袁海濤,崔建楠,彩 花,馮麗平,王 紅,郭長山,吳金泉,劉偉雙,曲振紅,蔡洪濤

布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病),是由布魯氏菌屬(Brucella)的細(xì)菌引起的一種人獸共患病。布病給流行國家和地區(qū)造成經(jīng)濟(jì)損失并危害人類健康[2]。2018年興安盟地區(qū)人間布病發(fā)病人數(shù)和發(fā)病率均居于內(nèi)蒙古自治區(qū)各盟市首位,布病防控工作形勢嚴(yán)峻,目前對內(nèi)蒙古興安盟地區(qū)布病患者的感染菌種型及細(xì)菌對常用藥物的敏感性的研究,尚未見報(bào)道。該研究選擇興安盟布病發(fā)病率較高的3個(gè)旗縣和1個(gè)人口密集的旗縣分離的布魯氏菌,明確布魯氏菌流行的主要種型,了解菌株的耐藥菌譜,為臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料與試劑

1.1 菌株來源 28株布魯氏菌是2018年5月-12月,從興安盟地區(qū)200名布病患者血樣中分離培養(yǎng)獲得,其中科右中旗9株,突泉縣8株,科右前旗6株,烏蘭浩特市4株,扎賚特旗1株。3株標(biāo)準(zhǔn)菌株羊16M、牛544A、豬1330S來源中國疾病預(yù)防控制中心;藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213,來源于溫州市康泰生物科技有限公司。

1.2 試劑 布氏瓊脂肉湯(批號(hào)8129671)由美國BD公司生產(chǎn),布氏瓊脂(批號(hào)7121860)由美國BD公司生產(chǎn),32GN陰性桿菌鑒定卡(批號(hào)2410565203)由法國梅里埃公司生產(chǎn),BCSP31基因的PCR檢測試劑(批號(hào):EB05KAC422),由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,布魯氏菌鑒定用用噬菌體Tb、Tb104RTD、BK2,單項(xiàng)特異性血清A和M由中國疾病預(yù)防控制中心提供,藥敏板包括13種抗生素:鏈霉素、多西環(huán)素、利福平、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、氧氟沙星、莫西沙星、妥布沙星、慶大霉素,由溫州市泰康生物科技有限公司生產(chǎn)(批號(hào)RL14140)。藥敏試驗(yàn)使用肉湯微量稀釋MIC法,試驗(yàn)程序和結(jié)果判讀按臨床和美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)制定的抗菌藥物敏感性執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3 樣本的采集、培養(yǎng)和分離 病人樣本的采集:無菌方法用BD BACTEC血培養(yǎng)瓶采集疑似布病病人血液樣本8～10 mL,置于美國BD FX-40全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)7 d,當(dāng)細(xì)菌生長時(shí)自動(dòng)提示,若無細(xì)菌生長,血培養(yǎng)瓶高壓處理。將陽性血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液接種于血平皿上,至37℃溫箱中培養(yǎng)2 d后觀察和分離典型菌落。

1.4 布魯氏菌的鑒定

1.4.1 顯微鏡檢查 將可疑菌落涂片用甲醛固定后進(jìn)行革蘭染色,用油鏡觀察。

1.4.2 布魯氏菌屬的鑒定[3]生化鑒定:將純菌配置成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?使用32GN陰性桿菌鑒定卡,通過VITEK2 COMPACT全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。分子生物學(xué)鑒定:用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的BCSP31基因的PCR方法[4],在屬的水平上檢測和鑒定布魯氏菌菌株。ABT PCR毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測。

1.4.3 布魯氏菌種型的鑒定 通過染料抑制試驗(yàn)(染料濾紙片方法)、CO2需求試驗(yàn)、H2S生成試驗(yàn)、單因子血清凝集試驗(yàn)(A和 M)、噬菌體Tb、Tb104RTD、BK2裂解實(shí)驗(yàn)鑒定布魯氏菌的生物種型。

1.5 藥敏試驗(yàn)[5-7]

1.5.1 方法依據(jù) 采用2018CLSI-M100-S28和WST 639-2018推薦的肉湯微量稀釋法。使用不含添加劑的布魯氏肉湯p H7.0±0.2。

1.5.2 試驗(yàn)方法 無菌操作,選取布氏瓊脂平板上純培養(yǎng)菌落,被測菌株和相應(yīng)質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213配制0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?作為初始接種物菌懸液。制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液,經(jīng)1∶200稀釋后,向每孔中加100μL(最終接種物濃度約為5×104CFU/mL),密封后置35℃普通空氣孵箱中,孵育48 h觀察結(jié)果。以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。當(dāng)陽性對照孔(即不含抗生素)內(nèi)細(xì)菌明顯生長試驗(yàn)成立。記錄抑制細(xì)菌生長的最高藥物濃度MIC值。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)和分離 200份血培養(yǎng)瓶28份儀器報(bào)警陽性,28份樣本在血平皿上生長為較小,灰色,圓形,稍隆起,邊緣整齊,不溶血的小菌落。

2.2 鑒定結(jié)果

2.2.1 顯微鏡檢查 28株菌革蘭染色,油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)為陰性球桿菌、染色弱、細(xì)沙樣。

2.2.2 生化鑒定 28株菌經(jīng) VITEK2 COMPACT全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定均為布魯氏菌屬(表1)。

表1 28株布魯氏菌生化鑒定結(jié)果Tab.1 Biochemical identification results of Brucella(28 strains)

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 28株菌經(jīng)BCSP31-PCR擴(kuò)增后,用毛細(xì)管電泳均有清晰的約223 bp大小的基因片段。

2.2.4 種型鑒定 用傳統(tǒng)經(jīng)典的方法進(jìn)行種型鑒定,28株布魯氏菌H2S試驗(yàn)、Tb噬菌體裂解試驗(yàn)、Tb104RTD噬菌體裂解試驗(yàn)均為陰性,Bk2噬菌體裂解試驗(yàn)、硫堇抑菌試驗(yàn)、復(fù)紅抑菌試驗(yàn)均為陽性,通過試驗(yàn)判定28株菌均為布魯氏菌羊種。進(jìn)一步通過A M R血清凝集鑒定羊布魯氏菌的菌型(表2),結(jié)果顯示:羊種布魯氏菌為興安盟主要的流行株,其中羊種3型最多(64.29%),羊種1型其次(35.71%),見表2。

2.2.5 藥敏結(jié)果 本研究對28株布魯氏菌分離株中的25株菌(3株菌送中國疾控中心,未留藥敏試驗(yàn)菌株)進(jìn)行了體外藥物敏感性研究,按照CLSI規(guī)定的MIC的結(jié)果判定方法,本次使用的藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213,對各藥物的MIC檢測值在CLSI規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控值允許的范圍內(nèi)。

表2 28株布魯氏菌種型鑒定結(jié)果Tab.2 Species identification of Brucella(28 strains)

25株菌均分離自病人血液樣本;初診患者占78.57%(22/28),臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)疼痛、頭痛、乏力居多;75.00%(21/28)的患者就診前無用藥史,25.00%(7/28)的患者就診前用過左氧氟沙星、頭孢曲松或中蒙藥等藥物治療,見表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明25株布魯氏菌對阿奇霉素、復(fù)方新諾明耐藥菌株數(shù)分別為100%(25/25)和20.0%(5/25);部分菌株對利福平、頭孢曲松的藥物敏感性降低[10],均為16%(4/25)。所有菌株對多西環(huán)素、四環(huán)素、慶大霉素、鏈霉素均表現(xiàn)為敏感,妥布霉素、卡那霉素找到或未在文獻(xiàn)中搜索到判定標(biāo)準(zhǔn),其檢測的MIC值僅為相關(guān)研究提供一些參考。

3 討 論

由于布魯氏菌的致病性以及既往實(shí)驗(yàn)室感染的報(bào)道,所有標(biāo)本的處理均應(yīng)在二級(jí)及以上級(jí)別的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行,疑似布魯氏菌涂片染色前要用甲醛固定(以殺滅布氏菌)再進(jìn)行涂片[1]。

本研究分離布魯氏菌28株經(jīng)VITEK2COMPACT全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定均為布魯氏菌屬。全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定速度快,可靠性較高,確定布魯氏菌屬的鑒定指標(biāo)為L-脯氨酸芳胺酶(Pro A)、酪氨酸芳胺酶 (Tyr A)、尿素酶(URE)、氨基乙酸芳胺酶(Gly A);區(qū)分羊種布氏菌的指標(biāo)為ELLMAN(ELLM)[3]。

鑒于目前,仍沒有一種PCR方法可以將所有的布魯氏菌鑒定到型[8],本研究所有布魯氏菌菌株的分型均基于傳統(tǒng)的微生物方法(生長、產(chǎn)尿素酶和硫化氫、對染料堿性品紅和硫蛋白的敏感性以及噬菌體Tiblissi和 Weybridge的分解)[9]。傳統(tǒng)的微生物方法對布魯氏菌種型鑒定方法對布魯氏菌進(jìn)行生物種型鑒定,證實(shí)羊種布魯氏菌為興安盟主要的流行株,其中羊種3型最多(64.29%),其次是羊種1型(35.71%)。與2018年內(nèi)蒙古烏蘭察布市地區(qū)布魯氏菌分型特征相似,其研究共分離布魯氏菌116株,其中115株分離自人血,1株分離自羊脾;經(jīng)3種方法鑒定全部為羊種布魯氏菌,其中羊3型94株,羊1型22株;菌株分布于烏蘭察布市境內(nèi)的11個(gè)旗(縣、市、區(qū))及周邊的內(nèi)蒙古錫林郭勒盟、山西省大同市郊和河北省尚義縣等地[10]。

本次研究的內(nèi)蒙古興安盟地區(qū)布魯氏菌流行株對一線方案藥物多西環(huán)素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素敏感;部分菌株對利福平、頭孢曲松的藥物敏感性下降,國外有文獻(xiàn)報(bào)道,布魯桿菌對利福平的敏感性降低,我國尚無關(guān)于耐藥性的大規(guī)模研究[1]。由于CLSI尚未確定布魯氏菌種MIC的折點(diǎn),這些菌株不能自信地描述為中間抗性,盡管可能存在易感性降低。利福平的MIC值在1到4 mg/L之間已經(jīng)報(bào)道過。SXT也得到了類似的結(jié)果[9]。本研究根據(jù)CLSI慢生細(xì)菌的解釋標(biāo)準(zhǔn),4株對利福平的MIC值為1.6 mg/L,為藥物敏感性降低的菌株;25株菌對阿奇霉素全部耐藥,這與2011年中國疾病預(yù)防控制中心對國內(nèi)分離的69株羊種布氏菌進(jìn)行12種抗生素的體外敏感性研究中對阿奇霉素、克拉霉素全部耐藥的報(bào)告一致[5]。部分菌株對復(fù)方新諾明耐藥,與2018年內(nèi)蒙古烏蘭察布地區(qū)的臨床常用藥物的敏感性研究一致,其實(shí)驗(yàn)表明布魯氏菌對阿奇霉素、利福平和復(fù)方新諾明耐藥菌株數(shù)分別為100%(85/85),1.0%(1/85)和7.0%(6/85)[10]。不同的是,根據(jù)CLSI慢生細(xì)菌的解釋標(biāo)準(zhǔn),本研究中的4株菌對頭孢曲松的MIC值為4.0 mg/L,可能為藥物敏感性降低的菌株。我國是抗菌藥物應(yīng)用大國,耐藥性問題不容忽視,有待較大規(guī)模的調(diào)查以明確我國布魯氏菌的耐藥現(xiàn)狀。

表3 25株布魯氏菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 drug sensitivity test of Brucella(25 strains)

利益沖突:無

引用本文格式:袁海濤,崔建楠,彩花,等.內(nèi)蒙古興安盟地區(qū)布魯氏菌流行株種型鑒定和體外藥物敏感性分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(9):826-830.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.102