吳慧昊，牛 鋒，徐紅偉，鐘 琦

(1.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.湖北省當(dāng)陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北 當(dāng)陽(yáng) 444100)

血脂是血漿中三酰甘油、膽固醇等中性脂肪和磷脂、糖脂、固醇、類固醇等類脂的總稱[1]。三酰甘油(Triglyceride，TG)是長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人體內(nèi)含量最多的脂類，大部分組織均可以利用三酰甘油分解產(chǎn)物供給能量。三酰甘油來(lái)自食物中脂肪的分解，肝臟也能將血液中的某些糖類轉(zhuǎn)化為三酰甘油。如果三酰甘油過(guò)量，囤積于皮下會(huì)使身體肥胖，囤積于血管壁則造成動(dòng)脈硬化，囤積于心臟可引起冠心病、心梗；在大腦，可發(fā)生腦卒中、中風(fēng)；發(fā)生在眼底，會(huì)導(dǎo)致視力下降、失明；如在腎臟，可引起腎衰；發(fā)生在下肢，則出現(xiàn)肢體血流不暢導(dǎo)致壞死[2-3]。此外，三酰甘油高的危害還包括引發(fā)高血壓、膽結(jié)石、胰腺炎；還能夠加重肝炎、致使男性性功能障礙、導(dǎo)致老年癡呆等。目前我國(guó)有近1/3的成年人血脂偏高，高脂血癥已成為人類健康的第一隱形殺手。膽固醇(Cholesterol)在人體內(nèi)有著廣泛的生理作用，但當(dāng)其過(guò)量時(shí)便會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響[4-6]。現(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性[7-8]。隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，減肥降脂迫在眉睫。因此，開(kāi)發(fā)和利用具有減肥降脂作用，且無(wú)毒無(wú)害的保健藥品，對(duì)保護(hù)人體健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。有關(guān)乳酸菌在降膽固醇、降三酰甘油方面的研究，國(guó)內(nèi)外有大量的文獻(xiàn)報(bào)道和專利成果。如專利CN101864375A植物乳桿菌(C88)、CN102604851A乳酸乳球菌、CN101559082A乳桿菌(MA2)、CN101724589A乳酸菌、CN1186855A屎鏈球菌(DM891129)及鼠李糖乳桿菌(grx10)，但酵母菌在降膽固醇方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，在降三酰甘油方面未見(jiàn)報(bào)道[9-13]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自蘭州黃河啤酒釀造渣，取得樣品后，貯存于無(wú)菌容器，低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，立即分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥?zhǔn)瞎?液體培養(yǎng)基，油脂培養(yǎng)基，配方參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。高膽固醇MeclaryO-CHOL培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱量膽固醇0.1 g放入小燒杯中，加入0.2 g牛膽鹽、0.1 g蔗糖酯、1 mL吐溫-80攪拌均勻，再移取5 mL冰乙酸加熱溶解，把溶解液用超聲波處理15 min后，快速加入到配制好的麥?zhǔn)弦后w培養(yǎng)基中，邊加入邊攪拌，使其形成均勻穩(wěn)定的膠體溶液。

1.1.3 試劑與儀器 硫磷鐵顯色劑(三氯化鐵溶液)的配制：稱取5.0 g FeCl3·6H2O溶于200 mL濃磷酸中；磷硫鐵試劑(P-S-Fe試劑)：取40 mL三氯化鐵溶液用濃硫酸定容至500 mL。MLS-3750 全自動(dòng)高壓滅菌器(JAPAN SANYO)，TU-1900 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，GL-21M 高速冷凍離心機(jī)(賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，BX51T-32P01 數(shù)碼光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CORPORATION.JAPAN)，PB-10 pH儀(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，1285 生物安全柜(Thermo Electron Corporation)，HH.B11.600-BS-II 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離、純化 稱取0.5 g啤酒渣樣品，加入到裝有4.5 mL無(wú)菌水試管中，逐次稀釋至10-6，取10-4、10-5、10-6三管稀釋液各0.1 mL，采用涂布法，涂布于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上進(jìn)行分離，35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取菌落，連續(xù)劃線分離純化，最后選擇單菌落，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種后，接種到斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株產(chǎn)脂肪酶效果測(cè)定 將分離純化后的菌株在油脂培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)48 h，觀察劃線部分菌落周圍顏色是否變紅，若變紅，則證明菌株可以產(chǎn)脂肪酶分解油脂。

1.2.3 菌株降蛋黃中膽固醇的效果 無(wú)菌條件下，于滅菌的培養(yǎng)基中加入一定量雞蛋黃作為膽固醇源，無(wú)菌均勻分裝到試管中。以2%(菌體濃度為108cfu/mL)的接種量加入菌液，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液按照磷硫鐵比色法，測(cè)定上清液中膽固醇含量[15]。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)定5個(gè)重復(fù)。膽固醇降低率計(jì)算公式：

膽固醇降低率(%)=((C-A)/C)×100%

A：菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在560 nm處的OD值，C：對(duì)照在560 nm處的OD值。

1.2.4 菌株降高純度膽固醇的效果 將菌株以2%(菌體濃度為108cfu/mL)的接種量接種于高膽固醇MeclaryO-CHOL培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液按照磷硫鐵比色法，測(cè)定上清液中膽固醇含量。以未接種的高膽固醇MeclaryO-CHOL培養(yǎng)基作對(duì)照，計(jì)算方法同1.2.3。

1.2.5 菌株對(duì)三酰甘油的降解效果 無(wú)菌條件下，于滅菌培養(yǎng)基中加入一定量的三酰甘油標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)菌分裝到試管中。以2%(菌體濃度為108cfu/mL)接種量加入菌液(未接菌的試管作為空白對(duì)照)，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，于420 nm處測(cè)定三酰甘油降解率[16]。

三酰甘油降低率(%)=((C-A)/C)×100%

A：菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在420 nm處的OD值，C：空白對(duì)照在420 nm處的OD值。

1.2.6 菌株耐酸性能測(cè)定 將菌株活化后制成菌懸液，采用稀釋涂板法測(cè)定菌株的濃度。將活化菌株分別接種于pH 6.8、3.0、2.0的麥?zhǔn)弦后w培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)10 h，利用梯度稀釋平板法測(cè)定活菌數(shù)，做5個(gè)平行求平均值。以菌株名稱為橫坐標(biāo)，單位菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪圖。

1.2.7 菌株對(duì)0.3%膽鹽環(huán)境的耐受力測(cè)定 將菌株活化后制成菌懸液(菌體濃度為108cfu/mL)，按2%的接種量分別接種于含0.0%牛膽鹽(即空白)、0.3%牛膽鹽的復(fù)合液體培養(yǎng)基中。35 ℃培養(yǎng)24 h后，分別測(cè)定其OD值，做5個(gè)平行求平均值，按下述公式計(jì)算菌株對(duì)膽鹽的耐受力。

膽鹽耐受力(%)= (含膽鹽培養(yǎng)基的OD/空白培養(yǎng)基的OD)×100%

1.2.8 小鼠體內(nèi)毒性試驗(yàn) 將20只SPF級(jí)昆明雌性小白鼠(8周齡)，隨機(jī)分成2組，A組灌胃生理鹽水，B組灌胃解脂亞羅酵母菌懸液。A組小鼠每只每天灌胃生理鹽水0.5 mL，B組小鼠每只每天灌胃含1×108個(gè)酵母菌的懸浮液0.5 mL。為了保證菌體溶液中一定的活菌數(shù)，每次灌胃都采用新鮮處理的菌株。自由進(jìn)水，每周記錄體重。在給藥42 d后，處死解剖，將心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟取出用生理鹽水沖洗并擦拭干凈后稱重，進(jìn)行器官指數(shù)的測(cè)定[17]。此外，觀察器官是否發(fā)生病變。

器官指數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100%

1.2.9 菌株生理生化及分子鑒定 分離菌株主要通過(guò)繁殖方式觀察、碳源同化試驗(yàn)、氮源同化試驗(yàn)、產(chǎn)酸試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性檢查等生理生化特征進(jìn)行鑒定。采用26S rDNA法對(duì)所分離純化的菌株進(jìn)行分子鑒定。26S rDNA擴(kuò)增及序列測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[18]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)產(chǎn)物測(cè)序由寶生物工程(大連)有限公司完成。測(cè)序完成提交菌株EAM-ZT003T的26S rDNA序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，選取與之相似性最高的10株菌的26S rDNA序列，進(jìn)行Clustal X比對(duì)，MEGA軟件分析，采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap 1 000 次進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及純化結(jié)果

分離純化菌株菌落為乳白色，直徑約2 mm，邊緣整齊，容易挑起，鏡檢形態(tài)為卵圓形，出芽生殖，革蘭染色陽(yáng)性，大小為(1.5～3)μm×(4～5.5)μm。將該菌株命名為EAM-ZT003T(圖1、圖2)。

圖1 酵母菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of yeast strains

圖2 菌株EAM-ZT003T革蘭染色結(jié)果Fig.2 Gram′s staining results of EAM-ZT003T

2.2 菌株EAM-ZT003T產(chǎn)脂肪酶效果測(cè)定

將分離純化后的菌株EAM-ZT003T在油脂培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)劃線菌株生長(zhǎng)區(qū)域培養(yǎng)基顏色由最初的淡黃色變?yōu)榧t色，由此說(shuō)明菌株EAM-ZT003T可以產(chǎn)脂肪酶分解油脂(圖3)，活化菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 菌株EAM-ZT003T降蛋黃中膽固醇和高純度膽固醇的效果

由圖4可以看出，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合后相關(guān)性很好(R2=0.998 9)，可用于待測(cè)菌株的降膽固醇能力評(píng)價(jià)。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得菌株EAM-ZT003T降蛋黃中膽固醇能力為 32.8%，降高純度膽固醇能力為12%(圖5)。

圖3 菌株EAM-ZT003T在油脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況Fig.3 The growth of the strain EAM-ZT003T on the fat medium

圖4 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of cholesterol

圖5 菌株EAM-ZT003T降膽固醇效果Fig.5 Strains by Cholesterol-lowering ability

2.4 菌株EAM-ZT003T對(duì)三酰甘油的降解

三酰甘油(TG)是人體內(nèi)含量最多的脂類，三酰甘油高的危害最直接體現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化上。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得菌株EAM-ZT003T對(duì)高純度三酰甘油具有非常高的降解能力，其三酰甘油降解率為80.2%，而ZC001、ZC002為實(shí)驗(yàn)室保存的具有降解三酰甘油效果的酵母菌，由圖6可知，菌株EAM-ZT003T對(duì)三酰甘油降解效果顯著高于菌株ZC001、ZC002。

圖6 菌株EAM-ZT003T對(duì)三酰甘油的降解能力Fig.6 Strains by Triglyceride-lowering ability

2.5 菌株EAM-ZT003T耐酸結(jié)果

菌株應(yīng)用于食品或藥品制備，必須具有較好的耐酸性和在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育的特性，才能在胃和小腸前段存活。菌株EAM-ZT003T在pH 6.8(正常培養(yǎng)基pH值)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h，菌株活菌數(shù)為107cfu/mL，在pH 3.0的條件下活菌數(shù)也可達(dá)107cfu/mL，在pH 2.0時(shí)，培養(yǎng)10 h，菌株的存活率有所下降，但仍能達(dá)到105cfu/mL(圖7)。耐酸實(shí)驗(yàn)表明，菌株EAM-ZT003T具有較強(qiáng)的耐酸性，對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)性都比較好，若進(jìn)入人體腸道后，還能存活較多，不會(huì)影響降膽固醇降三酰甘油活性。

圖7 菌株EAM-ZT003T耐酸試驗(yàn)Fig.7 Effects of different acidity on the growth of strains

2.6 菌株EAM-ZT003T對(duì)0.3%膽鹽環(huán)境耐受力

當(dāng)菌株進(jìn)入口腔，經(jīng)過(guò)胃和小腸，最終到達(dá)小腸末端，人體小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)，因此要求益生菌株不僅能耐受一定的酸度還能有一定的膽鹽耐受力。實(shí)驗(yàn)選取人體小腸中膽鹽最大濃度進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得菌株EAM-ZT003T在含0.3%牛膽鹽的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，膽鹽耐受能力為91.7%；菌株ZC001、ZC002膽鹽耐受力分別為78.0%、42.7%，由圖8可知，菌株EAM-ZT003T膽鹽耐受力強(qiáng)于菌株ZC001、ZC002，具有很強(qiáng)的耐膽鹽能力。

圖8 膽鹽耐受試驗(yàn)Fig.8 Tolerance of the strains to bile salts

2.7 毒性試驗(yàn)結(jié)果

毒性試驗(yàn)各組小鼠毛色光潔，食欲正常，灌胃42 d未出現(xiàn)異常體征，未發(fā)現(xiàn)異常死亡，小鼠體重增長(zhǎng)前14 d較快，14 d后趨于平穩(wěn)，但試驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)消瘦、異常死亡現(xiàn)象(圖9)。小鼠解剖后內(nèi)臟正常，顏色紅潤(rùn)、光滑，小鼠器官無(wú)氣質(zhì)性改變，喂菌小鼠與對(duì)照組小鼠器官指數(shù)差異不顯著(P<0.05)，說(shuō)明不同實(shí)驗(yàn)處理對(duì)小鼠肝臟、腎臟、心臟、脾臟和肺臟并未產(chǎn)生影響(見(jiàn)表1)。結(jié)果表明飼喂菌株EAM-ZT003T對(duì)小鼠沒(méi)有毒副作用。

圖9 毒性試驗(yàn)小鼠體重變化Fig.9 The body weight of mice

表1 毒性試驗(yàn)小鼠器官指數(shù)比較Table 1 he viscera indices of mice

2.8 菌株EAM-ZT003T生理生化及分子鑒定結(jié)果

菌株經(jīng)半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌株沿穿刺線生長(zhǎng)，邊緣清晰，無(wú)運(yùn)動(dòng)性。菌株不能液化明膠，不還原硝酸鹽，具體生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 菌株EAM-ZT003T生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological identification results

續(xù)表2

注：“+”代表陽(yáng)性反應(yīng)；“-”代表陰性反應(yīng)

2.9 菌株EAM-ZT003T分子鑒定結(jié)果

測(cè)序完成提交菌株EAM-ZT003T的26S rDNA序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株EAM-ZT003T的基因序列，在所有相似的序列中，與解脂亞羅酵母菌株(Yarrowialipolytica)的同源性為 100%，使用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖10)。結(jié)果顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上菌株EAM-ZT003T與YarrowialipolyticaNRRL YB-423在發(fā)育樹(shù)上聚為一簇，具有較近的進(jìn)化距離。因此結(jié)合生理生化特征，將分離的菌株EAM-ZT003T鑒定為解脂亞羅酵母菌，命名為Y.lipolyticaZT003T。

圖10 依據(jù)26S rDNA序列構(gòu)建的菌株EAM-ZT003T與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.10 Phylogenetic tree of strain EAM-ZT003T and related strains based on 26S rDNA

3 討 論

本研究從啤酒渣中分離純化出1株酵母菌，經(jīng)生理生化及26S rDNA鑒定為解脂亞羅酵母菌(Y.lipolytica)。該菌株具有極好的降膽固醇(TC)、降三酰甘油(TG)的功效，尤其降三酰甘油(TG)能力高達(dá)80.2%，如此高的降三酰甘油能力在中外文獻(xiàn)中還未見(jiàn)報(bào)道，有關(guān)菌株在降膽固醇降三酰甘油方面的研究，基本集中于乳酸菌的研究，而酵母菌在此方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

菌株要在宿主胃腸道中生存并發(fā)揮作用必須具備抗酸和耐膽鹽的能力[19]。胃中的酸環(huán)境隨飲食結(jié)構(gòu)不同而發(fā)生較大的變化[20]。一般來(lái)說(shuō)，空腹時(shí)胃液的pH為0.9～1.8，進(jìn)食過(guò)程中pH為1.8～5.0，通常維持在3.0左右[21]。一般認(rèn)為，菌株能在pH 3.0的條件下存活 2 h并能耐受0.1%膽鹽的益生菌就能順利通過(guò)胃和上段腸管而到達(dá)下段腸管放大其生物學(xué)功效[22]。菌株EAM-ZT003T具有非常好的耐酸、耐膽鹽性能，進(jìn)入人體胃腸道后，有較多的活菌存在，可確保菌株的降膽固醇降三酰甘油活性，經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株無(wú)毒副反應(yīng)。因此，菌株EAM-ZT003T可用于新型降脂降膽固醇保健藥品及功能食品的制備。菌株降脂降膽固醇作用機(jī)制，具體是由菌株自體吸收，還是產(chǎn)生相關(guān)酶類分解脂類物質(zhì)，或是通過(guò)調(diào)節(jié)脂類在肝臟和腸道的關(guān)鍵機(jī)制來(lái)調(diào)控脂類物質(zhì)的合成吸收和代謝[23-26]，以及菌株的動(dòng)物體內(nèi)降脂試驗(yàn)將在后期研究中完成。