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      間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法檢測花生中黃曲霉毒素B1

      2019-10-12 06:02:10潘明飛李詩潔郭丹丹王俊平
      中國食品學(xué)報 2019年9期
      關(guān)鍵詞:脫脂乳包被緩沖液

      潘明飛 李詩潔 郭丹丹 王俊平 王 碩

      (教育部食品安全與營養(yǎng)重點實驗室 天津科技大學(xué) 天津 300457)

      黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)是一種典型的真菌毒素,是主要由黃曲霉和寄生曲霉菌產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物[1-2]。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒性差異,主要分為 B1、G1、G2、M1、M25 種,均為二氫呋喃香豆素的衍生物[3]。AF廣泛存在于黃曲霉污染的花生、玉米、大米等農(nóng)作物產(chǎn)品及其制品中,其中糧食食品中主要以B1,G1,G2為主,牛乳及其制品中主要是M1、M2。AFB1的毒性最強,有相當(dāng)強的致畸、致癌、致突變作用[4-5]。其毒性可達到氰化鉀的10倍,砒霜的68倍,三聚氰胺的416倍。AFB1可通過誘導(dǎo)人類p53腫瘤抑制基因的249位密碼子突變,從而引發(fā)肝癌等惡性疾病[6-7]。據(jù)報道,在亞非地區(qū),肝癌發(fā)病率直接與被AFB1污染食物的消費情況成正比。1993年,國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)正式將AFB1列為IA類致癌物質(zhì)[8],認為其是一種毒性極強的物質(zhì)。另外,AF屬于天然毒素,其產(chǎn)生與環(huán)境因素密切相關(guān)。在作物種植、收獲、儲藏和加工過程中,很難避免和防止產(chǎn)毒真菌的危害,其含量也隨著農(nóng)作物生長、收獲、加工、儲運過程中菌體生長和污染程度加深而日趨上升[9-11]。國際上對食品和農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈條的各環(huán)節(jié)中AF含量都進行嚴格監(jiān)管。

      迄今為止,許多國家和組織均對AF在食品中設(shè)定了最高殘留限量(Maximum Residue Limits),如中國[12]和美國[13]針對玉米、花生仁、花生油中AFB1的 MRLs均為 20 μg/kg,歐盟[14]為 2 μg/kg。然而,近年來,有關(guān)AF引起對糧食、油料等食品的污染事件屢見不鮮,對食品質(zhì)量和人類健康造成極大的威脅,給社會經(jīng)濟造成極大的損失。同時,各種基于不同原理的檢測分析方法也逐漸被開發(fā)出來用于不同樣品中AFB1的定性、定量分析。目前常用的AFB1檢測方法主要有如薄層色譜法[15-16]、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)[17-18]及液-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),如氣-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer,GC-MS)[19]、 液-質(zhì)聯(lián)用(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer,LC-MS)[20-21]等。儀器分析方法能夠為食品中AFB1污染物提供準確度和靈敏度相對較高的分析,然而存在儀器昂貴,需要操作相對復(fù)雜,繁瑣的樣品前處理過程,檢測耗時長等問題,不適合大量樣品篩查及現(xiàn)場快速檢測?;诳乖?抗體特異性反應(yīng)的免疫分析技術(shù)具有靈敏、精確、快速、成本低廉等特點,在大量樣品快速篩查、現(xiàn)場快速檢測方面,有無可比擬的優(yōu)勢。

      鑒于此,本研究以高毒性的AFB1污染物為研究對象,通過對一系列關(guān)鍵試驗條件的優(yōu)化比較,建立一種靈敏度高、準確性好的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA),并成功用于花生中AFB1的檢測。本研究為食品中AF污染物的快速篩查、現(xiàn)場分析提供一種高效、可行的分析方法,為進一步提升食品安全檢測水平,保障食品產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)支持。

      1 材料與試驗方法

      1.1 試劑、材料與儀器

      目標物 AFB1及其結(jié)構(gòu)類似物 AFG1、AFG2、AFM1、AFM2均購于美國 Sigma-Aldrich公司;AFB1單克隆抗體購自山東綠都生物科技有限公司;羊抗鼠二抗、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(EDC)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、雞卵白蛋白(OVA)、羧甲基羥胺(CMO)、牛血清白蛋白(BSA)、明膠、魚皮膠、過氧化氫脲、3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)均購于美國 Sigma-Aldrich公司;研究所用其它化學(xué)藥品如β-環(huán)糊精、檸檬酸、無水醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉(分析純)等均購于天津市化學(xué)試劑三廠。

      96孔酶標板、酶標儀(Multiskan Spectrum),美國Thermo公司;周轉(zhuǎn)式振搖器(MS3),德國IKA公司;8 道微量移液器(10~100 μL),德國 Eppendorf公司;高速冷凍離心機(5810r),德國 Eppendorf公司;超純水系統(tǒng),美國Millipore公司。

      1.2 試驗方法

      1.2.1 AFB1包被抗原的制備 半抗原的合成:準確稱取5.0 mg AFB1置于圓底燒瓶中,加入200 μL甲醇,充分溶解后加入12.0 mg CMO,1.0 mL無水吡啶,氬氣保護下室溫攪拌反應(yīng)24 h,得橙紅色溶液,50℃下真空干燥,得AFB肟化物(AFB1O)。

      包被抗原(AFB1-OVA)(3.15 mg/mL)的制備:準確稱取4.28 mg AFB1O和3.98 mg EDC,溶解于300 μL DMF,攪拌均勻,4℃活化過夜。另稱取10.0 mg OVA溶于2.0 mL碳酸氫鈉緩沖液(0.13 mol/L,pH 8.1)。在冰浴條件下逐滴加入活化產(chǎn)物,室溫反應(yīng)2 h后4℃下反應(yīng)過夜。收集所得產(chǎn)物在PBS 溶液(0.01 mol/L,pH 7.4)透析 72 h,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.2 ic-ELISA方法條件優(yōu)化 研究過程中,針對ic-ELISA方法一系列關(guān)鍵試驗參數(shù)包括抗原包被量(0.01,0.05,0.1,0.5 μg/孔)、抗體稀釋倍數(shù)(1∶8 000,1∶16 000,1∶32 000,1∶64 000)、 封閉液的種類和濃度(0.1%脫脂乳粉、0.5%脫脂乳粉、0.5%BSA、0.5%魚皮膠、0.5%明膠)、緩沖液種類及緩沖離子強度(0.01 mol/L PBS、0.05 mol/L PBS、0.01 mol/L PB)、 緩沖液 pH 值(5.7,7.4,8.5)進行了詳細優(yōu)化。并根據(jù)優(yōu)化試驗結(jié)果,繪制方法標準曲線。

      1.2.3 ic-ELISA檢測過程 抗原包被:以碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L)為包被液稀釋包被原至1 μg/mL,加入到 96 孔酶標板中,100 μL/孔(0.1 μg/孔的包被量),4℃條件包被14~16 h,棄去包被液,用PBST緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.4)洗板 3次,拍干。

      封閉:用0.1%脫脂乳粉以200 μL/孔封閉酶標板,于37℃培養(yǎng)箱中靜置1 h,棄去封閉液,用PBST緩沖液洗板3次,拍干。

      測定:對照組每孔加入50 μL 0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4),抑制組每孔加入50 μL一系列梯度濃度的 AFB1標準品溶液(0.005,0.01,0.025,0.05,0.1,0.25,0.5,1,2.5 以及 5 μg/L)。向?qū)φ战M和抑制組中各加入 50 μL AFB1抗體溶液(1∶64 000倍稀釋),于37℃培養(yǎng)箱靜置反應(yīng)1 h,用PBST緩沖液洗板4次,拍干;向每孔中加入100 μL 0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)稀釋10 000倍的山羊抗鼠酶標二抗,于37℃培養(yǎng)箱反應(yīng)0.5 h,用PBST緩沖液洗板5次,拍干;

      顯色:向每孔中加入100 μL底物溶液,于37℃培養(yǎng)箱孵育0.5 h,用1.25 mol/L H2SO4終止顯色,并在λ=450 nm條件下讀取吸光度值。

      1.2.4 方法特異性評價 本試驗選用5種AFB1類似物(AFB2,AFG1,AFG2,AFM1,AFM2)以及 4 種生物毒素(玉米赤霉烯酮(ZEN)、嘔吐毒素(DON)、伏馬毒素 B1(FB1)、T-2 毒素),通過計算各標準品的IC50值,對所建立的ic-ELISA方法特異性進行評價。

      1.2.5 實際樣品測定 準確稱取2.0 g粉碎花生樣品置于15 mL離心管中,加入4.0 mL 70% 甲醇-PBS溶液(V/V),渦旋振蕩 10 min后,5 000 r/min常溫離心5 min,取上清液稀釋20倍后建立抑制曲線。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 AFB1包被抗原的鑒定

      2.1.1 半抗原AFB1O的鑒定 試驗利用CMO將AFB1肟化生成半抗原AFB1O。表征圖見圖1。AFB1質(zhì)譜圖如圖1a所示,ESI-MS:M:313.06(M=312.27)。AFB1O質(zhì)譜圖如圖1b所示,ESI-MS:M:386.09(M=385.2)。經(jīng)質(zhì)譜分析,有AFB1O的單體峰存在,且AFB1的特征峰消失,證明該物質(zhì)合成成功。

      圖1 AFB1與AFB1O質(zhì)譜鑒定結(jié)果Fig.1 Mass spectrometry identification results of AFB1and AFB1O

      2.1.2 包被原 AFB1O-OVA的鑒定 試驗利用紫外-可見光譜儀分別測定了 AFB1、AFB1O以及AFB1O-OVA在200~600 nm處的吸光度值,并繪制紫外可見吸收光譜曲線,以鑒定包被原AFB1OOVA偶聯(lián)情況,結(jié)果見圖2。OVA僅在280 nm處有最大吸收峰,AFB1在360 nm處存在吸收峰,而AFB1O-OVA在兩處均發(fā)生明顯偏移,可推斷AFB1O-OVA包被原偶聯(lián)成功。

      2.2 ic-ELISA方法工作條件的確定

      2.2.1 抗原包被量與抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 試驗選取不同包被濃度(0.01,0.05,0.1,0.5 μg/孔),抗體稀釋8 000~64 000倍,繪制抑制率曲線并計算IC50值,以確定最佳抗原包被量以及抗體稀釋倍數(shù)。結(jié)果見表1。當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)在8 000和16 000倍時,ODmax值超過 1.2。當(dāng)包被量為 0.1 μg/孔時可獲得合適的OD值和較低的IC50值。當(dāng)包被量為0.01 μg/孔時,雖然IC50值較低,但OD值偏低,易產(chǎn)生誤差。最終確定包被原包被量為0.1 μg/孔,抗體稀釋倍數(shù)為1∶64 000。

      圖2 AFB1O-OVA偶聯(lián)鑒定結(jié)果Fig.2 UV-vis spectrometer identification of AFB1O-OVA

      表1 包被原包被量及抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Table 1 The optimized amount of antigen and antibody

      2.2.2 封閉液及緩沖液種類的優(yōu)化 試驗分別選取0.1%脫脂乳粉、0.5%脫脂乳粉、0.5%BSA、0.5%魚皮膠、0.5%明膠5種蛋白作為方法封閉液,繪制抑制率曲線,結(jié)果見圖3a。當(dāng)選擇0.1%脫脂乳粉作為封閉劑時,方法靈敏度較0.5% 脫脂乳粉及0.5%BSA作為封閉劑的靈敏度高,且線性范圍好。而當(dāng)選用魚皮膠和明膠作為封閉液時,方法不成線性,無法建立抑制率曲線。故封閉液選擇為取0.1%脫脂乳粉。

      試驗分別選取相同pH(7.4)的PBS緩沖溶液(0.01 mol/L)、PBS 緩沖溶液(0.05 mol/L)、PB 緩沖溶液(0.01 mol/L)作為方法緩沖液繪制抑制率曲線,結(jié)果見圖3b。當(dāng)選用PBS(0.01 mol/L)作為緩沖液時,曲線相關(guān)性較好,且靈敏度最高。最終確定 PBS緩沖溶液(0.01 mol/L,pH 7.4)作為方法緩沖液。

      圖3 封閉液及緩沖液種類的確定Fig.3 The optimization of types of blocking and dilution buffer

      2.3 ic-ELISA檢測方法的建立

      根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果,本試驗確定了AFB1間接競爭ELISA方法的最優(yōu)條件為:1)以0.1 μg/孔的抗原包被量對96孔板進行包被;2)抗體稀釋倍數(shù)為1∶64 000;3)選擇0.1%脫脂乳粉作為試驗封閉液;4)標準品稀釋液為PBS緩沖溶液(0.01 mol/L,pH 7.4)。選取 0.005,0.01,0.025,0.05,0.1,0.25,0.5,1.0,2.5 以及 5.0 μg/L 的 AFB1標準品溶液建立AFB1的標準曲線,如圖4所示。本研究所建立的 ELISA 檢測方法檢出限(IC15)為 0.0066 μg/L;靈敏度(IC50)為 0.027 μg/L;抑制率曲線線性范圍(IC20-IC80)為 0.0097~0.088 μg/L,相關(guān)系數(shù) R2=0.999。

      圖4 AFB1ic-ELISA標準曲線(n=3)Fig.4 Standard curve of ic-ELISA for AFB1(n=3)

      2.4 ic-ELISA檢測方法的性能評價

      2.4.1 精密度評價 試驗通過計算板內(nèi)變異系數(shù)和板間變異系數(shù)對所建立的ic-ELISA方法精密度進行評價(表2)。隨著AFB1測定濃度的增加(0.005~5.0 μg/L),板內(nèi)與板間變異系數(shù)(n=6)分別介于0.29%~16.9%和0.22%~21.19%之間,且逐漸降低,符合酶聯(lián)免疫分析方法變異系數(shù)規(guī)律。

      2.4.2 特異性評價 試驗分別對AFB1的結(jié)構(gòu)類似物(AFB2,AFM1,AFM2,AFG1,AFG2),以及其它 4種生物毒素(ZEN,DON,F(xiàn)B1,T-2)進行方法特異性測定,結(jié)果如表3所示。本研究所建立的分析方法對AFG1有較大交叉,交叉反應(yīng)率達到158.82%,對 AFM2、AFB2、AFG2交叉反應(yīng)率在0.62%~8.68%之間。該方法對其它類毒素均無交叉。

      表2 icELISA板內(nèi)及板間變異(n=6)Table 2 Intra and inter-assay coefficient CV of the ic-ELISA

      表3 所建立的ic-ELISA方法對AFB1結(jié)構(gòu)類似物及其它毒素的交叉反應(yīng)Table 3 Cross-reactivity of the ic-ELISA with AFB1 analogues and other mycrotoxins

      2.5 實際樣品檢測

      2.5.1 樣品基質(zhì)影響及消除 用PBS緩沖液(0.01 mol/L)對花生提取液進行5倍、10倍、20倍、40倍稀釋并用ELISA方法檢測,確定最佳的稀釋倍數(shù)。結(jié)果見表4。當(dāng)稀釋20倍時,ODmax最大,IC50值最小,可有效去除基質(zhì)影響。

      2.5.2 添加回收試驗在花生樣品中進行濃度范圍為 0.2~200 μg/kg的梯度添加,以建立的 ic-ELISA方法進行檢測,獲得的花生樣品檢測曲線如圖4所示,靈敏度IC50為0.99 μg/kg。在所選定的 3 個添加濃度(1.0,2.0,4.0 μg/kg)下,目標物AFB1的回收率達到96.67%~106.51%。說明所建立的方法針對花生樣品可提供一種相對準確的分析方法。

      表4 花生基質(zhì)對建立的ic-ELISA檢測方法的影響Table 4 The effect of peanut matrix on the developed ic-ELISA

      圖5 ic-ELISA方法檢測花生中的AFB1Fig.5 Detection of AFB1in peanut sample by ic-ELISA

      表5 ic-ELISA檢測花生中AFB1添加回收試驗結(jié)果Table 5 Recoveries of AFB1in spiked peanut samples by ic-ELISA

      3 結(jié)論

      本研究建立了一種檢測花生中強毒性污染物黃曲霉毒素B1(AFB1)的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)檢測方法。通過優(yōu)化ic-ELISA檢測方法的工作條件,最終確定抗原包被量為0.1 μg/孔,抗體稀釋倍數(shù)為1∶64 000;選用0.1%的脫脂乳粉為封閉液,PBS緩沖溶液(0.01 mol/L,pH 7.4)作為樣品稀釋液。所建立的ic-ELISA檢測方法檢出限(LOD,IC15)為 0.0066 μg/L;靈敏度(IC50)為 0.027 μg/L;線性范圍為:0.0097~0.088 μg/L;R2=0.999。方法對 AFG1交叉反應(yīng)率為158.82%,對 AFM2、AFB2、AFG2交叉反應(yīng)率在0.62%~8.68%之間,對其它生物毒素均無交叉。板內(nèi)變異系數(shù)(n=6)為0.29%~16.9%,板間變異系數(shù)(n=6)為0.22%~21.19%。實際樣品(花生)檢測靈敏度(IC50)為 0.99 μg/kg,回收率范圍為 96.67%~106.51%。本研究方法操作簡便、靈敏度高、準確性好,在大量樣品的AFB1篩查工作中有極大的優(yōu)勢,適用于低濃度AFB1殘留樣品的檢測。方法可以作為谷物食品中黃曲霉毒素B1殘留的快速檢測的有用工具。

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