鐘 燦，金 劍，劉 浩，蔡 媛，秦 優(yōu)，謝 景，王維子，秦裕輝，黃惠勇，張水寒*

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院 中藥研究所，湖南 長沙 410013；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208)

蟲草是蟲草真菌寄生于昆蟲幼蟲或者蛹上的蟲菌復(fù)合體[1]，全世界蟲草真菌約有 1 000 余種，隸屬 3 個科 20 余屬[2-3]。據(jù)粗略統(tǒng)計，我國目前共報道蟲草約 100 余種[4-6]，其寄主昆蟲共涉及昆蟲綱Insecta 的 11 個目 100 余種[7]，其中 13 種蟲草被列為藥用真菌[8]，具有很好的藥用價值。隨著人們對健康養(yǎng)生的重視和蟲草的藥用保健價值認(rèn)識的深入，蟲草的產(chǎn)業(yè)化用量和優(yōu)質(zhì)蟲草的市場需求急劇增加。目前青藏高原及周邊海拔3 000 m以上地區(qū)生長的野生冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)占據(jù)蟲草的主流市場，年采集量 100 t以上[9]，年總產(chǎn)值超過 300 億。然而連年無序地采挖，使生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重受損，造成菌源枯竭，蟲草資源瀕危，而冬蟲夏草規(guī)模化人工培育還有諸多的技術(shù)難題尚未攻克。蟲草是我國重要的藥用真菌[10]，加強(qiáng)蟲草類的研究，對今后開展相關(guān)藥用真菌的研究具有重要的參考價值。模式蟲草的深入研究和新型蟲草的挖掘，已經(jīng)成為近年來研究的熱點。雪峰蟲草(Ophiocordycepsxuefengensis)是近年來在湖南省雪峰山系發(fā)現(xiàn)的一種新的蟲草資源，在洞口縣民間替代冬蟲夏草治療癌癥、咳嗽及提高免疫力等，已有上百年的應(yīng)用。其與冬蟲夏草親緣關(guān)系最近[11]，而對環(huán)境條件要求不嚴(yán)格，易于實現(xiàn)人工栽培，這意味著雪峰蟲草具有開發(fā)成冬蟲夏草替代品的獨(dú)特潛質(zhì)，是值得深入研究的新蟲草資源。本文主要以蟲草生長習(xí)性、菌種及其選育、蟲草復(fù)合體的培育、人工子實體的培育、化學(xué)成分以及藥理作用等，系統(tǒng)總結(jié)近年來對雪峰蟲草的研究進(jìn)展，對比雪峰蟲草、冬蟲夏草和蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)之間的異同點，闡釋雪峰蟲草的資源特色。

1 生長習(xí)性

雪峰蟲草與冬蟲夏草的親緣關(guān)系很近，同蛹蟲草一樣易于人工培養(yǎng)，但它們的寄主、形態(tài)、生態(tài)均不同(表1)。雪峰蟲草多生于海拔 300～1 000 m的活體植物馬鞭草科大青(ClerodendrumcyrtophyllumTurcz.)的根或莖中。主要分布于湖南省洞口縣、武岡縣、洪江市、溆浦縣等雪峰山脈區(qū)。與其他蟲草相比，雪峰蟲草有三個顯著特征：①它的寄主可能是已發(fā)現(xiàn)的蟲草屬真菌中最大的，幼蟲大小(60～110)mm×(7～12)mm；②寄主是單一的巨癤蝙蛾幼蟲，棲生在大青樹莖或根內(nèi)；③具有無不孕頂端[11],其生長環(huán)境和形態(tài)特征見圖 1 。

圖1 雪峰蟲草生長環(huán)境及形態(tài)Fig.1 Growth environment and morphology of O. xuefengensisA：野生雪峰蟲草；B：雪峰蟲草生長環(huán)境；C：大青；D、E：生長在大青根莖中的雪峰蟲草A:Natural O.xuefengensis；B:Growth environment；C:Clerodendrum cyrtophyllum Turcz；D,E:O.xuefengensis grew in the rhizome

2 菌種及其選育

蟲草菌分離與純化得到單一的菌種是實現(xiàn)人工培育的前提。從天然冬蟲夏草上分離的已報道真菌名稱多達(dá) 22 個[22]，認(rèn)為冬蟲夏草菌是復(fù)合種，即除了真正的冬蟲夏草菌外，可能還包括其他隱含種和伴生種[9]，這可能與冬蟲夏草難以培育子座，無法根據(jù)子座進(jìn)行鑒別有關(guān)。而對于蛹蟲草、廣東蟲草、蟬花蟲草等易于培育子座的蟲草來說，菌種分離與鑒定不存疑，雪峰蟲草也如此。近年來，團(tuán)隊先后 10 余次赴洞口縣采集野生雪峰蟲草，并分離了 10 余株菌株，與冬蟲夏草、蛹蟲草等進(jìn)行親緣關(guān)系分析[23]，發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)最適溫度為 20～25 ℃，濕度為 60%～80%，避光。且通過人工培育后其菌絲、子座外觀形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)等與野生雪峰蟲草基本一致。

針對野生蟲草菌種在人工培育過程中容易喪失子座分化能力、穩(wěn)定性差，以及蟲草素、多糖等活性物質(zhì)含量低等問題，科研人員以蛹蟲草為模式菌種，對其分離復(fù)壯進(jìn)行研究[24]，同時采用紫外誘變[25]、原生質(zhì)體融合技術(shù)[26-28]、超聲聯(lián)合化學(xué)試劑復(fù)合誘變[29]、離子誘變[30]、基因工程技術(shù)[31]等技術(shù)手段用于菌種選育，并取得了一定的效果。我們也正嘗試采用多種技術(shù)相結(jié)合方式選育優(yōu)良菌株，為雪峰蟲草人工規(guī)?；嘤峁﹥?yōu)勢菌株。

3 人工培育現(xiàn)狀

近年來，人工培養(yǎng)蟲草已成為一個熱點問題，特別是冬蟲夏草人工培育還有諸多的技術(shù)難題尚未攻克。蟲草的人工培育包括蟲菌復(fù)合體、子座和發(fā)酵液等不同方式，蟲草人工培養(yǎng)對蟲草類真菌的科學(xué)研究和生產(chǎn)應(yīng)用具有雙重意義。

3.1 蟲菌復(fù)合體的培育

蟲菌復(fù)合體的培育一直以來備受蟲草研究人員關(guān)注，我國從 20 世紀(jì) 70 年代開始蟲草人工栽培技術(shù)的研究，全國先后有幾十家科研院所和企業(yè)對冬蟲夏草[32]、蛹蟲草(桑蠶蛹、大麥蟲蛹等)[33-35]、泰山蟲草(CN.200510133720.6)等的人工培育進(jìn)行研究。然而由于冬蟲夏草價值高，是市場認(rèn)可的主流產(chǎn)品，從菌種分離、幼蟲養(yǎng)殖、侵染和出草等四個關(guān)鍵環(huán)節(jié)對冬蟲夏草全人工培育進(jìn)行了大量研究[36]。目前已掌握了冬蟲夏草的人工培育的一些關(guān)鍵技術(shù)，但過低的侵染率和出草率制約著冬蟲夏草人工培育的規(guī)?；a(chǎn)。

筆者前期試圖對雪峰蟲草蟲菌復(fù)合體的全人工培育進(jìn)行研究，但對雪峰蟲草的寄主巨癤蝙蛾生物學(xué)特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其生活史復(fù)雜，生長周期較長[37]，其寄主幼蟲的培育還在繼續(xù)探索，侵染和培養(yǎng)技術(shù)已相對較為成熟。

侵染過程包括幼蟲的選擇、消毒、侵染方法的選擇和用菌量等。幼蟲的選擇常用齡期作為控制指標(biāo)[38]，通過酒精[33]、升汞、臭氧水[39]或者紫外照射等方式消毒，用分生孢子[40]、菌液[41]或者孢子菌絲懸浮液等，通過表皮涂抹、噴霧、菌液浸泡、注射和喂食等方式進(jìn)行侵染，大部分研究表明注射方法侵染效果最佳[41]，也有認(rèn)為表皮涂抹和噴霧效果較好，而浸泡和喂食不能侵染[40]。

筆者將采挖的巨癤蝙蛾幼蟲在無菌環(huán)境下飼養(yǎng) 30～50 d，排除野外感染雜菌和雪峰蟲草菌的可能，以蟲體直徑和長度作為篩選指標(biāo)，對侵染的關(guān)鍵指標(biāo)和技術(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直徑>6.0 mm，長度>7 cm的幼蟲，用 75%酒精擦拭配合紫外消毒 20 min效果較好，在其頭部以下 3～5 環(huán)之間注射 0.2～0.3 mL 菌絲體懸浮液，死亡率明顯低于比其小的幼蟲，而侵染率明顯高于其他幼蟲。幼蟲成活率高達(dá) 95% 以上，污染率在 15% 以下，侵染率均在 65% 以上，最高可以達(dá)到 85%。

侵染后的幼蟲出草與否，是蟲草培育成功的關(guān)鍵。研究表明出草與溫度、光照等相關(guān)[36，42]。筆者通過研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌種是出草的前提，前期分離純化的 10 株(HCMA001～010)菌株，經(jīng)過固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其中 6 株(HCMA001、003、005、008、009、010)子座形成能力較強(qiáng)，與其他 4 株對比發(fā)現(xiàn)，其侵染幼蟲成功率和出草率更高。而出草的條件則主要與溫度和光照相關(guān)，濕度影響不大。注射菌液后應(yīng)放置在黑暗條件，7～10 ℃培養(yǎng)15～30 d，待菌絲布滿蟲體，體表有子座原基分化后，轉(zhuǎn)入 20～25 ℃、0～250 lux的弱光中繼續(xù)培育待子座成熟，雪峰蟲草蟲菌復(fù)合體的人工培育見圖 2 ，相關(guān)成果已申請了國家發(fā)明專利(專利申請?zhí)?01611187730.2)。

圖2 雪峰蟲草蟲菌復(fù)合體的人工培育Fig.2 Artificial cultivation of O. xuefengensisA：雪峰蟲草菌液體發(fā)酵；B～D：人工培育雪峰蟲草蟲菌復(fù)合體A:Mycelial liquid culture；B-D:Cultivation of fungus-caterpillar complex

3.2 人工子座的培育

蟲菌復(fù)合體的人工培育存在諸多難點，限制了其規(guī)?；l(fā)展，因此科研工作者在探索更為合理、有效的培養(yǎng)方式。日本清水大典報道稱1932 年，小林義雄等首次在米飯培養(yǎng)基上成功獲得蛹蟲草子座，諸多學(xué)者開展了人工培養(yǎng)基培養(yǎng)蟲草子座的探索[44-46]，取得了不錯的成果，目前已經(jīng)實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，并被開發(fā)成多樣產(chǎn)品。

筆者充分總結(jié)蛹蟲草子座人工培育的經(jīng)驗和成果，根據(jù)雪峰蟲草的生長習(xí)性，對雪峰蟲草子座的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蠶蛹粉是子座形成和生長的必要條件，并控制大米∶蠶蛹粉為(15～20)∶(3～5)，添加的營養(yǎng)液是大米的 3～4 倍量，培養(yǎng)基過干或者過濕都會影響子座原基分化和生長量，而培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質(zhì)的添加，如蛋白胨和牛肉膏等氮源，葡萄糖和蔗糖等碳源，以及微量元素或者維生素等對其子座分化和生長影響較小。

適宜溫度和避光培養(yǎng)條件是子座原基分化和生長的關(guān)鍵環(huán)境因子。溫度和光照控制根據(jù)雪峰蟲草的生長三個不同階段進(jìn)行調(diào)控。接種后菌絲生長期間適宜在 20～25 ℃避光培育至菌絲布滿培養(yǎng)基表層；再轉(zhuǎn)移至 5～10 ℃、12 h /20～25 ℃、12 h變溫條件下，避光培養(yǎng)至子座原基分化；轉(zhuǎn)入 20～25 ℃、0～250 lux弱光培養(yǎng)，至子座長到 8～12 cm，即可采收。雪峰蟲草子座的人工培育見圖 3 。子座圓柱形，生長末端為米白色，生長過程中子座外壁逐漸轉(zhuǎn)變成黃褐色，直徑為 1～4 mm，長度 45～150 mm，與天然雪峰蟲草子座一致[11，47]。相關(guān)成果已申請了國家發(fā)明專利(專利申請?zhí)?01611187284.5)。

3.3 雪峰蟲草菌絲體的培養(yǎng)

蟲草菌絲體發(fā)酵液的人工培養(yǎng)容易成功，對環(huán)境條件要求不高，菌絲發(fā)酵液主要用于次生代謝產(chǎn)物富集和相關(guān)菌絲體產(chǎn)品的研究，加速了蟲草產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程[48-50]。冬蟲夏草菌絲體的深層液體發(fā)酵已經(jīng)較為成熟，已有基于液體發(fā)酵的菌絲體產(chǎn)品上市，例如百令膠囊、天獅蟲草菌絲體膠囊等。目前雪峰蟲草的液體發(fā)酵受設(shè)備等限制[51]，還沒有大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用，大多只是在實驗室進(jìn)行簡易搖瓶發(fā)酵，用于雪峰蟲草子座和蟲菌復(fù)合體人工培養(yǎng)的菌液制備。筆者前期在 2 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行了雪峰蟲草菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)，基于HPLC-Q-TOF-MS/MS對主要核苷類物質(zhì)進(jìn)行了分析。通過發(fā)酵菌絲體與野生雪峰蟲草對比，發(fā)現(xiàn)兩者的核苷類物質(zhì)差異不大，發(fā)酵菌絲體可作為一種野生雪峰蟲草的替代開發(fā)產(chǎn)品[23]。劉莎等[52]利用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)對雪峰蟲草菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)雪峰蟲草可在液態(tài)發(fā)酵體系高效積累代謝產(chǎn)物，通過發(fā)酵過程優(yōu)化控制,可實現(xiàn)該菌株細(xì)胞生長和活性代謝產(chǎn)物合成的優(yōu)化。液體深層發(fā)酵易于控制菌絲體培養(yǎng)條件，易于規(guī)?；糯蠛凸I(yè)化生產(chǎn)。類似抗生素生產(chǎn)的發(fā)酵工藝技術(shù)已經(jīng)成熟，可見，液體深層發(fā)酵也是雪峰蟲草培養(yǎng)的一個發(fā)展方向。

圖3 雪峰蟲草子座的人工培育Fig.3 Stromata artificial cultivation of O. xuefengensisA：子座原基；B～C：人工培育子座A:Stromata primordium inducing；B-C:Growth of stromata

4 化學(xué)成分研究

蟲草的化學(xué)成分包括核苷類、多肽類、多糖類、甾醇和糖醇類、凝集素、纖維蛋白溶解酶類、黃酮類、維生素類、類胡蘿卜素等[38,53]，而蟲草多糖和蟲草素被認(rèn)為是蟲草中最有藥用價值的成分[38]。張水寒等[54]采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對野生雪峰蟲草醇提物進(jìn)行分析，共鑒定了 28 個化合物，主要包括甘露醇、腺苷、麥角甾醇、谷甾醇、氨基酸、脂肪酸和糖類等成分。宛玉祥等[55]采用GC-MS技術(shù)鑒定了野生雪峰蟲草的揮發(fā)性成分，分別從石油醚部位鑒定了 44 個化合物，乙酸乙酯部位鑒定了 28 個化合物，主要為酸類、酯類和甾醇類等成分。朱如彩等[56]以腺苷為考察指標(biāo)，對雪峰蟲草的采收時期和質(zhì)量進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)以 8～12 月份采收的雪峰蟲草腺苷含量最高，為最佳采收時期。秦優(yōu)等[57]建立 11 批雪峰蟲草的高效液相色譜指紋圖譜，通過主成分分析篩選出核苷類成分作為評價雪峰蟲草藥材質(zhì)量的指標(biāo)成分。這些研究為雪峰蟲草有效物質(zhì)基礎(chǔ)和相關(guān)疾病的臨床治療研究提供參考和借鑒。

近年來隨著蟲草發(fā)酵液和子座人工培育的成功，其活性物質(zhì)也備受學(xué)者關(guān)注。劉莎等檢測雪峰蟲草菌絲體發(fā)酵液，成功檢測到了胞內(nèi)、胞外多糖，胞內(nèi)蟲草酸，胞內(nèi)總?cè)频瘸煞諿52,58]，且胞內(nèi)多糖的抗氧化活性優(yōu)于胞外多糖[58]，Zou等和Jin等也在人工培育的蟲草中檢測到了核苷類成分[23,59]，且基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)在雪峰蟲草中識別檢測到了蟲草素[54,57,60]。筆者前期對野生雪峰蟲草、人工子座、人工蟲菌復(fù)合體和發(fā)酵菌絲體的核苷類成分進(jìn)行了定性、定量研究，基于HPLC-Q-TOF-MS/MS識別到了 8 種核苷類物質(zhì)，且不同形式的雪峰蟲草核苷類物質(zhì)差異不大[23]，但與蛹蟲草中的蟲草素對比，雪峰蟲草的蟲草素含量極低?？梢娧┓逑x草中的主要活性成分不是蟲草素，可能是蟲草多糖，雪峰蟲草的具體活性成分有待進(jìn)一步明確。

5 藥理作用研究

蟲草的藥理作用廣泛，具有抗腫瘤[61]、抗菌[62]、抗輻射、抗炎[63-65]，抗衰老[66]、調(diào)節(jié)免疫力[67]、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡[68]、治療糖尿病[69]、止痛、抗過敏等生理作用[53]，冬蟲夏草補(bǔ)腎益肺、止血化痰，主要用于腎虛精虧、陽痿遺精、腰膝酸痛、久咳虛喘、勞嗽咯血的治療。而洞口縣當(dāng)?shù)卮蠖鄶?shù)老百姓將雪峰蟲草煎煮、燉服、泡酒服用以提高免疫力，防治肝癌、肺癌等，普遍反映效果顯著，洞口縣老年科技工作者協(xié)會也以雪峰蟲草為原料申請了“治療肝癌的中藥及制備方法”專利(專利號201410205332.3)。

前期研究發(fā)現(xiàn)雪峰蟲草在補(bǔ)腎壯陽、抗疲勞和抑制腫瘤細(xì)胞方面的功效。謝芳一等[70]用野生雪峰蟲草打粉后制成水混懸液，分別用低、中、高劑量灌胃腎陽虛模型大、小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雪峰蟲草 3 個劑量組均能顯著縮短大鼠陰莖勃起時間(勃起潛伏期)、增加大鼠精囊腺+前列腺指數(shù)，具有壯陽作用；能增加小鼠 10 min 內(nèi)自主活動次數(shù)、負(fù)重游泳時間，具有改善腎虛模型小鼠癥狀的作用。中、高劑量組能顯著增加小鼠實驗后體質(zhì)量，具有改善腎虛模型小鼠癥狀的作用。鄭兵等[71]用野生雪峰蟲草粉末的水煎液與DC-CIK細(xì)胞及肝癌Hep G-2共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 0.1 mg/mL 雪峰蟲草水提物對DC-CIK有顯著的促增長作用，但雪峰蟲草沒有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，需通過促進(jìn)DC-CIK的增殖，增加DC-CIK 的數(shù)量而起到增強(qiáng)其對肝癌Hep G-2細(xì)胞的作用，Jin等[60]通過對比試驗發(fā)現(xiàn)野生雪峰蟲草、人工培育的子座和菌絲在體外均有抑制癌細(xì)胞的作用。雪峰蟲草藥理作用的研究為其臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，而其作用機(jī)制及能否用于相關(guān)疾病的臨床治療還有待于今后的進(jìn)一步深入研究。

6 展 望

雪峰蟲草與冬蟲夏草親緣關(guān)系近，其基礎(chǔ)研究的深入，特別是人工培育為冬蟲夏草的人工培育提供了經(jīng)驗和參考，然而雪峰蟲草的研究仍然存在一些問題。首先，巨癤蝙蛾幼蟲人工培育取得了進(jìn)展，但距規(guī)模化生產(chǎn)還有一定的差距，雪峰蟲草全人工培育受限，并帶來一系列問題：①為了避免幼蟲在野外感染雪峰蟲草菌或者其他雜菌，幼蟲需要在無菌環(huán)境飼養(yǎng) 1～2 個月，以排除雪峰蟲草和雜菌感染；②巨癤蝙蛾的采挖費(fèi)時費(fèi)力，采挖成本高達(dá) 10～15 元/條；③采挖期間需要砍大量的大青樹，破壞生態(tài)環(huán)境。而一直以來，蟲草的研究都集中在菌上，對蟲的研究很少，加強(qiáng)對寄主幼蟲的研究，將推動蟲草全人工培育的研究。其次，雪峰蟲草子座容易培養(yǎng)，但是其子實體培養(yǎng)暫未成功，在一定程度上限制了蟲草菌的復(fù)壯和菌種選育。雪峰蟲草子座人工培育 2～3 個月后，在強(qiáng)光條件下，子座頂端表面容易形成螺紋結(jié)構(gòu)，有助于分生孢子的產(chǎn)生，但未能獲得長有子囊殼的子實體。子實體產(chǎn)生可能需要適當(dāng)延長雪峰蟲草的培養(yǎng)時間，探索適宜的環(huán)境條件，也有可能因為單一交配型的菌種難以獲得子實體[47,72]。雪峰蟲草子實體的誘發(fā)及生長條件需要進(jìn)一步探索，其形成的分子機(jī)制有待深入研究。再次，雪峰蟲草是近年來發(fā)現(xiàn)的新種，與冬蟲夏草同為Ophiocordycipitaceae 科Ophiocordyceps屬真菌。通過基因序列比對和分子發(fā)育系統(tǒng)學(xué)分析，雪峰蟲草與冬蟲夏草親緣關(guān)系非常接近[11]，雪峰蟲草生長環(huán)境溫和，對氣候要求不嚴(yán)格，其寄主巨癤蝙蛾幼蟲蟲體較大，分布區(qū)域廣泛，適應(yīng)生態(tài)幅大，均易實現(xiàn)人工培育，且研究發(fā)現(xiàn)雪峰蟲草有與其他蟲草相似的活性物質(zhì)和藥理作用。雪峰蟲草是值得研究的新型蟲草種質(zhì)資源，加強(qiáng)雪峰蟲草人工培育，能填補(bǔ)我國蟲草需求的巨大缺口。其人工培育已取得突破性進(jìn)展，但其藥理毒理研究相對滯后。因此，完善物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用方面的基礎(chǔ)研究，為蟲草的臨床應(yīng)用等提供參考和依據(jù)。