紅花瘤果茶種子萌發(fā)的溫光調(diào)控及生理特性變化研究

郭米香1，呂曉梅2，洪 江，劉海燕4，鄒天才

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽 550025；2.黔西南布依族苗族自治州南盤江國有林場，貴州 興義 562400；3.貴州科學(xué)院，貴陽 550001；4.貴州省植物園，貴陽 550004)

紅花瘤果茶(CamelliarubituberculataChang ex Lin et Lu)是貴州特有珍稀植物[1-2]，分布于常綠闊葉落葉混交林亞喬木層或灌木層，高可達4～6 m，頗具經(jīng)濟價值，花紅色或粉紅色、花期長，樹形優(yōu)美，木質(zhì)堅硬，是優(yōu)良的園林植物和經(jīng)濟用材[3]。主要分布在貴州省黔西南州興仁縣和晴隆縣的喀斯特山區(qū)，分布區(qū)極為狹窄、數(shù)量稀少，以巖生為主[4]。種子的萌發(fā)需要特定的溫度，這主要是因為種子內(nèi)部各種參與生理作用的酶需要適宜溫度的激活，大多數(shù)植物種子萌發(fā)對光的反應(yīng)不敏感，但也有部分種子需要在光照或黑暗條件下才能萌發(fā)[5]。紅花瘤果茶種子屬于硬實種子，具備頑拗性種子粒大而重的特點[6]，本試驗研究了紅花瘤果茶的種子萌發(fā)的最佳萌發(fā)溫度及萌發(fā)過程中生理特征的變化，探討了其種子萌發(fā)對光的需求及促進種子萌發(fā)的最佳處理方法，為解決提高特有植物紅花瘤果茶擴繁的科學(xué)問題以及開展紅花瘤果茶的引種栽培應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

表1 采種區(qū)生境概況

表2 紅花瘤果茶種子基本情況

1 材料與方法

1.1 采種概況

采種區(qū)位于貴州省晴隆縣紫馬鄉(xiāng)龍頭村上捧碧林區(qū)(表1)，地處喀斯特沙頁巖鑲嵌的高原峽谷，海拔高度1 100～1 150 m，巖石裸露達60%～80%，為典型的高原亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，降水豐富，雨熱同期，主要土壤為黑色石灰土，土質(zhì)疏松，土層厚度差異大、土被不連續(xù)，有機質(zhì)含量高[4-5]。采集種子皆為當年結(jié)實的鮮種子(表2)，采回后除去癟粒和蟲害種子，置于通風(fēng)干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

試驗于2018年12月在貴州大學(xué)林學(xué)院植物生理實驗室進行，觀測時間為3個月。因該種子屬于大粒種子，因此以25粒為1次重復(fù)，設(shè)置3個重復(fù)。試驗采用潔凈無毒的紗布作為發(fā)芽床，發(fā)芽容器為帶蓋并具有孔隔板的透明發(fā)芽盒，使用前均用福爾馬林溶液消毒處理。參照國際種子檢驗章程，以胚長出種皮的長度超過種子的直徑為萌發(fā)標志[6]。種子萌發(fā)期間，統(tǒng)計種子發(fā)芽天數(shù)和發(fā)芽數(shù)，了解種子的發(fā)芽動態(tài)，一直持續(xù)到種子萌發(fā)結(jié)束為止。3次重復(fù)求平均值計算其發(fā)芽率：

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(達到高峰期時發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%[7]。

1.2.1溫度處理

將種子用1%高錳酸鉀溶液浸泡20 min后用清水沖洗數(shù)次，種子平鋪在發(fā)芽盒中，25粒為1次重復(fù)，并設(shè)置3個重復(fù)。分別設(shè)置15，20，25，30，35 ℃ 5個溫度梯度進行發(fā)芽試驗，每天保持10 h光照，種子發(fā)芽后開始記錄發(fā)芽情況。

1.2.2光照處理

種子經(jīng)1%高錳酸鉀溶液消毒20 min并清洗后，在25 ℃的培養(yǎng)箱中分別設(shè)置0 h、10 h、24 h 3個光照時間，種子發(fā)芽后開始記錄發(fā)芽情況。

1.2.3外源物質(zhì)處理

配置不同濃度的赤霉素溶液、高錳酸鉀溶液、聚乙二醇6000溶液處理種子(表3)，將各組種子置于溫度25 ℃，每天10 h光照下培育，調(diào)查并統(tǒng)計種子發(fā)芽情況，適時加水。

表3 紅花瘤果茶種子的不同外源物質(zhì)不同濃度處理情況

1.2.4生理指標測定

每間隔10 d，在15 ℃、25 ℃、35 ℃ 3個溫度梯度，光照0 h、10 h、24 h處理下取種子或幼苗，檢測其可溶性糖、可溶性蛋白及丙二醛的含量。分析溫度和光照對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中內(nèi)含物含量的影響。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G-250染色法，可溶性糖含量采用蒽酮比色法，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[7-8]。

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件分析，圖標采用Excel軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理對紅花瘤果茶種子萌發(fā)的影響

對紅花瘤果茶種子設(shè)置了5個溫度梯度進行發(fā)芽試驗，結(jié)果(表4)表明，紅花瘤果茶種子在溫度15～35 ℃均能萌發(fā)，5個溫度梯度的發(fā)芽率均呈現(xiàn)顯著差異，種子發(fā)芽率依次為20 ℃>25 ℃>15 ℃>30 ℃>35 ℃，種子在20 ℃發(fā)芽率最高，在35 ℃發(fā)芽率最低。種子發(fā)芽勢依次為20 ℃>25 ℃>30 ℃>15 ℃>35 ℃，種子在15 ℃、25 ℃、30 ℃的發(fā)芽勢沒有顯著差異，在20 ℃發(fā)芽勢最高，在35 ℃發(fā)芽勢最低，表明種子最適萌發(fā)溫度為20 ℃。種子在30 ℃萌發(fā)最早，35 ℃萌發(fā)最晚。

2.2 不同光照處理對紅花瘤果茶種子萌發(fā)的影響

對紅花瘤果茶設(shè)置了3個光照梯度，分別為0 h、10 h、24 h光照，萌發(fā)實驗結(jié)果，結(jié)果(表5)表明，種子在3個光照梯度中的發(fā)芽率和發(fā)芽勢差異不顯著，發(fā)芽率和發(fā)芽勢為正相關(guān)關(guān)系，種子在0 h光照下發(fā)芽最早，發(fā)芽率和發(fā)芽勢最高，在全光照下種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢最低，發(fā)芽時間最晚。

表4 不同溫度梯度對種子萌發(fā)的影響

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

表5 不同光照時間對種子萌發(fā)的影響

2.3 不同外源物質(zhì)對紅花瘤果茶種子萌發(fā)的影響

如表6所示，不同赤霉素濃度處理后的種子發(fā)芽率依次為200 mg·L-1>400 mg·L-1>500 mg·L-1>100 mg·L-1>300 mg·L-1，濃度200 mg·L-1和濃度400 mg·L-1、500 mg·L-1的赤霉素溶液能顯著增強紅花瘤果茶種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，其中以200 mg·L-1的處理最好，能促進紅花瘤果茶種子的提前萌發(fā)，赤霉素處理對紅花瘤果茶種子的萌發(fā)具有促進作用。

表6 不同赤霉素濃度處理對紅花瘤果茶種子萌發(fā)的影響

由表7可知，采用不同濃度的高錳酸鉀溶液處理紅花瘤果茶種子，并不能提高其發(fā)芽率，甚至在某種程度上抑制了紅花瘤果茶的萌發(fā)。不同濃度處理紅花瘤果茶種子的發(fā)芽率依次為，ck≥1 g·L-1>2 g·L-1>3 g·L-1>4 g·L-1>5 g·L-1，結(jié)果表明，隨著高錳酸鉀溶液濃度的增加，紅花瘤果茶種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢依次降低，其中用5 g·L-1濃度處理后的種子基本喪失發(fā)芽能力，發(fā)芽率趨于0。對照組和處理濃度為1 g·L-1和2 g·L-1的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢無顯著差異，與3 g·L-1、4 g·L-1、5 g·L-1處理存在顯著差異。

注：不同字母表示在相應(yīng)萌發(fā)時間內(nèi)不同發(fā)芽環(huán)境間可溶性蛋白質(zhì)含量的差異。圖1 溫度和光照對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

表7 不同高錳酸鉀濃度處理對紅花瘤果茶種子萌發(fā)的影響

表8 不同聚乙二醇濃度處理對紅花瘤果茶種子萌發(fā)的影響

由表8可知，不同濃度的聚乙二醇并不能提高紅花瘤果茶種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，300 mg·L-1濃度處理后的種子基本喪失發(fā)芽能力，200 mg·L-1、350 g·L-1、400 mg·L-1濃度處理均在不同程度上降低了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

2.4 溫度和光照對種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

在不同溫度和光照條件下，測定紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白質(zhì)含量的變化，結(jié)果如圖1所示，在不同的溫度和光照下，種子內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量在種子萌發(fā)初期(0～10 d)均呈現(xiàn)為上升趨勢，在隨后的萌發(fā)過程中又呈現(xiàn)下降趨勢，不同溫度處理對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白質(zhì)含量影響顯著。

種子萌發(fā)10 d時，可溶性蛋白質(zhì)含量達到最高，表明在萌發(fā)前期種子需要積累大量的可溶性蛋白質(zhì)，為種子的萌發(fā)做準備。可溶性蛋白質(zhì)多為游離態(tài)的酶[9]，溫度為15 ℃、35 ℃時，種子的可溶性蛋白質(zhì)在萌發(fā)10～20 d急劇下降，種子在這個時候受低溫或高溫外界環(huán)境影響，可溶性蛋白參與代謝速度快，迅速開始分解為種子的萌發(fā)做準備。溫度為25 ℃時，種子可溶性蛋白質(zhì)含量在0～10 d內(nèi)上升慢，隨后開始緩慢下降，在萌發(fā)20～50 d時，蛋白質(zhì)含量才開始急劇下降，這個階段為25 ℃下種子萌發(fā)的高峰期，種子要消耗大量的可溶性蛋白質(zhì)為胚根的生長發(fā)育提供能量。種子萌發(fā)20～50 d內(nèi)，15 ℃、35 ℃時種子中的可溶性蛋白質(zhì)含量下降速率低于25 ℃，說明在15 ℃、35 ℃時，種子內(nèi)部生理代謝速率低，參與種子萌發(fā)的酶活性不如25 ℃，過高或過低的溫度都會影響蛋白質(zhì)的分解速率。

注：不同字母表示在相應(yīng)萌發(fā)時間內(nèi)不同發(fā)芽環(huán)境間可溶性糖含量的差異。圖2 溫度和光照對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量的影響

在不同光照時間下，光照0 h、10 h、24 h可溶性蛋白質(zhì)含量在種子萌發(fā)0～10 d略有升高，隨后在發(fā)芽10～50 d含量又急劇下降，下降趨勢基本一致。盡管在萌發(fā)10～30 d內(nèi)，0 h光照下可溶性蛋白質(zhì)含量與10 h、24 h存在一定差異，但10 h光照與24 h光照處理可溶性蛋白質(zhì)含量沒有差異性。因此，在溫度一致的情況下，不同的光照時間對種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白質(zhì)含量變化不明顯。

2.5 溫度和光照對種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量的影響

在不同溫度和光照條件下，測定紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量的變化，結(jié)果如圖2所示，在15 ℃、25 ℃、35 ℃種子萌發(fā)過程中可溶性糖的含量均呈先下降后升高的趨勢，在萌發(fā)過程中，不同溫度處理下的紅花瘤果茶可溶性糖含量差異顯著。

可溶性糖含量在種子發(fā)芽0～30 d時含量逐漸下降，其中15 ℃在發(fā)芽0～30 d可溶性糖含量下降速率最快，這個時期主要為種子吸脹萌動并開始萌發(fā)的階段，種子消耗大量的可溶性糖為種子的萌發(fā)提供能量。種子萌發(fā)30 d后，可溶性糖含量又逐漸升高，主要是因為在這個時期，種子內(nèi)儲存的淀粉或脂肪開始分解轉(zhuǎn)化成糖類并參與種子的萌發(fā)，產(chǎn)生可溶性糖的積累，從而導(dǎo)致了可溶性糖上升[10]。25 ℃和35 ℃溫度下的紅花瘤果茶種子可溶性糖含量的下降和上升速率差異不顯著，下降速率和上升速率均低于15 ℃，說明溫度能顯著影響紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中的可溶性糖含量。

光照時間為0 h、10 h、24 h時，紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量均呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，在發(fā)芽10 d、40 d、50 d不同光照處理下種子內(nèi)可溶性糖含量具有差異性，但整體來說，不同的光照時間并沒有改變可溶性糖含量變化趨勢。說明不同的光照時間對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量的變化存在一定影響，但其影響程度遠不如溫度對其可溶性糖含量的影響。

注：不同字母表示在相應(yīng)萌發(fā)時間內(nèi)不同發(fā)芽環(huán)境間丙二醛(MDA)含量的差異。圖3 溫度和光照對紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中丙二醛含量的影響

2.6 溫度和光照對種子萌發(fā)過程中丙二醛含量的影響

丙二醛是植物細胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，種子內(nèi)丙二醛含量越高，說明過氧化作用越強，對種子造成的傷害越高[8]。丙二醛含量的高低在一定程度上指示種子脂質(zhì)化程度的高低[11]。在不同溫度和光照條件下測定了紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中的丙二醛含量的變化，結(jié)果如圖3所示，在不同溫度和光照條件下，隨著紅花瘤果茶種子萌發(fā)時間的增加，種子內(nèi)丙二醛含量逐漸上升，不同溫度處理下，種子在不同發(fā)育階段的丙二醛含量差異顯著，表明溫度能影響紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中的丙二醛含量。

15 ℃、25 ℃、35 ℃溫度條件下，種子在0～10 d萌發(fā)初期丙二醛含量略有上升，上升速率均較小。種子在25 ℃萌發(fā)時丙二醛含量變化不大，對種子的毒害作用不明顯，種子能保證正常的萌發(fā)。35 ℃條件下，種子萌發(fā)處于高溫狀態(tài)，超出了種子內(nèi)部生理活動的最佳溫度，丙二醛含量急劇上升，在一定程度上損傷了細胞的生物膜，導(dǎo)致種子難以萌發(fā)，因此在35 ℃條件下，種子萌發(fā)率最低。種子在15 ℃萌發(fā)的30～50 d后，其含量的上升幅度加大，但遠低于同時期的35 ℃萌發(fā)的種子。

不同時間光照使得紅花瘤果茶種子在萌發(fā)過程中的丙二醛含量有輕微的上升，但光照0 h、10 h、24 h對丙二醛含量的影響無顯著差異。因此，在溫度一致的情況下，光照時間的長短并不影響紅花瘤果茶種子萌發(fā)過程中的丙二醛含量。

3 結(jié)論與討論

3.1種子的萌發(fā)是一個復(fù)雜的生理過程，其萌發(fā)特性不僅受到種子內(nèi)在生理特性的調(diào)控，還受到外界環(huán)境因素的影響。溫度和光照均是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵因子，溫度主要是通過調(diào)控種子內(nèi)參與種子萌發(fā)所需要的酶活性來影響種子萌發(fā)過程，適宜的溫度能提高種子的萌發(fā)能力，溫度過低或過高都會降低種子的酶活性，從而影響種子的萌發(fā)生長[11-12]。種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢能反映出種子的發(fā)芽整齊度和發(fā)芽速度[13]，是考量種子發(fā)芽質(zhì)量的關(guān)鍵指標。紅花瘤果茶種子在15～35 ℃均能萌發(fā)，在20 ℃時的發(fā)芽率和發(fā)芽勢最高，分別達到72.00%和40.33%，在35 ℃的發(fā)芽率和發(fā)芽勢最低，僅有12.92%和6.83%。在30 ℃的種子能最早萌發(fā)，但其發(fā)芽勢與15 ℃、25 ℃無顯著差異，說明溫度能顯著影響紅花瘤果茶種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢。整體來說，隨著溫度的升高，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。紅花瘤果茶種子在0 h、10 h、24 h 3個光照梯度中的發(fā)芽率差異不顯著，表明光照時間的長短并不影響紅花瘤果茶種子的萌發(fā)。

3.2就同種植物種子而言，不同濃度的赤霉素、高錳酸鉀、聚乙二醇溶液對種子發(fā)芽的促進作用不同，低于或高于適宜濃度的處理，都會導(dǎo)致植物種子萌發(fā)受到限制[14-17]。采用了5種不同濃度的赤霉素溶液、高錳酸鉀溶液及聚乙二醇溶液處理紅花瘤果茶種子，結(jié)果表明，濃度為200 mg·L-1的赤霉素溶液不僅能促進紅花瘤果茶種子的提前萌發(fā)，還能顯著提高紅花瘤果茶種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢。但是，采用不同濃度的高錳酸鉀溶液和聚乙二醇溶液處理后，并不能提高紅花瘤果茶種子的發(fā)芽率，甚至在某種程度上抑制了紅花瘤果茶的萌發(fā)。因此，要提高紅花瘤果茶種子的發(fā)芽率，濃度為200 mg·L-1的赤霉素溶液處理效果最好。

3.3種子在萌發(fā)過程中，營養(yǎng)物質(zhì)主要來源于其儲藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與利用，主要包括可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、淀粉及脂肪[17-19]。在不同溫度條件下，1)紅花瘤果茶種子可溶性蛋白質(zhì)在種子萌發(fā)初期呈上升趨勢，隨后逐漸下降，種子萌發(fā)前期需要進行可溶性蛋白質(zhì)的積累，為后續(xù)種子胚芽和胚根的生長提供能量，在25 ℃時，紅花瘤果茶種子可溶性蛋白質(zhì)下降速率最快，種子內(nèi)部生理代謝快，種子發(fā)芽率和發(fā)芽率較15 ℃和35 ℃高；2)紅花瘤果茶種子可溶性糖含量呈先下降后升高的趨勢，發(fā)芽初期主要由可溶性糖為種子的萌動提供能量，發(fā)芽后期種子內(nèi)部的淀粉和脂肪開始分解利用，產(chǎn)生了可溶性糖的積累[9]，種子內(nèi)可溶性糖含量上升。其中15 ℃下，紅花瘤果茶種子內(nèi)可溶性糖含量的消耗速度和積累速度均高于25 ℃和35 ℃，表明在低溫條件下，紅花瘤果茶種子可溶性糖在種子萌發(fā)的初期比后期消耗快；3)紅花瘤果茶種子丙二醛含量均呈現(xiàn)不同程度的上升，其中35 ℃下，丙二醛含量上升最多最快，其次是15 ℃和25 ℃條件下，種子丙二醛含量上升最少，上升速率較慢，丙二醛對種子的毒害作用最小，因此發(fā)芽率也最高。但是，在溫度一定時，不同的光照時間對紅花瘤果茶種子內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖及丙二醛含量無顯著影響，在種子萌發(fā)過程中相應(yīng)的變化趨勢與25 ℃條件下基本一致，實驗表明光照對紅花瘤果茶種子的萌發(fā)過程無顯著影響，因此紅花瘤果茶種子可歸屬于光中性種子[20]。