間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法檢測花生中黃曲霉毒素B1

潘明飛 李詩潔 郭丹丹 王俊平 王 碩

（教育部食品安全與營養(yǎng)重點實驗室 天津科技大學(xué) 天津 300457）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是一種典型的真菌毒素，是主要由黃曲霉和寄生曲霉菌產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物[1-2]。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒性差異，主要分為 B1、G1、G2、M1、M25 種，均為二氫呋喃香豆素的衍生物[3]。AF廣泛存在于黃曲霉污染的花生、玉米、大米等農(nóng)作物產(chǎn)品及其制品中，其中糧食食品中主要以B1，G1，G2為主，牛乳及其制品中主要是M1、M2。AFB1的毒性最強，有相當(dāng)強的致畸、致癌、致突變作用[4-5]。其毒性可達到氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，三聚氰胺的416倍。AFB1可通過誘導(dǎo)人類p53腫瘤抑制基因的249位密碼子突變，從而引發(fā)肝癌等惡性疾病[6-7]。據(jù)報道，在亞非地區(qū)，肝癌發(fā)病率直接與被AFB1污染食物的消費情況成正比。1993年，國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）正式將AFB1列為IA類致癌物質(zhì)[8]，認為其是一種毒性極強的物質(zhì)。另外，AF屬于天然毒素，其產(chǎn)生與環(huán)境因素密切相關(guān)。在作物種植、收獲、儲藏和加工過程中，很難避免和防止產(chǎn)毒真菌的危害，其含量也隨著農(nóng)作物生長、收獲、加工、儲運過程中菌體生長和污染程度加深而日趨上升[9-11]。國際上對食品和農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈條的各環(huán)節(jié)中AF含量都進行嚴格監(jiān)管。

迄今為止，許多國家和組織均對AF在食品中設(shè)定了最高殘留限量（Maximum Residue Limits），如中國[12]和美國[13]針對玉米、花生仁、花生油中AFB1的 MRLs均為 20 μg/kg，歐盟[14]為 2 μg/kg。然而，近年來，有關(guān)AF引起對糧食、油料等食品的污染事件屢見不鮮，對食品質(zhì)量和人類健康造成極大的威脅，給社會經(jīng)濟造成極大的損失。同時，各種基于不同原理的檢測分析方法也逐漸被開發(fā)出來用于不同樣品中AFB1的定性、定量分析。目前常用的AFB1檢測方法主要有如薄層色譜法[15-16]、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[17-18]及液-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，如氣-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）[19]、 液-質(zhì)聯(lián)用（Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS）[20-21]等。儀器分析方法能夠為食品中AFB1污染物提供準確度和靈敏度相對較高的分析，然而存在儀器昂貴，需要操作相對復(fù)雜，繁瑣的樣品前處理過程，檢測耗時長等問題，不適合大量樣品篩查及現(xiàn)場快速檢測?；诳乖?抗體特異性反應(yīng)的免疫分析技術(shù)具有靈敏、精確、快速、成本低廉等特點，在大量樣品快速篩查、現(xiàn)場快速檢測方面，有無可比擬的優(yōu)勢。

鑒于此，本研究以高毒性的AFB1污染物為研究對象，通過對一系列關(guān)鍵試驗條件的優(yōu)化比較，建立一種靈敏度高、準確性好的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，ic-ELISA），并成功用于花生中AFB1的檢測。本研究為食品中AF污染物的快速篩查、現(xiàn)場分析提供一種高效、可行的分析方法，為進一步提升食品安全檢測水平，保障食品產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)支持。

1 材料與試驗方法

1.1 試劑、材料與儀器

目標物 AFB1及其結(jié)構(gòu)類似物 AFG1、AFG2、AFM1、AFM2均購于美國 Sigma-Aldrich公司；AFB1單克隆抗體購自山東綠都生物科技有限公司；羊抗鼠二抗、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亞胺（EDC）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、雞卵白蛋白（OVA）、羧甲基羥胺（CMO）、牛血清白蛋白（BSA）、明膠、魚皮膠、過氧化氫脲、3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）均購于美國 Sigma-Aldrich公司；研究所用其它化學(xué)藥品如β-環(huán)糊精、檸檬酸、無水醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉（分析純）等均購于天津市化學(xué)試劑三廠。

96孔酶標板、酶標儀（Multiskan Spectrum），美國Thermo公司；周轉(zhuǎn)式振搖器（MS3），德國IKA公司；8 道微量移液器（10～100 μL），德國 Eppendorf公司；高速冷凍離心機（5810r），德國 Eppendorf公司；超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 AFB1包被抗原的制備 半抗原的合成：準確稱取5.0 mg AFB1置于圓底燒瓶中，加入200 μL甲醇，充分溶解后加入12.0 mg CMO，1.0 mL無水吡啶，氬氣保護下室溫攪拌反應(yīng)24 h，得橙紅色溶液，50℃下真空干燥，得AFB肟化物（AFB1O）。

包被抗原（AFB1-OVA）（3.15 mg/mL）的制備：準確稱取4.28 mg AFB1O和3.98 mg EDC，溶解于300 μL DMF，攪拌均勻，4℃活化過夜。另稱取10.0 mg OVA溶于2.0 mL碳酸氫鈉緩沖液（0.13 mol/L，pH 8.1）。在冰浴條件下逐滴加入活化產(chǎn)物，室溫反應(yīng)2 h后4℃下反應(yīng)過夜。收集所得產(chǎn)物在PBS 溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）透析 72 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ic-ELISA方法條件優(yōu)化 研究過程中，針對ic-ELISA方法一系列關(guān)鍵試驗參數(shù)包括抗原包被量（0.01，0.05，0.1，0.5 μg/孔）、抗體稀釋倍數(shù)（1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000）、 封閉液的種類和濃度（0.1%脫脂乳粉、0.5%脫脂乳粉、0.5%BSA、0.5%魚皮膠、0.5%明膠）、緩沖液種類及緩沖離子強度（0.01 mol/L PBS、0.05 mol/L PBS、0.01 mol/L PB）、 緩沖液 pH 值（5.7，7.4，8.5）進行了詳細優(yōu)化。并根據(jù)優(yōu)化試驗結(jié)果，繪制方法標準曲線。

1.2.3 ic-ELISA檢測過程 抗原包被：以碳酸鹽緩沖液（0.05 mol/L）為包被液稀釋包被原至1 μg/mL，加入到 96 孔酶標板中，100 μL/孔（0.1 μg/孔的包被量），4℃條件包被14～16 h，棄去包被液，用PBST緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）洗板 3次，拍干。

封閉：用0.1%脫脂乳粉以200 μL/孔封閉酶標板，于37℃培養(yǎng)箱中靜置1 h，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗板3次，拍干。

測定：對照組每孔加入50 μL 0.01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4），抑制組每孔加入50 μL一系列梯度濃度的 AFB1標準品溶液（0.005，0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5 以及 5 μg/L）。向?qū)φ战M和抑制組中各加入 50 μL AFB1抗體溶液（1∶64 000倍稀釋），于37℃培養(yǎng)箱靜置反應(yīng)1 h，用PBST緩沖液洗板4次，拍干；向每孔中加入100 μL 0.01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4）稀釋10 000倍的山羊抗鼠酶標二抗，于37℃培養(yǎng)箱反應(yīng)0.5 h，用PBST緩沖液洗板5次，拍干；

顯色：向每孔中加入100 μL底物溶液，于37℃培養(yǎng)箱孵育0.5 h，用1.25 mol/L H2SO4終止顯色，并在λ=450 nm條件下讀取吸光度值。

1.2.4 方法特異性評價 本試驗選用5種AFB1類似物（AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2）以及 4 種生物毒素（玉米赤霉烯酮（ZEN）、嘔吐毒素（DON）、伏馬毒素 B1（FB1）、T-2 毒素），通過計算各標準品的IC50值，對所建立的ic-ELISA方法特異性進行評價。

1.2.5 實際樣品測定 準確稱取2.0 g粉碎花生樣品置于15 mL離心管中，加入4.0 mL 70% 甲醇-PBS溶液（V/V），渦旋振蕩 10 min后，5 000 r/min常溫離心5 min，取上清液稀釋20倍后建立抑制曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 AFB1包被抗原的鑒定

2.1.1 半抗原AFB1O的鑒定 試驗利用CMO將AFB1肟化生成半抗原AFB1O。表征圖見圖1。AFB1質(zhì)譜圖如圖1a所示，ESI-MS：M：313.06（M=312.27）。AFB1O質(zhì)譜圖如圖1b所示，ESI-MS：M：386.09（M=385.2）。經(jīng)質(zhì)譜分析，有AFB1O的單體峰存在，且AFB1的特征峰消失，證明該物質(zhì)合成成功。

圖1 AFB1與AFB1O質(zhì)譜鑒定結(jié)果Fig.1 Mass spectrometry identification results of AFB1and AFB1O

2.1.2 包被原 AFB1O-OVA的鑒定 試驗利用紫外-可見光譜儀分別測定了 AFB1、AFB1O以及AFB1O-OVA在200～600 nm處的吸光度值，并繪制紫外可見吸收光譜曲線，以鑒定包被原AFB1OOVA偶聯(lián)情況，結(jié)果見圖2。OVA僅在280 nm處有最大吸收峰，AFB1在360 nm處存在吸收峰，而AFB1O-OVA在兩處均發(fā)生明顯偏移，可推斷AFB1O-OVA包被原偶聯(lián)成功。

2.2 ic-ELISA方法工作條件的確定

2.2.1 抗原包被量與抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 試驗選取不同包被濃度（0.01，0.05，0.1，0.5 μg/孔），抗體稀釋8 000～64 000倍，繪制抑制率曲線并計算IC50值，以確定最佳抗原包被量以及抗體稀釋倍數(shù)。結(jié)果見表1。當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)在8 000和16 000倍時，ODmax值超過 1.2。當(dāng)包被量為 0.1 μg/孔時可獲得合適的OD值和較低的IC50值。當(dāng)包被量為0.01 μg/孔時，雖然IC50值較低，但OD值偏低，易產(chǎn)生誤差。最終確定包被原包被量為0.1 μg/孔，抗體稀釋倍數(shù)為1∶64 000。

圖2 AFB1O-OVA偶聯(lián)鑒定結(jié)果Fig.2 UV-vis spectrometer identification of AFB1O-OVA

表1 包被原包被量及抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Table 1 The optimized amount of antigen and antibody

2.2.2 封閉液及緩沖液種類的優(yōu)化 試驗分別選取0.1%脫脂乳粉、0.5%脫脂乳粉、0.5%BSA、0.5%魚皮膠、0.5%明膠5種蛋白作為方法封閉液，繪制抑制率曲線，結(jié)果見圖3a。當(dāng)選擇0.1%脫脂乳粉作為封閉劑時，方法靈敏度較0.5% 脫脂乳粉及0.5%BSA作為封閉劑的靈敏度高，且線性范圍好。而當(dāng)選用魚皮膠和明膠作為封閉液時，方法不成線性，無法建立抑制率曲線。故封閉液選擇為取0.1%脫脂乳粉。

試驗分別選取相同pH（7.4）的PBS緩沖溶液（0.01 mol/L）、PBS 緩沖溶液（0.05 mol/L）、PB 緩沖溶液（0.01 mol/L）作為方法緩沖液繪制抑制率曲線，結(jié)果見圖3b。當(dāng)選用PBS（0.01 mol/L）作為緩沖液時，曲線相關(guān)性較好，且靈敏度最高。最終確定 PBS緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）作為方法緩沖液。

圖3 封閉液及緩沖液種類的確定Fig.3 The optimization of types of blocking and dilution buffer

2.3 ic-ELISA檢測方法的建立

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，本試驗確定了AFB1間接競爭ELISA方法的最優(yōu)條件為：1）以0.1 μg/孔的抗原包被量對96孔板進行包被；2）抗體稀釋倍數(shù)為1∶64 000；3）選擇0.1%脫脂乳粉作為試驗封閉液；4）標準品稀釋液為PBS緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）。選取 0.005，0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，2.5 以及 5.0 μg/L 的 AFB1標準品溶液建立AFB1的標準曲線，如圖4所示。本研究所建立的 ELISA 檢測方法檢出限（IC15）為 0.0066 μg/L；靈敏度（IC50）為 0.027 μg/L；抑制率曲線線性范圍（IC20-IC80）為 0.0097～0.088 μg/L，相關(guān)系數(shù) R2=0.999。

圖4 AFB1ic-ELISA標準曲線（n=3）Fig.4 Standard curve of ic-ELISA for AFB1（n=3）

2.4 ic-ELISA檢測方法的性能評價

2.4.1 精密度評價 試驗通過計算板內(nèi)變異系數(shù)和板間變異系數(shù)對所建立的ic-ELISA方法精密度進行評價（表2）。隨著AFB1測定濃度的增加（0.005～5.0 μg/L），板內(nèi)與板間變異系數(shù)（n=6）分別介于0.29%～16.9%和0.22%～21.19%之間，且逐漸降低，符合酶聯(lián)免疫分析方法變異系數(shù)規(guī)律。

2.4.2 特異性評價 試驗分別對AFB1的結(jié)構(gòu)類似物（AFB2，AFM1，AFM2，AFG1，AFG2），以及其它 4種生物毒素（ZEN，DON，F(xiàn)B1，T-2）進行方法特異性測定，結(jié)果如表3所示。本研究所建立的分析方法對AFG1有較大交叉，交叉反應(yīng)率達到158.82%，對 AFM2、AFB2、AFG2交叉反應(yīng)率在0.62%～8.68%之間。該方法對其它類毒素均無交叉。

表2 icELISA板內(nèi)及板間變異（n=6）Table 2 Intra and inter-assay coefficient CV of the ic-ELISA

表3 所建立的ic-ELISA方法對AFB1結(jié)構(gòu)類似物及其它毒素的交叉反應(yīng)Table 3 Cross-reactivity of the ic-ELISA with AFB1 analogues and other mycrotoxins

2.5 實際樣品檢測

2.5.1 樣品基質(zhì)影響及消除 用PBS緩沖液（0.01 mol/L）對花生提取液進行5倍、10倍、20倍、40倍稀釋并用ELISA方法檢測，確定最佳的稀釋倍數(shù)。結(jié)果見表4。當(dāng)稀釋20倍時，ODmax最大，IC50值最小，可有效去除基質(zhì)影響。

2.5.2 添加回收試驗在花生樣品中進行濃度范圍為 0.2～200 μg/kg的梯度添加，以建立的 ic-ELISA方法進行檢測，獲得的花生樣品檢測曲線如圖4所示，靈敏度IC50為0.99 μg/kg。在所選定的 3 個添加濃度（1.0，2.0，4.0 μg/kg）下，目標物AFB1的回收率達到96.67%～106.51%。說明所建立的方法針對花生樣品可提供一種相對準確的分析方法。

表4 花生基質(zhì)對建立的ic-ELISA檢測方法的影響Table 4 The effect of peanut matrix on the developed ic-ELISA

圖5 ic-ELISA方法檢測花生中的AFB1Fig.5 Detection of AFB1in peanut sample by ic-ELISA

表5 ic-ELISA檢測花生中AFB1添加回收試驗結(jié)果Table 5 Recoveries of AFB1in spiked peanut samples by ic-ELISA

3 結(jié)論

本研究建立了一種檢測花生中強毒性污染物黃曲霉毒素B1（AFB1）的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（ic-ELISA）檢測方法。通過優(yōu)化ic-ELISA檢測方法的工作條件，最終確定抗原包被量為0.1 μg/孔，抗體稀釋倍數(shù)為1∶64 000；選用0.1%的脫脂乳粉為封閉液，PBS緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）作為樣品稀釋液。所建立的ic-ELISA檢測方法檢出限（LOD，IC15）為 0.0066 μg/L；靈敏度（IC50）為 0.027 μg/L；線性范圍為：0.0097～0.088 μg/L；R2=0.999。方法對 AFG1交叉反應(yīng)率為158.82%，對 AFM2、AFB2、AFG2交叉反應(yīng)率在0.62%～8.68%之間，對其它生物毒素均無交叉。板內(nèi)變異系數(shù)（n=6）為0.29%～16.9%，板間變異系數(shù)（n=6）為0.22%～21.19%。實際樣品（花生）檢測靈敏度（IC50）為 0.99 μg/kg，回收率范圍為 96.67%～106.51%。本研究方法操作簡便、靈敏度高、準確性好，在大量樣品的AFB1篩查工作中有極大的優(yōu)勢，適用于低濃度AFB1殘留樣品的檢測。方法可以作為谷物食品中黃曲霉毒素B1殘留的快速檢測的有用工具。