KANEZA PASCAL，楊林青，孫付保*，肖志紅，劉汝寬，孫海彥

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)3(湖南省林業(yè)科學(xué)院生物能源研究所，湖南 長沙，410004)4(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?，571101)

利用豐富的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)可再生資源生產(chǎn)纖維素乙醇可有效緩解當(dāng)前能源危機。然而，目前過高的生產(chǎn)成本嚴(yán)重阻礙了纖維素乙醇的商業(yè)化進(jìn)程。WINGREN等[1]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)基質(zhì)濃度每提高3%，相應(yīng)的操作成本會降低 19%。而當(dāng)基質(zhì)濃度從 20%上升到 30%時，燃料乙醇的成本能降低 0.1美元/加侖。因此，高基質(zhì)濃度(濃醪)酶解工藝相比于低基質(zhì)濃度酶解工藝，其在經(jīng)濟效益方面的優(yōu)勢非常巨大。可見，纖維素生物質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇的一個關(guān)鍵在與如何實現(xiàn)高基質(zhì)濃度的酶解產(chǎn)糖。

針對此問題[2]，不少研究者圍繞糖化發(fā)酵工藝和改進(jìn)辦法進(jìn)行了不懈探索，如添加輔助酶及添加劑、分批補料和改變濃醪混合方式等。ZHANG等[3]在酶解實驗中分別添加150 mg/g干基BSA和Tween 80后，酶解24 h時葡萄糖產(chǎn)率較對照組(22.7%)分別提高至61.6%和62.2%。趙曉斌在10 FPU/g干基和20%基質(zhì)濃度條件下以甲酸預(yù)處理甘蔗渣為底物進(jìn)行批次酶解和分批補料實驗，酶解144 h后分批補料方式的葡萄糖產(chǎn)量比批次酶解提高15%。余恒以預(yù)處理后玉米秸稈為基質(zhì)，采用圓底燒瓶和機械攪拌方式進(jìn)行20%濃度的基質(zhì)酶解，葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到120.7 g/L，較搖床振蕩水解(葡萄糖產(chǎn)量96.4 g/L)提高25%。這些結(jié)果顯示，采用輔助水解策略，如添加劑、輔助酶、機械攪拌和分批補料等，有可能改善纖維基質(zhì)濃醪水解黏度大和傳質(zhì)傳熱困難等不足，實現(xiàn)木質(zhì)纖維素基質(zhì)在低酶載條件下的高效濃醪水解糖化。

基于此，本文以實驗室已有的堿催化常壓甘油有機溶劑預(yù)處理甘蔗渣為原料，嘗試開展低酶載量(6 FPU/g DM)下基質(zhì)濃醪(350 g/L)水解糖化的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑材料與儀器設(shè)備

甘蔗渣(廣西壯族自治區(qū))過篩，篩選尺寸5 mm×1 mm左右的甘蔗渣，烘干后存于塑封袋備用。使用前測定其3大主要組分含量：纖維素43.3%、半纖維素27.6%、木質(zhì)素21.5%。工業(yè)甘油(純度99.5%)，購自無錫化工站；纖維素酶Cellic CTecⅡ濾紙酶活140 FPU/mL，來自諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；溶菌酶，來自國藥集團；木聚糖酶蛋白(含量158 mg/g)，來自青島蔚藍(lán)生物有限公司饋贈。高效液相色譜儀，日本HITACHI公司;SBA-40E 生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；HYG-A全溫?fù)u瓶柜，江蘇太倉實驗設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗渣的堿催化常壓甘油有機溶劑預(yù)處理

準(zhǔn)確稱量150 g篩選好的絕干甘蔗渣放入5 000 mL三口燒瓶中，隨后緩緩加入1 500 g工業(yè)甘油，接著添加4.45 g NaOH。將上述裝置放入恒溫加熱套中，設(shè)定預(yù)處理溫度257 ℃，待溫度上升至257 ℃后開始計時18 min。反應(yīng)結(jié)束后，首先將1 500 mL自來水倒入燒瓶內(nèi)使基質(zhì)充分解離后用G1砂芯漏斗進(jìn)行過濾，接著用2 000 mL自來水對上步濾餅先后洗滌2次并用G1砂芯漏斗進(jìn)行過濾，最終所獲濾餅即為al-AGOP甘蔗渣基質(zhì)。預(yù)處理后將基質(zhì)自然晾至水分含量為50%，存于塑封袋并置于4 ℃層析柜備用。

1.2.2 酶解

(1)搖瓶振蕩酶解

在250 mL錐形瓶中準(zhǔn)確加入9.5 g甘蔗渣基質(zhì)，按5 FPU/g干基質(zhì)添加纖維素酶，加入相應(yīng)的添加劑和輔酶后添加50 mL檸檬酸緩沖液(pH 4.8)。將錐形瓶置于全溫?fù)u瓶柜中進(jìn)行酶解，條件設(shè)定為50 ℃，180 r/min，分別于6、12、24、36、48、60和72 h取樣并測定葡萄糖濃度。

(2)機械攪拌酶解

準(zhǔn)確稱量相應(yīng)質(zhì)量甘蔗渣基質(zhì)放入250 mL圓底燒瓶中，加入適量的pH 4.8檸檬酸緩沖液至總體積為45 mL，加入6 FPU/g干基纖維素酶和適量添加劑或輔酶，接著將帶有橡膠塞的雙葉攪拌槳放入圓底燒瓶中并與機械攪拌(轉(zhuǎn)速150 r/min)裝置固定于50 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解。高濃酶解采取分批補料方式，在所需補料時間點暫停機械攪拌補入相應(yīng)補料量后繼續(xù)進(jìn)行機械攪拌酶解，并在6、12、24、36、48、60和72 h取樣并檢測樣品中的葡萄糖濃度。

1.3 分析測定方法

濾紙酶活(FPA)依照國際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(IUPAC)推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)法測定[4]。通過高效液相色譜(HPLC)法(色譜柱BioRad Aminex HPX-87H,300 mm×7.8 mm)檢測組分含量中葡萄糖、木糖濃度，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫60 ℃，示差檢測器(日立HITACHI)。酶水解過程中葡萄糖濃度采用SBA-40E 生物傳感分析儀法確定。所有實驗均重復(fù)3次并取平均值且標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加劑的選擇

2.1.1 單因素實驗

相關(guān)文獻(xiàn)顯示[5-6]，添加劑可以通過疏水作用和氫鍵作用于木質(zhì)素，阻止纖維素酶和木質(zhì)素之間無效吸附，進(jìn)而促進(jìn)纖維素酶解進(jìn)程。因此，本實驗考察了3種添加劑(牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)、Tween 20、茶皂素)對預(yù)處理后甘蔗渣的酶解影響。首先通過單因素實驗確定BSA、Tween 20、茶皂素相對較優(yōu)的濃度，實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 單因素實驗優(yōu)化添加劑濃度Fig.1 Single factor experiment of additive concentration

如圖1所示，隨著BSA添加量的增大，al-AGO預(yù)處理甘蔗渣酶解產(chǎn)葡萄糖濃度呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢。當(dāng)BSA質(zhì)量濃度達(dá)到30 mg/g干基時，葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到最高為96 g/L，比對照組(80 g/L)提高了20%。因此，實驗選擇BSA添加量為30 mg/g干基。添加茶皂素時，葡萄糖濃度隨著茶皂素添加量也呈先增加后降低的趨勢。當(dāng)茶皂素添加量為10 mg/g干基時，葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大為89.0 g/L，相較于空白組(78.0 g/L)提高了14%。因此，選擇10 mg/g干基茶皂素用于后續(xù)實驗。添加Tween 20時，葡萄糖質(zhì)量濃度隨著Tween 20添加量的增加呈先上升后降低的趨勢。當(dāng)Tween 20 添加量低于20 mg/g干基時，葡萄糖濃度均隨著Tween 20添加量的增大而增大；添加量為20 mg/g干基時葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到最高為89.0 g/L，較對照組(80 g/L)提高了約11%。因此，選擇添加量為20 mg/g干基Tween 20用于后續(xù)實驗。

2.1.2 正交實驗優(yōu)化

經(jīng)過上述對添加劑的單因素優(yōu)化后，本實驗最終確定添加劑種類及質(zhì)量濃度為：30 mg/g干基BSA、10 mg/g干基茶皂素、20 mg/g干基Tween 20。為了進(jìn)一步考察各因素之間對酶解作用的相互影響，實驗接著使用軟件minitab針對BSA、茶皂素和Tween 20三個參數(shù)進(jìn)行L9(34)正交試驗，實驗設(shè)計及結(jié)果如表1所示。

表1 糖化條件因素水平正交試驗分析Table 1 Orthogonal analysis of saccharification conditions

經(jīng)過軟件分析，3個參數(shù)對基質(zhì)酶解糖化影響大小的排秩順序為：茶皂素、Tween 20、BSA。最優(yōu)組合為A2D2C3B1，即：10 mg/g干基茶皂素、25 mg/g干基Tween 20、10 mg/g干基BSA。結(jié)果表明，在此條件下酶解60 h時葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)95.0 g/L。

2.2 輔助酶的選擇

2.2.1 溶菌酶最適濃度的確定

有文獻(xiàn)報道[7]，在纖維素酶解過程中添加適量溶菌酶可以減少木質(zhì)素的無效吸附，進(jìn)而促進(jìn)酶解。因此，本實驗在酶解開始時添加10、20、30、40 mg/g干基的溶菌酶，考察溶菌酶添加量對酶解效果的影響。結(jié)果如圖2所示，添加不同濃度的溶菌酶，對酶解并沒有促進(jìn)效果，各實驗組與對照組葡萄糖濃度基本持平，因此,本實驗不采用溶菌酶作為額外輔酶使用。

圖2 溶菌酶對酶解的影響Fig.2 The influence of lysozyme on hydrolysis

2.2.2 木聚糖酶最適濃度的確定

一些報道顯示[1,8]，預(yù)處理后木質(zhì)纖維原料的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破碎，使得纖維素暴露于外部，但在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中仍存在部分半纖維素纏繞在纖維素外部，還有部分半纖維素可經(jīng)纖維素孔延伸至原纖維絲中阻礙纖維素酶吸附纖維素。因此，本實驗在酶解初始時添加0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/g干基的內(nèi)切木聚糖酶(endoxylanase,EX)，考察其對基質(zhì)酶解的影響。結(jié)果如圖3所示，在EX存在下纖維素和半纖維素的酶解能力均有明顯提高。隨著EX添加量增大，酶解過程中葡萄糖和木糖濃度也隨之增大；但當(dāng)添加量超過0.6 mg/g干基時增幅變緩，產(chǎn)糖量基本持平。因此，后續(xù)實驗按0.6 mg/g干基添加EX。在此條件下酶解60 h后葡萄糖質(zhì)量濃度為97.4 g/L，相較于空白組(80.0 g/L)提高了21.8%；木糖質(zhì)量濃度為39.1 g/L，相較于空白組(28.2 g/L)提高了38.7%。

圖3 木聚糖酶對酶解的影響Fig.3 The influence of xylanase on hydrolysis

2.3 濃醪酶解糖化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[9-10]，當(dāng)基質(zhì)質(zhì)量濃度大于150 g/L時，可認(rèn)定為高基質(zhì)濃度。但在實際生產(chǎn)中，基質(zhì)質(zhì)量濃度高于150 g/L時，酶水解液將變得非常黏稠，使其難以在搖瓶中搖勻和高效酶解。同時，高質(zhì)量濃度基質(zhì)水解液中自由水含量較低，影響微粒的潤滑特性，阻礙纖維素酶與甘蔗渣基質(zhì)有效結(jié)合。因此，本實驗為了實現(xiàn)高濃基質(zhì)的酶解糖化，采用機械攪拌和全濕基分批補料方式進(jìn)行酶解以促進(jìn)纖維素酶與甘蔗渣基質(zhì)的有效結(jié)合。

2.3.1 初始基質(zhì)濃度的選擇

本實驗在總基質(zhì)質(zhì)量濃度保持在350 g/L不變的情況下，考察不同初始基質(zhì)濃度對批次酶解(酶載量6 FPU/g干基)產(chǎn)糖的影響。實驗結(jié)果如圖4所示，葡萄糖濃度隨著初始基質(zhì)濃度的增大而提高，在基質(zhì)質(zhì)量濃度大于190 g/L時,葡萄糖濃度增幅變緩。在基質(zhì)質(zhì)量濃度為190 g/L時，葡萄糖濃度最高，達(dá)到 94.7 g/L。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，在進(jìn)行分批補料過程中若初始基質(zhì)濃度偏低，則導(dǎo)致后期補料量過高，酶解過程中醪液黏度增大不利于糖化；若初始基質(zhì)濃度偏高，醪液過于黏稠影響傳質(zhì)，導(dǎo)致纖維素酶和基質(zhì)難以有效接觸，基質(zhì)無法徹底液化從而無法進(jìn)行補料。因此，本實驗選擇190 g/L作為初始基質(zhì)質(zhì)量濃度。

圖4 初始基質(zhì)濃度的選擇Fig.4 The selection of initial substrate concentration

2.3.2 補料方式的確定

根據(jù)一些資料報道[1,11]，在補料過程中若單次補料量過高(高于10%)，會短時間內(nèi)造成醪液過于黏稠，對后期補料造成困難；若單次補料量過少，則需要補料多次，纖維素酶酶活不足以支撐整個補料過程。可見，整個補料過程受到補料次數(shù)和補料量兩者相互作用的影響。因此，本實驗在前期實驗基礎(chǔ)上，以190 g/L為初始基質(zhì)濃度，設(shè)計5種不同的補料量、補料次數(shù)，初步選擇最適合本實驗的補料方式，具體設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

表2 分批補料次數(shù)選擇Table 2 The selection of feeding time

注：2%、4%、8%表示單次補料量(W/W)。

如表2所示，第1、2種補料方式，無論是葡萄糖濃度還是酶解率均相差不大；第3種補料方式的葡萄糖產(chǎn)量和酶解率在酶解全程均顯著高于其他實驗組，說明補料次數(shù)偏少影響酶解效果，補料3次的方式最適宜；第4、5種補料方式均為補料5次，但是第5種補料方式的葡萄糖產(chǎn)量和酶解率相對較高，說明第5種補料量相對合理，首次補料量不宜過高。因此，實驗初步選擇第3種補料方式，即分別在12、20和22 h補料8%、4%和4%。

在確定了3次補料方式為最優(yōu)補料次數(shù)后，實驗在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察不同時間點、補料量的3次補料模式，以期縮短補料時間。因此實驗考察在第7、10和13 h分別補料6%、5%和5%；第12、18和21 h分別補料8%、4%和4%；第13、17和20 h分別補料7%、5%和4%三種補料模式。實驗條件為：酶載量6 FPU/g干基，酶解起始添加0.6 mg/g干基EX、10 mg/g干基茶皂素、25 mg/g干基Tween 20、10 mg/g干基BSA，補料最終濃度35%。實驗結(jié)果如表3所示。

補料方式1,由于補料時間較為集中且最終補料在13 h結(jié)束，因此在12 h基質(zhì)尚未液化無法檢測，但后期酶解液液化時間充足，在24 h時基質(zhì)已液化可檢測，在48 h時葡萄糖質(zhì)量濃度及酶解率分別為160.6 g/L和76.5%；補料方式2的初始補料時間相對較晚(推遲5 h)，因此在初始補料時體系中葡萄糖質(zhì)量濃度較高(86.3 g/L)，較補料方式1(76.9 g/L)高出約12%，但是在48 h時葡萄糖質(zhì)量濃度(147.8 g/L)和酶解率(70.4%)相對補料方式1實驗組較低，可能的原因是該補料方式補料時間偏后，導(dǎo)致纖維素酶酶活在后期削弱與基質(zhì)的結(jié)合能力變差；補料方式3在10 h時初始基質(zhì)已液化并檢測到葡萄糖質(zhì)量濃度79.3 g/L，該實驗組48 h葡萄糖質(zhì)量濃度及酶解率分別為141.3 g/L和67.3%，明顯低于補料方式1。因此，補料方式1不論是補料時間還是單次補料量相對是較好的。因此，實驗最終選定補料方式1，即在7、10和13 h分別補料6%、5%和5%。

表3 3種不同補料方式對酶解的影響Table 3 The influence of feeding method on hydrolysis

實驗確定濃醪酶解條件為：在纖維素酶酶載量6 FPU/g干基、初始基質(zhì)質(zhì)量濃度190 g/L條件下，于酶解初始時一次性添加0.6 mg/g干基EX、10 mg/g茶皂素、10 mg/g BSA和25 mg/g干基Tween 20，接著于7、10和13 h分別補料6%、5%和5%，至最終質(zhì)量濃度為350 g/L。在此條件下，運行濃醪酶解糖工藝全程，最終結(jié)果如下：預(yù)酶解48 h時，葡萄糖質(zhì)量濃度高達(dá)160.7 g/L，酶解率為76.5%；木糖質(zhì)量濃度達(dá)到58.7 g/L，半纖維素水解率為57.8%。工藝運行全程糖濃度變化如圖5所示。

圖5 濃醪酶解全程糖濃度變化Fig.5 The change of glucose concentrations during the high concentration hydrolysis

DAVID等[12]在加酶量為 10.7 FPU/g纖維素的條件下，通過分批補料的方式使基質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到 25%，240 h的水解液中的葡萄糖質(zhì)量濃度將近 140 g/L，本實驗相較其不僅提高了基質(zhì)濃度，且酶解時間縮短了192 h。該結(jié)果與我們實驗室前期工作相比也取得了明顯進(jìn)步：王亮[13]曾以自催化常壓甘油有機溶劑預(yù)處理麥草，基質(zhì)在30 FPU/g干基條件下進(jìn)行半同步濃醪發(fā)酵(基質(zhì)質(zhì)量濃度350 g/L)，24 h時葡萄糖質(zhì)量濃度為58.2 g/L；本實驗酶載量僅為6 FPU/g，24 h葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到123.8 g/L，約為其2倍。洪嘉鵬[14]以堿催化常壓甘油有機溶劑預(yù)處理后甘蔗渣為基質(zhì)，在6 FPU/g干基條件下進(jìn)行半同步濃醪發(fā)酵(基質(zhì)質(zhì)量濃度350 g/L)，預(yù)酶解72 h,葡萄糖質(zhì)量濃度為132 g/L，本實驗相比其不僅酶解時間縮短了24 h，且葡萄糖質(zhì)量濃度提高了約22%?？梢?，本文確定的輔助酶和添加劑的種類、濃度和分批補料模式可顯著提高高基質(zhì)濃度體系的酶解產(chǎn)糖量，為后續(xù)實現(xiàn)高濃度纖維素乙醇發(fā)酵提供可能。

3 結(jié)論

堿催化常壓甘油有機溶劑預(yù)處理甘蔗渣在6 FPU/g干基酶載量條件下,通過分批補料方式(初始基質(zhì)質(zhì)量濃度190 g/L)達(dá)到濃醪(350 g/L)酶解，使用添加劑(10 mg/g茶皂素、10 mg/g BSA、25 mg/g Tween 20)和木聚糖酶(0.6 mg/g干基)酶解48 h,可發(fā)酵性糖高達(dá)220 g/L，其中葡萄糖和木糖產(chǎn)量分別為160.7和58.7 g/L，具有明顯的工業(yè)意義。分批補料方式是實現(xiàn)木質(zhì)纖維素基質(zhì)濃醪水解糖化的有效途徑，添加劑和輔助酶不但有助于底物的常規(guī)酶解糖化，在濃醪基質(zhì)糖化過程中仍具有積極作用。