柱分離得到的洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of the EPS separated by anion exchange chromatography

圖3 EPS經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠柱純化的洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of the EPS purified by Sepharose CL-6B gel permeation chromatography

如圖2所示，藏靈菇KW1發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)除蛋白處理、醇沉、透析和冷凍干燥后得到的粗多糖，在陰離子交換色譜層析中被0.2 mol/L NaCl鹽溶液洗脫下來，表明此EPS是酸性多糖或者帶有酸性基團(tuán)[22]。通過Sepharose CL-6B凝膠色譜柱進(jìn)一步純化，不同大小的分子被洗脫分開，產(chǎn)生單一洗脫峰（圖3），獲得純化EPS并用于后續(xù)理化分析。

2.3 EPS官能團(tuán)的紅外光譜分析

圖4 藏靈菇KW1純化EPS的紅外光譜圖Fig. 4 IR spectrum of the purified EPS from Tibet kefir KW1

圖4 顯示了藏靈菇KW1 EPS的紅外光譜分析結(jié)果。在3 420 cm-1附近的峰主要是由羥基的伸縮振動(dòng)引起的峰，可能是來源于樣品吸附的水分、樣品分子內(nèi)的羥基或分子間氫鍵的拉伸峰[23]；在2 925 cm-1附近的峰主要是由甲基或亞甲基的C—H鍵的伸縮振動(dòng)引起的峰；在1 645 cm-1附近的峰主要是由羰基的伸縮振動(dòng)引起的峰，這個(gè)峰是多糖的特征吸收峰[24]；1 563 cm-1和1 384 cm-1處的峰是羧基中C＝O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰[25]；1 231 cm-1和1 076 cm-1處的峰是C—O鍵的伸縮振動(dòng)峰，其來源可能為C—O—H，或是糖環(huán)中的C—O—C，也有可能為縮醛鍵[23]；874 cm-1說明可能存在α-糖苷鍵[26]。

2.4 EPS單糖組成分析

對(duì)藏靈菇KW1提取純化后的EPS進(jìn)行水解和乙酰化后，得到相應(yīng)的衍生物，并通過氣相色譜測(cè)得藏靈菇KW1產(chǎn)EPS的氣相色譜圖（圖5B），與標(biāo)準(zhǔn)單糖色譜圖（圖5A）對(duì)比后可知，藏靈菇KW1 EPS由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，相對(duì)物質(zhì)的量比為1∶3.02∶2.12∶1.59∶3.04，與紅外光譜結(jié)果一致。其他EPS組成的研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌KF5所產(chǎn)EPS是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖按照物質(zhì)的量比例1∶4.99∶6.90組成[23]；來自雙歧桿菌22-5的EPS主要含有木糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和巖藻糖[27]；副干酪乳桿菌34-1產(chǎn)生的EPS只含有半乳糖，清酒乳桿菌O-1產(chǎn)生的EPS則含有葡萄糖和鼠李糖[28]。劉翠平等[29]發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌LC2W使用葡萄糖作為碳源得到的EPS由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖組成，而使用乳糖作為碳源得到的EPS則是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成。因此EPS的單糖組成受到菌株類型、培養(yǎng)條件等因素的影響，藏靈菇KW1在其他培養(yǎng)條件下可能能夠產(chǎn)生不同組成的EPS。

圖5 單糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）和藏靈菇KW1純化EPS（B）的GC-MS聯(lián)用分析圖Fig. 5 GC-MS analysis of monosaccharide standards (A) and the puri fi ed EPS (B)

2.5 EPS掃描電鏡和原子力顯微鏡分析

藏靈菇KW1 EPS的掃描電鏡觀察如圖6所示，EPS顯示出相對(duì)穩(wěn)定的三維微觀結(jié)構(gòu)（圖6A），EPS表面粗糙呈顆粒狀，整體上呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部分布著許多大小形狀相似的球形結(jié)構(gòu)和不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步放大倍數(shù)可以看出（圖6B），EPS表面結(jié)構(gòu)緊致光滑，這種較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可以賦予EPS特殊的流變學(xué)性質(zhì)，例如提升產(chǎn)品的黏度、改善質(zhì)構(gòu)和保水特性[30]。據(jù)報(bào)道，從藏靈菇中篩選分離出的L. kefiranofaciens ZW3所產(chǎn)的EPS也具有類似的分子形貌[31]。而另一株從藏靈菇中篩選分離的植物乳桿菌KF5，其所產(chǎn)的EPS呈不規(guī)則片狀[23]。

圖6 藏靈菇KW1純化EPS的掃描電鏡圖Fig. 6 Scanning electron micrographs of the purified EPS

平面圖像（圖7A）顯示，EPS分布不均勻，在某些區(qū)域EPS結(jié)構(gòu)緊密呈膜狀，這說明EPS發(fā)生了聚集，在多糖質(zhì)量濃度大的區(qū)域，羥基數(shù)目多，分子間的氫鍵締合作用增強(qiáng)，多糖聚合較緊密，形成膜狀結(jié)構(gòu)[32]。在立體圖像（圖7B）中，可以觀察到EPS表現(xiàn)出高低不平、分布不均的狀態(tài)，平面圖像中的膜狀區(qū)域呈現(xiàn)出緊密的簇狀結(jié)構(gòu)，而在其他區(qū)域可以看到多糖分子形貌如尖錐狀結(jié)構(gòu)，高度在2.4 nm左右。

圖7 藏靈菇KW1 EPS的原子力顯微圖像Fig. 7 Atomic force microscopy images of the purified EPS

2.6 EPS對(duì)發(fā)酵劑生長(zhǎng)的影響

圖8 EPS對(duì)發(fā)酵劑菌株生長(zhǎng)的影響Fig. 8 Effect of EPS on growth of the starter culture

如圖8所示，在兩組液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵劑菌株在調(diào)整期都生長(zhǎng)緩慢，曲線較接近，3～4 h之后均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株生長(zhǎng)速度加快，但實(shí)驗(yàn)組菌株的生長(zhǎng)情況明顯要優(yōu)于對(duì)照組，并且進(jìn)入穩(wěn)定期后，實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液OD值顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明EPS可能起到益生元的作用，從而促進(jìn)發(fā)酵劑菌株的生長(zhǎng)，也有可能EPS被微生物利用，為其穩(wěn)定期的生長(zhǎng)補(bǔ)充培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的不足。

從圖9可以看出，EPS的添加量對(duì)發(fā)酵劑產(chǎn)酸有著顯著影響。隨著EPS添加量的提高，發(fā)酵乳產(chǎn)酸呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)；在添加量為1%時(shí)，pH值降至約4.5，產(chǎn)酸達(dá)到最大值，說明在EPS的低添加量范圍內(nèi)，隨著添加量的增加，其對(duì)發(fā)酵劑菌株的生長(zhǎng)具有逐步增強(qiáng)的促進(jìn)作用；添加量高于1%時(shí)，EPS對(duì)菌株的促生長(zhǎng)作用隨著其添加量的升高而逐漸減弱，甚至可能抑制菌株的生長(zhǎng)。這點(diǎn)與菊粉類似，曹永強(qiáng)等[33]發(fā)現(xiàn)，菊粉對(duì)乳酸菌有促生長(zhǎng)作用，但是濃度過高會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)。

圖9 EPS添加量對(duì)發(fā)酵乳pH值的影響Fig. 9 Effect of different amounts of EPS addition on pH of fermented milk

2.7 EPS對(duì)切達(dá)干酪品質(zhì)的影響

2.7.1 EPS對(duì)干酪得率、保水率的影響

表1 干酪得率、保水率Table 1 Yield and water retention rate of cheese

如表1所示，空白組干酪的得率、保水率與實(shí)驗(yàn)組干酪有顯著差異（P＜0.05），而菊粉組和EPS組得率、保水率無顯著差異（P＞0.05），均能有效提高干酪得率，增加干酪保水率，這可能與菊粉和EPS能夠一定程度上改善干酪內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)[11]。

2.7.2 EPS對(duì)干酪理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)的影響

圖10 干酪成熟期間含水量變化Fig. 10 Changes in moisture content during cheese ripening

如圖10所示，在干酪成熟的過程中，干酪含水量隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，下降速度逐漸減慢；添加有菊粉、EPS的實(shí)驗(yàn)組干酪含水量顯著高于空白組（P＜0.05），與郝曉娜等[16]添加產(chǎn)EPS菌株制備切達(dá)干酪的結(jié)果相似，這可能與菊粉、EPS強(qiáng)化干酪結(jié)構(gòu)結(jié)合更多的水有關(guān)。而成熟期間各組干酪的pH值（圖11）逐步降低，之后趨于穩(wěn)定，菊粉的加入對(duì)干酪pH值的影響比較明顯，而空白組與EPS組干酪pH值無顯著差異（P＞0.05），說明EPS的加入不會(huì)使干酪品質(zhì)發(fā)生明顯偏差。

圖11 干酪成熟期間pH值變化Fig. 11 Changes in pH during cheese ripening

圖12 顯示干酪成熟期間活菌數(shù)的變化。成熟過程前6 周干酪中的微生物含量在不斷增加，之后趨于穩(wěn)定。菊粉組和EPS組的微生物含量與空白組比較有顯著差異（P＜0.05），說明EPS添加于干酪中能起到與菊粉一樣的益生元作用，但是EPS組的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值高于菊粉組，而產(chǎn)酸量卻不如菊粉組，這可能是由于EPS和菊粉在結(jié)構(gòu)組成上存在差異，直接影響其對(duì)微生物發(fā)酵增殖的作用[11]。

圖12 干酪成熟期間乳酸菌含量變化Fig. 12 Changes in number of lactic acid bacteria of during cheese ripening

2.7.3 EPS對(duì)切達(dá)干酪風(fēng)味的影響

2.7.3.1 EPS干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS結(jié)果分析

風(fēng)味是反映食品品質(zhì)的一個(gè)重要因素，目前關(guān)于EPS對(duì)干酪風(fēng)味影響的研究較少，郝曉娜等[16]考察了產(chǎn)EPS益生菌L. plantarum1-2對(duì)切達(dá)干酪揮發(fā)性風(fēng)味形成的影響，發(fā)現(xiàn)益生菌的加入增加了乙苯、十二烷、己醇和丙酮4 種風(fēng)味物質(zhì)，且其他共有風(fēng)味物質(zhì)在含量上也存在差異；Wang Ji等[15]指出產(chǎn)EPS植物乳桿菌SKT109能夠通過增加乙酸乙酯，3-甲基-1-丁醇，3-羥基-2-丁酮和丁酮的含量來改善切達(dá)干酪風(fēng)味特征。

如表2所示，采用SPME-GC-MS，從成熟12 周的EPS干酪中共鑒定出69 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括烴類14 種，醇類14 種，醛類4 種，酮類7 種，酸類8 種，酯類21 種，其他化合物1 種。其中含量最高的為酯類化合物，含量為5 042.44 μg/kg，其次為醇類、酮類、烴類、酸類、醛類以及其他化合物，但是風(fēng)味物質(zhì)含量高低并不能說明對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)度大小[34]，二者不存在直接關(guān)聯(lián)，因此需結(jié)合OAV法進(jìn)一步分析各物質(zhì)對(duì)干酪風(fēng)味的貢獻(xiàn)。

表2 EPS干酪揮發(fā)性組分的定性定量結(jié)果Table 2 Qualitative and quantitative analysis results of volatiles in EPS-supplemented cheese

續(xù)表2

2.7.3.2 EPS干酪風(fēng)味活性物質(zhì)的OAV分析

表3 OAV確定EPS干酪中的風(fēng)味活性物質(zhì)Table 3 Qualitative and quantitative analysis of volatile flavor compounds in EPS-supplemented cheese

OAV大于1的香氣化合物被認(rèn)為是食品的香氣特征貢獻(xiàn)組分，香氣化合物的OAV越大，說明其對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)越大[35]。如表3所示，在檢測(cè)出的69 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，有17 種化合物的OAV大于1，即對(duì)EPS干酪的風(fēng)味有貢獻(xiàn)作用，是EPS干酪中的風(fēng)味活性物質(zhì)，包括6 種醇類物質(zhì)，1 種醛類物質(zhì)，3 種酮類物質(zhì)，7 種醛類物質(zhì)。其中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯的OAV大于200，說明它們對(duì)EPS干酪的風(fēng)味有關(guān)鍵性貢獻(xiàn)作用[36]。

發(fā)酵乳制品中醇類物質(zhì)的來源主要有乳糖代謝、甲基酮類的還原、氨基酸的降解以及亞油酸、亞麻酸的降解這4 種。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的6 種OAV大于1的醇類物質(zhì)中，3-甲基-1-丁醇具有特殊不愉快氣味、有辛辣而令人厭惡味[37]；3-甲硫基丙醇具有典型的硫化物氣息，稀釋到一定程度后具有洋蔥、甜的肉湯的氣味[38]；2-庚醇具有蘑菇香氣，2-壬醇和1-壬醇分別具有黃瓜和青草氣味；苯乙醇濃度最高，來自芳香族氨基酸的降解，具有玫瑰花香、紫羅蘭香、茉莉花香等多種氣味。

醛類是干酪中重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之一，但本實(shí)驗(yàn)中僅有十二醛這1 種物質(zhì)對(duì)干酪風(fēng)味有貢獻(xiàn)，這可能與醛類屬于化學(xué)性質(zhì)比較活潑的不穩(wěn)定中間體化合物，在一定條件下易被還原成相應(yīng)的醇有關(guān)[2]。

3 種OAV大于1的酮類化合物中，2-壬酮具有青香、脂肪香，2-十一酮具有脂肪香以及奶油、乳酪的味道[39]。一般認(rèn)為酮類物質(zhì)隨著碳鏈的增長(zhǎng)香氣更加濃郁[40]，其中甲基酮類化合物被認(rèn)為是表面霉菌成熟干酪和藍(lán)紋干酪的特征風(fēng)味物質(zhì)[41]。

酯類化合物是非常重要的一種呈香物質(zhì)，在干酪中一般給人以甜的果香味，同時(shí)干酪中酯類化合物的存在還可以緩解短鏈酸類化合物引起的尖刺感，使整體風(fēng)味變得柔和，但是過多的酯類化合物容易使得奶酪風(fēng)味偏水果味[42]。在本實(shí)驗(yàn)中，酯類物質(zhì)含量最高，同時(shí)對(duì)EPS干酪風(fēng)味貢獻(xiàn)最大。其中丁酸乙酯具有蘋果香氣；乙酸苯乙酯具有蜜糖、花香、果香、柑橘香氣[43]；癸酸乙酯呈現(xiàn)出葡萄氣味；δ-癸內(nèi)酯呈現(xiàn)出桃子、乳脂氣味[39]；乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯也都能賦予食品水果香氣。同時(shí)，王磊等[44]認(rèn)為異戊醛、乙酸乙酯、辛酸乙酯是切達(dá)干酪的主體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論部分相同，說明EPS的加入可能改變了干酪的風(fēng)味特征。

在本實(shí)驗(yàn)中，烴類物質(zhì)和酸類物質(zhì)的含量都不低，但是其OAV均小于1，這可能主要與這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)感覺閾值較高有關(guān)，同時(shí)由于實(shí)際香氣組分之間在整體香氣貢獻(xiàn)中具有協(xié)同或拮抗效應(yīng)，通常香氣成分之間相互作用以加成為主，協(xié)同和掩蓋作用較少[45]，一些OAV小于1的物質(zhì)可能通過與其他物質(zhì)間的協(xié)同效應(yīng)而使其香氣被人們感知，因此這些物質(zhì)也有可能對(duì)EPS干酪的整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)藏靈菇發(fā)酵產(chǎn)EPS進(jìn)行了分離純化，確定該EPS由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，物質(zhì)的量比1∶3.02∶2.12∶1.59∶3.04，在紅外光譜下顯示出典型的多糖吸收峰模式。掃描電鏡結(jié)果表明，該EPS微觀結(jié)構(gòu)中分布著許多表面比較光滑的球狀、片狀結(jié)構(gòu)；原子力顯微觀察，EPS呈現(xiàn)一定的聚集現(xiàn)象，具有膜狀、簇狀結(jié)構(gòu)。藏靈菇EPS對(duì)發(fā)酵劑菌株的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，這種作用隨著添加量的增加先增后減。同時(shí)還能夠提高切達(dá)干酪得率、含水量、保水性以及成熟期間的活菌數(shù)。SPME-GC-MS分析結(jié)合OAV法表明，在69 種揮發(fā)性物質(zhì)中，有17 種風(fēng)味物質(zhì)對(duì)EPS干酪整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)，其中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯是關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。本研究將為藏靈菇EPS在乳酸菌發(fā)酵及干酪加工中的應(yīng)用提供重要的技術(shù)參考。