基于氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的冷鮮灘羊肉貯藏中脂肪差異代謝物檢測

苑昱東，尤麗琴，羅瑞明*，劇 檸，趙曉策

（寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021）

寧夏鹽池灘羊是寧夏優(yōu)勢特色畜種，其肉脂肪分布均勻，肉質(zhì)鮮美，風味獨特，廣受消費者歡迎[1-2]。冷鮮灘羊肉是指嚴格執(zhí)行檢疫制度，對屠宰后的畜胴體迅速進行冷卻處理，使胴體溫度在24 h內(nèi)降為0～4 ℃，并在后續(xù)加工、流通和銷售過程中始終保持0～4 ℃范圍內(nèi)的生鮮羊肉[3-4]。

隨著人們生活質(zhì)量的逐步提高，冷鮮肉正替代熱鮮肉成為人們?nèi)忸愊M中的主流。冷鮮肉保留了肉質(zhì)絕大部分營養(yǎng)成分，具有鮮嫩多汁、易咀嚼等特點，因此隨著社會經(jīng)濟發(fā)展，肉品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢將是品質(zhì)佳的低溫冷鮮肉[5-7]。冷鮮肉貯藏過程中脂肪代謝的變化，是肉成熟理論研究的重要領(lǐng)域。代謝組學技術(shù)是對代謝物的集合進行分析，是對代謝物的整體變化規(guī)律系統(tǒng)化[8-9]。現(xiàn)在主要的檢測手段有：液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用技術(shù)、毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以及氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)[10-13]。Abraham等[14]采用了GC-MS、LC-MS聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合主成分分析及偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA），對牛腰最長肌和腰大肌的代謝物進行了檢測。目前，對于宰后代謝的研究多集中在某個或某幾個代謝物[15-21]，如李永鵬等[22]采用GC-MS技術(shù)對比了宰后成熟過程中牦牛肉中揮發(fā)性風味化合物的變化情況表明，成熟后的牦牛肉中，含硫化合物（肉香味）比成熟前增加了24%，特別是2-乙?；邕颍ㄈ庀悖?、甲硫基丙醛（肉湯味）分別增加了100%和78%。朱榮生等[23]對冷藏期間豬肌肉中肌苷酸沉積規(guī)律進行的研究表明，肌苷酸與核糖在水和脂肪中加熱能產(chǎn)生明顯的鮮味，但肌肉中肌苷酸及其降解產(chǎn)物肌苷、次黃嘌呤含量在貯藏過程中呈動態(tài)變化。隨貯藏期延長，肌苷酸含量先增加后逐漸降低，肌苷和次黃嘌呤在貯藏第5～6天時達到最高值。而對宰后貯藏過程中脂肪細胞的整個代謝過程報道較少。

脂質(zhì)在肉類風味發(fā)展中起多重要的作用。Toldrá等[24]采用GC-MS檢測了豬肉中糖及其相關(guān)物質(zhì)的代謝情況，結(jié)果表明糖酵解，蛋白質(zhì)水解和脂肪分解產(chǎn)生大量化合物如糖、肽、氨基酸、無機鹽和有機酸等，以上化合物對肉類風味起很重要的作用，并且大多數(shù)內(nèi)源性酶是引起這種反應的主要原因。文志勇等[25]研究了脂質(zhì)氧化所產(chǎn)生的香味物質(zhì)。表明，油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸氧化生成揮發(fā)性醛如己醛、庚醛等，而油酸、亞油酸等脂肪酸被認為是產(chǎn)生風味物質(zhì)的前體。本實驗以灘羊宰后脂肪細胞為特殊生命系統(tǒng)，采用GC-MS、LC-MS技術(shù)研究宰后脂肪細胞0～4 ℃貯藏中可檢測出的全部代謝物、代謝通路，及其厭氧呼吸條件下的相互關(guān)系及聯(lián)動轉(zhuǎn)化，分析時間推移中代謝網(wǎng)絡(luò)變化。通過代謝組學研究宰后脂肪組織代謝物與風味物質(zhì)前體、中間體的關(guān)聯(lián)，進一步研究灘羊肉風味物質(zhì)前體、中間體合成途徑及其調(diào)控機制，為冷鮮灘羊肉生產(chǎn)技術(shù)改進提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

所取樣本均來自現(xiàn)宰殺的鹽池灘羊 寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC超高效液相色譜、色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）美國Waters公司；AB Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜美國應用生物系統(tǒng)公司；Pegasus 4D全二維氣相色譜飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Leco公司；色譜柱DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm，J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA）。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集貯藏溫度為0～4 ℃，相對濕度為85%的灘羊背最長肌上部皮下脂肪400 mg，封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為4 d，即采樣時間點為第0、4、8、12天，每組樣本做8 個平行。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 GC-MS樣品前處理

精密稱取30 mg/組樣本，放入1.5 mL的離心（EP）管中。依次加入兩顆小鋼珠，加入20 μL的內(nèi)標（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配制）和600 μL預冷的甲醇-水溶液（4∶1，V/V），在-80 ℃冰箱中放置2 min。隨即放入研磨機中研磨（60 Hz，2 min），加入120 μL氯仿。再用冰水浴超聲提取10 min，4 ℃靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取300 μL的上清液裝入玻璃衍生瓶中。質(zhì)控樣本（quality control，QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC的體積與樣本相同。采用冷凍濃縮離心干燥器揮干樣本。隨后向玻璃衍生小瓶中加入80 μL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液（15 mg/mL），渦旋振蕩2 min后，于振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃中90 min進行肟化反應。將樣本取出后再加入80 μL的（bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide，BSTFA，含1%TMCS）衍生試劑和20 μL的正己烷，渦旋振蕩2 min后，于70 ℃反應60 min。取出樣本后，在室溫放置30 min，進行GC-MS代謝組學分析。

1.3.2.2 LC-MS樣品前處理

精確稱取30 mg/組樣本于1.5 mL EP管中，加入20 μL內(nèi)標（L-2-氯-苯丙氨酸0.3 mg/mL，甲醇配制），加入400 μL甲醇-水溶液（4∶1，V/V）；加入兩個小鋼珠，在-80 ℃冰箱中放置2 min后，放入研磨機中研磨（60 Hz、2 min）；冰水浴中超聲提取10 min；-20 ℃靜置30 min；4 ℃、13 000 r/min離心15 min，用注射器吸取150 μL的上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到LC進樣小瓶，-80 ℃保存，直到進行LC-MS分析。QC由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC的體積與樣本相同。

1.3.3 儀器測定條件

1.3.3.1 GC-MS條件

色譜條件：DB-5MS毛細管柱（30 m × 250 μm），載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%），流速1.0 mL/min，進樣口的溫度260 ℃。進樣量1 μL，不分流進樣。程序升溫：柱溫箱的初始溫度為80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min程序升溫至180 ℃ ，5 ℃/min升溫至240 ℃；20 ℃/min升溫至280 ℃保持9 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式，質(zhì)量掃描m/z30～600。

1.3.3.2 LC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫45 ℃；流動相：水（含0.1%甲酸）、乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.4 mL/min；進樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧；樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將所得的數(shù)據(jù)導入SIMCA軟件包（version 14.0，Umetrics，Ume?，Sweden），先采用無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）觀察各樣本之間的總體分布和整個分析過程的穩(wěn)定性，后用有監(jiān)督的PLS-DA區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。為防止模型過擬合，采用7 次循環(huán)交互驗證和200 次響應排序檢驗的方法考察模型的質(zhì)量。

1.4.1 GC-MS數(shù)據(jù)預處理

將采用GC-MS所得數(shù)據(jù)導入Chroma TOF（version 4.34，LECO，St Joseph，MI）軟件進行預處理，峰提取、去噪音、反卷積等；而后采用內(nèi)標法對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，經(jīng)過濾后，檢測到物質(zhì)峰578 個，使用NIST和Fiehn數(shù)據(jù)庫對代謝物進行定性，導出原始數(shù)據(jù)矩陣。

1.4.2 LC-MS數(shù)據(jù)預處理

對所有樣本的基峰色譜圖進行可視化檢查，將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzML格式，峰提取后，將內(nèi)標峰從矩陣中刪除。再進行歸一化處理。將QC中相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）大于30%的變量刪除。圖1a、b分別展示了質(zhì)控樣本正負離子模式下的總離子流圖。

圖1 QC樣本的總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of QC samples

將正負離子數(shù)據(jù)合并成一個數(shù)據(jù)矩陣，該矩陣包含了原始數(shù)據(jù)提取到的所有可以用于分析的信息。從表1可以看出，對QC以RSD低于30%進行篩選，特征值得率大于75%，說明該代謝組學方法具有的良好重復性。

表1 QC樣本篩選結(jié)果（RSD＜30%）Table 1 Filtering of QC samples for RSD ＜ 30%

2 結(jié)果與分析

2.1 多元變量分析

2.1.1 基于GC-MS對灘羊脂肪冷鮮貯藏不同組別的多元變量分析

圖2 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的PCA得分圖Fig. 2 Score plots of PCA model obtained for differential metabolites of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

應用PCA法分別對冷鮮灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的代謝物進行GC-MS檢測數(shù)據(jù)分析。PCA得分圖如圖2所示。

為了將上述組別更好地區(qū)分，又采用PLS-DA法將樣本歸類分析。在PLS-DA中，一般變量權(quán)重值（variable important in projection，VIP）大于1的變量被認為是差異變量，結(jié)果見圖3。

圖3 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的PLS-DA得分圖Fig. 3 Score plots of PLS-DA model obtained for differential metabolites of Tan sheep meat sotred for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days,and 8 versus 12 days

由圖3可見，灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組均可完全區(qū)分；但各組內(nèi)呈現(xiàn)一定發(fā)散分布，這反映了灘羊脂肪貯藏4 d組、8 d組及12 d組組內(nèi)存在明顯差異。該模型的可解釋變量R2X=0.512，模型可預測度Q2=0.092 2。表明該模型能很好地解釋和預測兩組樣本之間的差異。采用隨機多次的排列實驗進一步檢驗實驗的有效性，以分類變量y的不同排列順序所對應不同的隨機Q2值作為檢驗模型穩(wěn)健性的評判標準。響應排序檢驗圖如圖4所示。

圖4 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的響應排序檢驗圖Fig. 4 Permutation test of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

由圖4可得，灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的響應排序檢驗截距分別為R2=0.774，Q2=-0.379、R2=0.789，Q2=-0.335及R2=0.811，Q2=-0.327體現(xiàn)了模型的穩(wěn)健性，表明基于GC-MS技術(shù)建立的PLS-DA模型能較好的解釋各組之間的差異。

2.1.2 基于LC-MS對灘羊脂肪冷鮮貯藏不同組別的多元變量分析

應用PCA法分別對冷鮮灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的代謝物進行LC-MS檢測數(shù)據(jù)分析。PCA得分圖如圖5所示。

圖5 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的PCA得分圖Fig. 5 Score plots of PCA model obtained for differential metabolites of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

為了將上述組別更好地區(qū)分，找到潛在的差異代謝物，又采用了PLS-DA法將樣本歸類分析，結(jié)果見圖6。

圖6 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的PLS-DA得分圖Fig. 6 Score plots of PLS-DA model obtained for differential metabolites of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

由圖6可見，灘羊脂肪貯藏0 d組與4 d組、4 d組與8 d組、8 d組與12 d組均可完全區(qū)分；其各組內(nèi)呈現(xiàn)一定的分散分布，說明各組內(nèi)存在明顯的差異。該模型的可解釋變量R2X=0.531，模型可預測度Q2=0.089 3。表明該模型能很好地解釋和預測兩組樣本之間的差異。采用隨機多次的排列實驗進一步檢驗實驗的有效性，以分類變量y的不同排列順序所對應不同的隨機Q2值作為檢驗模型穩(wěn)健性的評判標準。響應排序檢驗圖如圖7所示。

圖7 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的響應排序檢驗圖Fig. 7 Permutation test of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

由圖7可得，灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的響應排序檢驗截距分別為R2=0.612，Q2=-0.707、R2=0.654，Q2=-0.798及R2=0.467，Q2=-0.426體現(xiàn)了模型的穩(wěn)健性，表明基于LC-MS技術(shù)建立的PLS-DA模型能較好的解釋各組之間的差異。

2.2 差異代謝物篩選

采用多維分析和單維分析相結(jié)合的方法，篩選組間差異代謝物，標準為PLS-DA模型第1主成分的VIP值高于1.2，t檢驗的P值低于0.05。

采用GC-MS技術(shù)篩選出冷鮮灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的差異代謝物分別為64、65、27 種。采用LC-MS技術(shù)篩選出各組的差異代謝物分別為99、75、70 種。從差異代謝物種類變化可知，所獲得的差異代謝物的種類隨冷鮮灘羊脂肪貯藏時間的延長呈先升后降趨勢。

2.3 差異代謝物的種類及變化分析

采用GC-MS篩選出的飽和脂肪酸有花生酸、硬脂酸、棕櫚酸；n-6不飽和脂肪酸有亞油酸、花生四烯酸；n-9不飽和脂肪酸有油酸、反油酸。采用LC-MS篩選出的飽和脂肪酸有硬脂酸；n-3不飽和脂肪酸有二十碳五烯酸。

將篩選出的差異代謝物中與糖酵解及脂質(zhì)代謝的相關(guān)差異代謝物，做關(guān)聯(lián)對比分析。在0 d組與4 d組中發(fā)現(xiàn)糖酵解原料葡萄糖、果糖相對含量顯著上升相，說明宰后冷鮮貯藏4 d內(nèi)，與葡萄糖、果糖相關(guān)的正常代謝途徑受阻，導致二者含量積累。在此時，丙酮酸的相對含量下降，說明糖酵解生成丙酮酸的途徑受阻或相關(guān)代謝通路關(guān)閉，而丙酮酸與生糖氨基酸的相互轉(zhuǎn)化及進入三羧酸循環(huán)的相關(guān)代謝途徑并未受到抑制，故丙酮酸的相對含量顯著下降。在4 d組與8 d組中發(fā)現(xiàn)糖酵解的產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸的相對含量顯著上升，該現(xiàn)象說明經(jīng)過一段冷鮮貯藏后，葡萄糖、果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸的相關(guān)合成途徑打開，這可能是由于與該途徑相關(guān)的酶的活性提高[26-32]。

所篩選出的游離氨基酸在冷鮮貯藏第8天時相對含量發(fā)生變化，在之后的貯藏期內(nèi)無變化；如蘇氨酸、丙氨酸、D-絲氨酸、DL-正亮氨酸在貯藏第8天時相對含量顯著上升，而天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸相對含量顯著下降。這說明大部分游離氨基酸在貯藏第8天時產(chǎn)生，而其中蘇氨酸、丙氨酸、谷氨酸及天冬氨酸、精氨酸等屬呈味氨基酸[33-34]。同時還發(fā)現(xiàn)了呈苦味物質(zhì)次黃嘌呤[35-41]，其由肌苷轉(zhuǎn)化而來[42-43]。說明了在冷鮮貯藏第8天時，呈味小分子物質(zhì)含量出現(xiàn)較大變化。

在貯藏第8天時，由GC-MS檢測到油酸、硬脂酸、棕櫚酸含量顯著下降。結(jié)合LC-MS中檢測到的L-肉堿代謝的變化，可知在第8天時肉堿相對含量增高，而丙酮酸的相對含量上升，這與油酸、硬脂酸、棕櫚酸的相對含量下降相對應，說明在貯藏第8天時，脂肪酸的代謝較活躍，可能是與肉堿參線粒體中乙酰輔酶A的合成從而進一步使脂肪酸代謝活躍[27]。具體差異代謝物如表2、3所示。

13-羥基十八碳二烯酸（13-hydroxyoctadecadienoicacid，13-HODE）作為亞油酸的分解產(chǎn)物，其在貯藏4 d時的平均表達量顯著升高，這種現(xiàn)象可能由于13-HODE的主要代謝方式是通過NAD+依賴性脫氫酶（13-HODE脫氫酶）氧化成2,4-二烯酮、13-HODE的過程受阻或亞油酸分解活躍所導致的。13-HODE是由亞油酸在動物體內(nèi)合成的[44-45]。大多數(shù)與脂肪酸相關(guān)差異代謝物的相對含量變化均發(fā)生在4～8 d內(nèi)，如油酸、棕櫚酸、硬脂酸及二十碳五烯酸，而油酸、棕櫚酸、硬脂酸在4 d與8 d組中相對含量均下降，而二十碳五烯酸相對含量上升。該現(xiàn)象說明，在貯藏期第8天時，與脂肪酸相關(guān)的代謝途徑受到抑制，雖然第4天時并沒有檢測到相關(guān)脂肪酸相對含量的變化，亦可能是由于此類代謝物在4 d時并無表達量差異所致。

所篩選出的游離脂肪酸在冷鮮貯藏第8天時相對含量發(fā)生顯著變化，該現(xiàn)象的原因可以解釋為脂質(zhì)氧化降解所產(chǎn)生的香氣物質(zhì)如有烤肉味的反,反-2,4-癸二烯醛，具有油脂味的壬醛及有肥皂味的2-庚酮，有青草味的1-己醇等的前體物質(zhì)為棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸、油酸及其組合[46-51]。這也進一步證明在冷鮮貯藏過程中，風味物質(zhì)的前體就已經(jīng)產(chǎn)生。

表2 采用GC-MS篩選的冷鮮灘羊脂肪貯藏12 d主要差異代謝物種類及平均表達量變化Table 2 Changes in average expression levels of main differential metabolites in chilled Tan sheep meat lipids during 12-day storage determined by GC-MS

3 結(jié) 論

冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中差異代謝物的種類隨貯藏時間的延長總體呈下降趨勢。宰后機體內(nèi)很快處于缺氧狀態(tài)，但細胞仍企圖維持其ATP在一個較高水平，機體利用糖酵解代替氧化磷酸化而提供ATP以及利用磷酸肌酸和ADP的轉(zhuǎn)化補充ATP，于是構(gòu)成了一個宰后供能反應體系。0 d組與4 d組，與糖代謝有關(guān)的物質(zhì)如葡萄糖，含量上升，說明這段時間內(nèi)，細胞處于無氧環(huán)境中，在0～4 ℃的溫度下，并沒有立即進行糖酵解過程。4 d組與8 d組，細胞在低溫環(huán)境下，利用氨基酸、糖等能源物質(zhì)供能，同時，脂肪代謝的途徑也被激活，在此時大量的呈味物質(zhì)產(chǎn)生，如呈苦味及鮮味的次黃嘌呤、丙氨酸及蘇氨酸，以及脂肪代謝產(chǎn)生的種風味物質(zhì)前體的油酸、棕櫚酸、硬脂酸。脂肪細胞中檢測出次黃嘌呤、丙氨酸及蘇氨酸等呈味物質(zhì)的現(xiàn)象可以解釋為，氨基酸、糖、脂肪酸之間的轉(zhuǎn)化體系在屠宰時突然停止，雖然機體死亡，但組織、細胞的代謝活動并未停止，只是在機體死亡后，正常的三者之間的轉(zhuǎn)換途徑突然關(guān)閉，而經(jīng)過一段時間的冷鮮貯藏后，其相互轉(zhuǎn)換的途徑重新開啟所致。貯藏8 d作為宰后細胞代謝活動的分水嶺，風味物質(zhì)前體如油酸、棕櫚酸、硬脂酸在此時段內(nèi)產(chǎn)生，但其含量在8 d后就處于下降狀態(tài)。而采用GC-MS和LC-MS法檢測全部代謝產(chǎn)物，更深入的了解了宰后代謝的整體變化情況，結(jié)果表明，兩種方法下測出的差異代謝物有互補作用。因此，研究宰后脂肪代謝隨貯藏時間的推移變化，能為冷鮮灘羊肉生產(chǎn)技術(shù)改進提供理論指導。