7種海參提取物酶法制備及其抗氧化活性研究

楊 坤 趙謀明 孫為正 趙強(qiáng)忠 林戀竹

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州 510640）

海參屬棘皮動(dòng)物門、海參綱[1]，是海洋中最常見(jiàn)的無(wú)脊椎動(dòng)物。據(jù)報(bào)道，全世界已發(fā)現(xiàn)的海參大約有1 100種，其中40種可供食用；我國(guó)總計(jì)約有100種，其中約20種可供食用[2]。新鮮海參體內(nèi)含有活性很強(qiáng)的自溶酶[3]，在受到外界物理因素、化學(xué)因素和生理因素等刺激后，原本正常的生命活動(dòng)出現(xiàn)紊亂，會(huì)發(fā)生吐腸和體壁軟化的現(xiàn)象[4]，在捕獲后需快速進(jìn)行干制處理。市場(chǎng)上流通量最大的海參制品為干制海參，約占到市場(chǎng)上海參制品量的90%[5]。

海參具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)[6]。海參中豐富的蛋白、多糖和皂甙，是其發(fā)揮抗衰老、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力和降血脂等多種生理功效的主要活性物質(zhì)[7]。其中，膠原蛋白是海參中含量最多的活性物質(zhì)，占海參蛋白的70%以上[8]。中國(guó)產(chǎn)刺參膠原蛋白中甘氨酸和羥脯氨酸含量較多，酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸含量較低，與人Ⅰ型膠原蛋白的氨基酸組成相近，生物利用度較高[9-12]。海參多糖是海參體壁中含量?jī)H次于蛋白質(zhì)的另一重要成分，其分為兩種：一種為硫酸軟骨素，為分支雜多糖，另一種是巖藻聚糖，為直鏈多糖。二者均有較高含量的硫酸酯質(zhì)，約占其總質(zhì)量的30%[13-16]。

本文在前人研究的基礎(chǔ)上，以小北極海參、大北極海參、葉瓜參、花刺參、土耳其長(zhǎng)崎參、大連大烏參、澳洲參為研究對(duì)象，采用3種蛋白酶——復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶分別水解4，8，12 h，制備得到海參提取物，采用還原力、羥自由基清除能力、氧自由基吸收能力評(píng)價(jià)法對(duì)比研究其抗氧化活性，為以海參提取物為核心配料的功能性食品的加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 原料

小北極海參、大北極海參、葉瓜參、花刺參、土耳其參、大連大烏參、澳洲參，采購(gòu)自廣州市一德路干貨批發(fā)市場(chǎng)，置于陰涼干燥處備用。

1.2 試劑

復(fù)合蛋白酶（酶活為46 000 U/g），風(fēng)味蛋白酶（酶活為40 000 U/g），購(gòu)于丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶（酶活為56 000 U/g），購(gòu)于廣州裕立寶生物科技公司；AAPH，熒光素，trolox，純度為 99%，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；其它試劑均為分析純，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 設(shè)備

絞肉機(jī)（MM12），廣東省韶關(guān)市食品機(jī)械廠；pH計(jì)（PHS-2F），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；阿貝折光儀（E-line），香港德祥科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HH-S1），金壇華特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；分析天平（AL204），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；烘箱（101-3A），上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Varioskan Flash），美國(guó)Thermo公司；紫外分光光度計(jì)（UV-721），上海精密科學(xué)儀器儀表有限公司；恒溫振蕩器（THZ-82A），常州澳華儀器有限公司；離心機(jī)（ST-16R），美國(guó)Thermo公司；自動(dòng)定氮儀（KND-103F），上海纖檢儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 海參提取物酶法制備工藝研究 分別取干海參各 200 g，按料液比 1∶20（m/m）加入去離子水，15℃泡發(fā)48 h，冷水漂洗2次，瀝干多余的水分，稱重后，計(jì)算泡發(fā)增重倍數(shù)，然后使用絞肉機(jī)絞碎海參，成肉糜狀，分別取海參肉糜各15 g，按料液比為1∶2（m/m）加入去離子水，分別加入肉糜質(zhì)量0.1%的酶（復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶），分別于55℃酶解4，8和12 h，95℃加熱15 min，4 000 g離心 20 min，取上清液，得海參提取物?？疾旌⒎N類、酶的種類、酶解時(shí)間對(duì)海參提取物得率、蛋白回收率以及抗氧化活性的影響。

1.4.2 泡發(fā)增重倍數(shù)測(cè)定 取m1質(zhì)量的干海參進(jìn)行泡發(fā)，泡發(fā)完成后瀝干水分計(jì)重，質(zhì)量為m2。

1.4.3 海參提取物得率的測(cè)定 取m3質(zhì)量的海參肉糜進(jìn)行酶解，海參提取物計(jì)重m4，使用阿貝折光儀測(cè)定提取物中固形物含量（b）。

1.4.4 蛋白回收率的測(cè)定[17]采用凱氏定氮法（GB/T5009.5-2003）測(cè)定提取物中總氮量。

式中：N1——海參提取物總氮量，g；N2——原料總氮量，g。

1.4.5 海參提取物的還原力評(píng)價(jià)[18]取2 mL樣品，依次加入2 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2 mL 1%（w/v）的鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃保溫 20 min后，加入 2 mL 10%（w/v）的 TCA，混勻，4 000 g離心 10 min，取上清液 2 mL，依次加入2 mL蒸餾水以及 0.4 mL 0.1%（w/v）氯化鐵溶液，混勻，室溫反應(yīng)10 min后，測(cè)定其在700 nm 處的吸光度值。將trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品，trolox濃度與其吸光度值呈線性關(guān)系，換算得到樣品的還原力值，即達(dá)到每克干海參的還原力所需trolox的量（μmol trolox當(dāng)量/g干海參），還原力值越大，樣品的還原力越強(qiáng)。

1.4.6 海參提取物的羥基自由基清除能力評(píng)價(jià)[19-20]羥基自由基（OH）清除力的測(cè)定選用鄰二氮菲法。樣品管：取0.6 mL樣品溶液，加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4），混勻，依次加入0.6 mL鄰二氮菲溶液（5 mmol/L）及0.6 mL EDTA（15 mmol/L），混勻后，加入 0.6 mL FeSO4溶液（5 mmol/L），充分混勻后加入0.8 mL 0.1%（V/V）H2O2。搖勻后于37℃保溫1 h，測(cè)定其在536 nm 處吸光值 A536（樣品）；損傷管：以去離子水代替樣品，其余步驟同樣品管，所測(cè)吸光值為 A536（損傷）；未損傷管：以去離子水代替H2O2，其余步驟同損傷管，所測(cè)吸光值為 A536（未損傷）。

將trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品，trolox濃度與其OH清除率呈線性關(guān)系，換算得到樣品的OH值，即達(dá)到每克干海參的OH清除能力所需Torlox的量（μmol trolox當(dāng)量/g干海參），OH值越大，樣品的OH清除能力越強(qiáng)。

1.4.7 海參提取物的氧自由基吸收能力（ORAC）評(píng)價(jià)[21]在96孔熒光板各微孔中分別加入20 μL待測(cè)樣品或磷酸鹽緩沖液（75mmol/L，pH7.4），添加70 nmol/L熒光素120 μL，在37℃下保溫 15 min后，用多道移液器迅速在各孔中加入60 μL 12 mmol/L AAPH啟動(dòng)反應(yīng)，并將微孔板置于酶標(biāo)儀中，保持反應(yīng)體系溫度恒定為37℃，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，開(kāi)始計(jì)時(shí)反應(yīng)并讀數(shù)（f0），每 1 min測(cè)定 1次，共讀 121次數(shù)（共計(jì)反應(yīng)120 min），將每次讀數(shù)連成曲線。Q表示曲線下的面積。

Q=0.5（f0+fn）+（f1+f2+…+fi+…+fn-1）

L=Q樣品-Q空白

將trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品，trolox濃度與其L呈線性關(guān)系，換算得到樣品的ORAC值，即達(dá)到每克干海參的氧自由基吸收能力所需Torlox的量（μmol trolox當(dāng)量/g干海參）。

1.4.8 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件中的ANOVA方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式來(lái)表示。聚類分析采用SPSS 17.0軟件中的系統(tǒng)聚類的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 7種海參蛋白含量及泡發(fā)增重倍數(shù)

7種海參蛋白含量及泡發(fā)增重倍數(shù)如表1所示。

表1 7種海參蛋白含量及泡發(fā)增重倍數(shù)Table 1 Protein contents and soaked mulriples of seven kinds of sea cucumbers

試驗(yàn)結(jié)果表明：7種干海參經(jīng)冷水泡發(fā)后，土耳其參增重倍數(shù)最高（3.24）。大連大烏參蛋白含量最高，達(dá)到60.62%。海參中最重要且含量最高的營(yíng)養(yǎng)成分是蛋白質(zhì)，由于干海參制作時(shí)會(huì)添加大量的鹽，致使干海參中蛋白含量有所降低。不同等級(jí)、種類海參在鹽干時(shí)，加入的鹽含量不同，因此，不同干海參蛋白含量差異較大。

2.2 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物得率、蛋白回收率的影響

2.2.1 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物得率的影響 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物得率的影響如圖1所示。

圖1 酶解4，8，12 h不同酶對(duì)海參提取物得率的影響Fig.1 Effect of different enzymes on the sea cucumber extract yields in enzymolysis for 4，8，12 h

試驗(yàn)結(jié)果表明：3種酶酶解海參4 h時(shí)，7種海參提取物得率為17.68%～55.57%。采用復(fù)合蛋白酶酶解大連大烏參，其提取物得率最高，達(dá)到55.57%。對(duì)于7種海參，以土耳其參、小北極海參提取物得率較高，分別為38.3%～52.9%和38.17%～42.53%。對(duì)于3種蛋白酶，采用復(fù)合蛋白酶酶解7種海參，所得海參提取物得率最高。此外，采用木瓜蛋白酶酶解大連大烏參、葉瓜參、花刺參和大北極海參時(shí)，所得海參提取物得率顯著高于采用風(fēng)味蛋白酶酶解這4種海參所得海參提取物得率（P<0.05）。然而，采用木瓜蛋白酶酶解土耳其參、澳洲海參和小北極海參時(shí)，所得海參提取物得率與采用風(fēng)味蛋白酶酶解這3種海參所得海參提取物得率沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)采用3種酶酶解海參8 h時(shí)，7種海參提取物得率為22.17%～57.76%，相對(duì)于酶解4 h時(shí)海參提取物得率有一定程度的提高，但提高幅度不大。3種酶酶解海參12 h時(shí)，7種海參提取物得率介于21.57%～61.64%之間，相對(duì)于酶解4，8 h時(shí)海參提取物得率有一定程度的提高。

2.2.2不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參蛋白回收率的影響 蛋白質(zhì)是海參中含量最高的營(yíng)養(yǎng)成分。因此，蛋白肽是海參提取物中最主要的成分，對(duì)海參提取物的活性有重要的貢獻(xiàn)。不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參蛋白回收率的影響如圖2所示。

圖2 酶解4，8，12 h時(shí)7種海參蛋白回收率Fig.2 Protein recovery rates of 7 kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4，8，12 h

試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及風(fēng)味蛋白酶酶解不同海參4 h時(shí)，7種海參的蛋白回收率為22.89%～96.48%。其中，采用復(fù)合蛋白酶酶解大北極海參時(shí)，蛋白回收率最高，達(dá)到96.48%。對(duì)于3種蛋白酶，采用復(fù)合蛋白酶酶解7種海參時(shí)，蛋白回收率最高，木瓜蛋白酶次之，而采用風(fēng)味蛋白酶酶解7種海參時(shí)，蛋白回收率最低。

當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至8 h時(shí)，7種海參的蛋白回收率為29.18%～97.56%。采用復(fù)合蛋白酶酶解7種海參時(shí)，蛋白回收率最高，其中以大北極海參酶解產(chǎn)物蛋白回收率為最高，木瓜蛋白酶次之，風(fēng)味蛋白酶最低。采用3種不同酶酶解小北極海參時(shí)，蛋白回收率沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí)，7種海參的蛋白回收率為28.56%～98.40%。采用復(fù)合蛋白酶酶解大北極海參時(shí)，蛋白回收率最高。3種蛋白酶酶解效率從高到低依次是：復(fù)合蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶。采用3種不同酶酶解小北極海參時(shí)，蛋白回收率沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.3 7種海參提取物得率、蛋白回收率聚類分析 以海參提取物得率和蛋白回收率為指標(biāo)，對(duì)不同酶解條件下所制得的63種海參提取物進(jìn)行了聚類分析，一共分為5類，結(jié)果表明：（1）土耳其海參、大連大烏參、澳洲海參、葉瓜參和大北極海參提取物得率及蛋白回收率高，較易酶解；（2）使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物得率和蛋白回收率最高，其次是木瓜蛋白酶，最次是風(fēng)味蛋白酶；（3）使用復(fù)合蛋白酶酶解澳洲海參和葉瓜參時(shí)，增加酶解時(shí)間有利于蛋白肽的提取。對(duì)于土耳其海參、大連大烏參和大北極海參，使用復(fù)合蛋白酶酶解時(shí)，增加酶解時(shí)間不會(huì)顯著提高其提取物得率與蛋白回收率；（4）對(duì)于土耳其參、大連大烏參、澳洲海參和花刺參，使用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解時(shí)，增加酶解時(shí)間有利于蛋白肽的提取。而對(duì)于葉瓜參、小北極海參和大北極海參，增加酶解時(shí)間不會(huì)顯著提高其提取物得率和蛋白回收率；（5）對(duì)于葉瓜參和大北極海參，增加酶解時(shí)間有利于蛋白肽的提取。而對(duì)于土耳其參、大連大烏參、澳洲海參、花刺參和小北極海參，使用風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，延長(zhǎng)酶解時(shí)間不會(huì)顯著提高其提取物得率和蛋白回收率。

2.3 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物抗氧化活性的影響

2.3.1 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物還原力的影響 7種海參的還原力值如圖3所示。不同海參經(jīng)3種蛋白酶解，所得提取物的還原力值具有顯著性差異（P＜0.05）?？偟恼f(shuō)來(lái)，土耳其參、大連大烏參和澳洲海參提取物的還原力值相對(duì)較高，其余種海參提取物還原力值較低。

圖3 酶解4，8，12 h時(shí)7種海參提取物的還原力值Fig.3 Reducing power values of 7 kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4，8，12 h

具體說(shuō)來(lái)，當(dāng)采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及風(fēng)味蛋白酶酶解不同海參4 h時(shí)，7種海參提取物的還原力值為3.34～13.86 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，其中，風(fēng)味蛋白酶酶解澳洲海參所得提取物的還原力值最高，達(dá)到13.86 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至8 h時(shí)，7種海參提取物的還原力值為2.91～13.47 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，其中，風(fēng)味蛋白酶酶解土耳其海參所得提取物的還原力值最高，達(dá)到13.47 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí)，7種海參提取物的還原力值為4.21～15.98 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，其中，風(fēng)味蛋白酶酶解澳洲海參所得提取物的還原力值最高，達(dá)到15.98 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。

2.3.2 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物羥自由基清除能力的影響 7種海參提取物的OH值如圖4所示。不同海參經(jīng)3種蛋白酶解，所得提取物的OH值具有顯著性差異（P<0.05）?？傮w來(lái)說(shuō)，葉瓜參提取物的OH值最高，明顯高于其他6種海參提取物。土耳其參、大連大烏參和澳洲海參提取物的OH值相對(duì)較低。

具體來(lái)說(shuō)：采用3種酶酶解4 h時(shí)，7種海參提取物的OH值為17.39～99.06 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，其中，木瓜蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物OH值最高，達(dá)到99.06 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至8 h時(shí)，7種海參提取物的OH值為25.42～128.8 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，其中，風(fēng)味蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物OH值最高，達(dá)到128.8 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí)，OH值變化范圍為27.29～148.43 μmol trolox 當(dāng)量/g 干海參，其中，風(fēng)味蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物OH值最高，達(dá)到148.43 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。結(jié)果顯示，延長(zhǎng)酶解時(shí)間有利于海參提取物羥自由基清除能力的提高。

2.3.3 不同酶、酶解時(shí)間對(duì)7種海參提取物氧自由基吸收能力的影響

圖4 酶解4，8，12 h時(shí)7種海參提取物的OH值Fig.4 OH values of seven kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4，8，12 h

7種海參提取物的ORAC值如圖5所示。不同海參經(jīng)3種蛋白酶解，所得提取物的ORAC值具有顯著性差異（P<0.05）。與其它海參提取物相比，花刺參提取物的ORAC值較低。采用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物的氧自由基吸收能力最強(qiáng)，其次是木瓜蛋白酶，再次是風(fēng)味蛋白酶。

圖5 酶解4，8，12 h時(shí)7種海參提取物的ORAC值Fig.5 ORAC values of 7 kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4，8，12 h

結(jié)果顯示：當(dāng)采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及風(fēng)味蛋白酶酶解不同海參4 h時(shí)，7種海參提取物的 ORAC值為 15.4～99.93 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，其中復(fù)合蛋白酶酶解土耳其參所得提取物ORAC值最高，達(dá)到99.93 μmol Trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至8 h時(shí)，7種海參提取物的ORAC值為24.2～133.08 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，相對(duì)于酶解4 h所得海參提取物的ORAC值有顯著提高（P<0.05），其中，復(fù)合蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物ORAC值最高，達(dá)到133.08 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí)，7種海參提取物的ORAC值為19.99～110.2 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，相對(duì)于酶解8 h所得海參提取物的ORAC值有顯著降低（P<0.05），其中，復(fù)合蛋白酶酶解土耳其參所得提取物ORAC值最高，達(dá)到110.2 μmol trolox當(dāng)量/g干海參。因此，適當(dāng)延長(zhǎng)酶解時(shí)間有利于海參提取物氧自由基吸收能力的提高，但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)降低海參提取物氧自由基吸收能力。

2.3.4 7種海參提取物抗氧化活性聚類分析 以還原力值、ORAC值、OH值為指標(biāo)，對(duì)不同酶解條件下所制得的63種海參提取物進(jìn)行了聚類分析，可以分為7類。結(jié)果顯示：（1）葉瓜參提取物的抗氧化能力最強(qiáng)，小北極海參提取物次之，其余海參較差；（2）使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物抗氧化活性最高，其次是木瓜蛋白酶，最次是風(fēng)味蛋白酶；（3）隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，葉瓜參、花刺參、大/小北極海參提取物的抗氧化活性均有所提高；而土耳其海參、大連大烏參和澳洲海參提取物的抗氧化活性隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)變化不大。

3 結(jié)論

本文以7種常見(jiàn)的低值可食用海參為研究對(duì)象，采用3種蛋白酶：復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶，分別水解4，8，12 h，制備得到海參提取物，評(píng)價(jià)其抗氧化活性，結(jié)果表明：

（1）使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物得率、蛋白回收率最高，其次是木瓜蛋白酶，最次是風(fēng)味蛋白酶；7種海參提取物得率為41.24%～55.57%，蛋白回收率為65.06%～98.4%。

（2）使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物抗氧化活性最強(qiáng)，其次是木瓜蛋白酶，最次是風(fēng)味蛋白酶；7種海參提取物還原力值為3.41～8.34 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，OH值為 28.83～96.65 μmol trolox當(dāng)量/g干海參，ORAC值為 38.99～133.08 μmol trolox當(dāng)量/g干海參；葉瓜參提取物的抗氧化活性最強(qiáng)，小北極海參提取物次之，其余海參提取物較差。

（3）土耳其海參、大連大烏參、澳洲海參、葉瓜參和大北極海參提取物得率及蛋白回收率高，較易酶解；葉瓜參提取物的抗氧化活性最強(qiáng)，可作為具有強(qiáng)抗氧化活性的食品配料應(yīng)用于功能性食品。