謝鳳行，周 可，張峰峰，趙 瓊，趙玉潔，楊建永，孫麗麗

（天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，天津 300384）

小球藻是綠藻門（Chlorophyta）小球藻屬（Chlorella）的一種普生性單細(xì)胞綠藻，在自然界分布廣泛，它能利用光能自養(yǎng)，也能在異養(yǎng)條件下利用有機(jī)碳源進(jìn)行生長繁殖，易于人工培養(yǎng).小球藻的粗蛋白含量很高，占干重的50%以上，還富含不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、蝦青素和多種維生素等[1].由于小球藻營養(yǎng)價值全面且均衡，因此被廣泛應(yīng)用于保健食品[2]、天然產(chǎn)物類胡蘿卜素[3]、水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料[4]、畜牧飼料添加劑[5]等多個領(lǐng)域.隨著名優(yōu)特水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，在引種馴化、幼苗繁殖過程中，幼苗的開口餌料生產(chǎn)是關(guān)鍵環(huán)節(jié).小球藻的蛋白質(zhì)含量高，含動物體所需的20 種氨基酸、多種維生素和微量元素，以及亞麻酸、亞油酸、胡蘿卜素等，營養(yǎng)成分豐富均衡，可直接作為魚、蝦、貝類的優(yōu)質(zhì)餌料[6]，促進(jìn)養(yǎng)殖生物的生長[7].小球藻還能降解水體中的亞硝酸鹽、氨氮、硝酸鹽和磷酸鹽[8-11]，從而有效凈化養(yǎng)殖水體.

小球藻的生長周期相對較長，生物量低，限制了它的規(guī)模生產(chǎn)和推廣應(yīng)用.雖然有研究通過優(yōu)化小球藻生長所需的碳、氮、磷含量提高了小球藻的生長速率和生物量[12]，但多數(shù)是在實(shí)驗(yàn)室無菌條件下進(jìn)行，不適宜在生產(chǎn)上大規(guī)模推廣應(yīng)用.本研究首先在無菌條件下對小球藻培養(yǎng)基成分進(jìn)行篩選，采用正交實(shí)驗(yàn)方法對主成分含量加以優(yōu)化，以此為基礎(chǔ)，在開放培養(yǎng)條件下進(jìn)行改良和放大實(shí)驗(yàn)，并研究了小球藻對高濃度氮的去除效果，為開發(fā)小球藻應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料及高氮污水處理提供技術(shù)支撐.

1 材料和方法

1.1 材料

藻種：藻種為本實(shí)驗(yàn)室從魚蝦混養(yǎng)池中分離保存，將小球藻藻種從試管斜面上接種至改良的DS 培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)，再從平板中挑取單藻落至液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期作為藻種，藻細(xì)胞濃度約為4.0×106CFU/mL.

本實(shí)驗(yàn)室改良的 DS 培養(yǎng)基（L-1）：0.3 g（NH2）2CO、0.05 g KH2PO4、0.3 g MgSO4·7H2O、0.008 g FeSO4·7H2O、1.0 g NaHCO3、0.3 g NH4Cl.

SE 培養(yǎng)基（L-1）：0.25 g NaNO3、0.175 g K2HPO4、0.075 g KH2PO4、0.025 g MgSO4·7H2O、0.025 g NaCl、0.025 g CaCl2·2H2O、0.005 g FeCl3·6H2O.

JM 培 養(yǎng)基（L-1）：0.93 g NaHCO3、0.46 g KNO3、0.02 g K2HPO4、0.4 g MgSO4·7H2O、0.06 mg VB1、1.8 μg VB12、2 μg 生物素.

BG11 培養(yǎng)基（L-1）：1.5 g NaNO3、0.036 g CaCl2·2H2O、 0.02 g Na2CO3、 0.075 g MgSO4·7H2O、 0.030 5 g K2HPO4、 0.004 g K2HPO4·3H2O、0.006 g 檸檬酸、0.006 g檸檬酸鐵氨、0.01 mg EDTANa2、1 mL A5 溶液、40 mL土壤浸提液.

ND 培養(yǎng)基（L-1）：1 g KNO3、0.237 g KH2PO4、0.088 g CaCl2·2H2O、0.04 g EDTA、0.03 g FeSO4·7H2O、0.204 g MgSO4·7H2O、1 mL A5 微量金屬溶液.

A5 溶液（L-1）：0.287 mg ZnSO4·7H2O、0.16 mg MnSO4·H2O、 0.061 mg H3BO3、 2.5 μg CuSO4·5H2O、1.24 μg（Na）2MoO24·7H2O.

不含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基（L-1）：0.3 g MgSO4·7H2O、0.008 g FeSO4·7H2O、0.75 g NaHCO3、0.03 g KH2PO4.

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對小球藻生長的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[2，13-15]，選用改良的 DS 培養(yǎng)基、SE 培養(yǎng)基、JM 培養(yǎng)基、BG11 培養(yǎng)基和 ND 培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基配制300 mL，分裝到250 mL 的三角瓶中，每瓶裝培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌20 min.接10 mL 藻種，25 ℃下光照培養(yǎng)，光暗比為14 ∶10，光照強(qiáng)度為3 500～4 500 lux，每天定時搖動3 次，培養(yǎng)7 d 后取樣.測量藻細(xì)胞濃度，篩選藻細(xì)胞濃度高的培養(yǎng)基配方.

1.2.2 不同糖濃度對小球藻生長的影響

配制改良DS 培養(yǎng)基2.1 L，分裝到250 mL 三角瓶中，每瓶裝培養(yǎng)基 100 mL，分別加入 0、1、2、3、4、5、6 g/L 葡萄糖，每個質(zhì)量濃度設(shè)3 個重復(fù)，115 ℃滅菌20 min，接 10 mL 藻種，25 ℃光照培養(yǎng)，光暗比為 14 ∶10，光照強(qiáng)度為 3 500～4 500 lux，每天定時搖動 3 次，4 d后取樣，測量藻細(xì)胞濃度.

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化小球藻培養(yǎng)基

選取改良的DS培養(yǎng)基的碳、氮、磷源，即（NH2）2CO（A）、NH4Cl（B）、KH2PO4（C）、NaHCO3（D）、葡萄糖（E）5 個因子，對每個因子設(shè)計(jì)4 個濃度梯度，采用L1645設(shè)計(jì)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，各因子的添加量和添加水平如表1 所示.培養(yǎng)基配好后分裝到250 mL 三角瓶中，每瓶裝培養(yǎng)基 100 mL，115 ℃滅菌 20 min，接藻種 10 mL，培養(yǎng)溫度為 25 ℃，光照強(qiáng)度為 3 500～4 500 lux，光暗比為14 ∶10，每天定時搖動3 次，培養(yǎng)4 d 后測量藻細(xì)胞濃度.對優(yōu)化的組合在三角瓶中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

表1 正交實(shí)驗(yàn)各因子的添加量Tab.1 Factors and levels of medium composition orthogonal test g/L

1.2.4 小球藻開放培養(yǎng)配方改良

在開放條件下對優(yōu)化的小球藻培養(yǎng)基配方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即用250 mL 三角瓶裝100 mL 未滅菌的培養(yǎng)基，敞口培養(yǎng).發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)2 d 后界面形成菌膜，可能是因?yàn)槠咸烟亲鳛橛袡C(jī)碳源利于原介質(zhì)中細(xì)菌生長.在培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，設(shè)置葡萄糖質(zhì)量濃度分別為 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 g/L，培養(yǎng)小球藻4 d 后取樣，測量藻細(xì)胞濃度和吸光度值.先在3.5 L 玻璃缸中對篩選的配方進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)小球藻3 d 后，轉(zhuǎn)接至65 L 的玻璃缸中放大培養(yǎng)，之后在1 000 L 玻璃槽和1 000 L 塑料袋中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，接種量均為 10%.采用自然光源，常溫（25～30 ℃）培養(yǎng)3～5 d，取樣測量藻細(xì)胞濃度.

1.2.5 小球藻對高濃度氮的去除效果

向不含氮和葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入氯化銨和硝酸鉀，使NH+4-N 和NO-3-N 的質(zhì)量濃度分別為100、200、300、400、500、750、1 000 mg/L，pH 值為 6.0.按10%的接種量接種，光照強(qiáng)度3 500～4 500 lux，25 ℃培養(yǎng).48 h 取樣，7 500 r/min 離心10 min.采用納氏試劑光度法[16]測量上清液的氨氮含量，采用酚二磺酸紫外分光光度法[16]測量上清液的硝酸鹽氮含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對小球藻生長的影響

小球藻在不同培養(yǎng)基中的生長情況如圖1 所示.

圖1 不同培養(yǎng)基對小球藻生長的影響Fig.1 Effects of different mediums on the growth of Chlorella sp.

由圖1（a）可以看出，小球藻在 JM 和 DS 培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度較高，分別達(dá)到8.73×106CFU/mL 和8.80×106CFU/mL，顯著高于其他 3 種培養(yǎng)基中的濃度，JM 和DS 培養(yǎng)基之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.小球藻含葉綠素，能利用太陽光照合成自身所需的能量物質(zhì)，也有研究報道，小球藻能利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長[20]，因此在篩選的JM 和DS 培養(yǎng)基中分別添加1～3 g/L 的葡萄糖進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn).由圖1（b）可以看出，在JM 和DS 培養(yǎng)基中添加一定量的葡萄糖可以促進(jìn)小球藻生長，在所設(shè)濃度范圍內(nèi)小球藻的濃度隨培養(yǎng)基中葡萄糖添加量的增加而升高，說明此株小球藻具有異養(yǎng)生長特性.小球藻在改良DS 培養(yǎng)基中的藻細(xì)胞濃度顯著高于JM 培養(yǎng)基中的濃度，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取改良的DS 培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻.

2.2 不同糖濃度對小球藻生長的影響

不同的葡萄糖濃度下小球藻的生長情況如圖2所示.由圖2 可以看出，小球藻的細(xì)胞濃度隨培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的升高而增大，葡萄糖質(zhì)量濃度為5 g/L和6 g/L 時，藻細(xì)胞濃度顯著高于其他處理，分別達(dá)到1.94×108CFU/mL 和 1.99×108CFU/mL，約為對照組的24 倍.葡萄糖的添加使小球藻生長實(shí)現(xiàn)倍增，說明該藻株可進(jìn)行異養(yǎng)生長.

圖2 不同糖濃度對小球藻生長的影響Fig.2 Effects of glucose concentration on the growth of Chlorella sp.

2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化小球藻的培養(yǎng)基成分

5 個營養(yǎng)因子的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示，方差分析如表3 所示.由表2 可以看出，各營養(yǎng)因子的不同配比對小球藻生長有顯著影響，藻細(xì)胞濃度變化范圍較大，為 6.2×107～20.2×107CFU/mL.對各處理組中小球藻的濃度進(jìn)行正交分析得知，利于小球藻生長的最佳組合為A1B3C2D1E3，即尿素的質(zhì)量濃度為0.2 g/L、氯化銨的質(zhì)量濃度為0.5 g/L、碳酸氫鈉的質(zhì)量濃度為0.75 g/L、磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為0.03 g/L、葡萄糖的質(zhì)量濃度為5 g/L.從極差大小分析可知，5 個因子對小球藻影響的程度依次為葡萄糖＞碳酸氫鈉＞尿素＞氯化銨＞磷酸二氫鉀.由方差分析可以看出，除磷酸二氫鉀外其他4個因素對小球藻的生物量均有顯著影響（P ＜ 0.05）.

表2 培養(yǎng)基優(yōu)化直觀分析結(jié)果Tab.2 Intuitive analysis results of the medium composition orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis

由于所選組合不在實(shí)驗(yàn)所設(shè)的16 個組合內(nèi)，因此對其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明，在優(yōu)化的組合下培養(yǎng)4 d 后，小球藻藻細(xì)胞濃度達(dá)到2.15×108CFU/mL，為優(yōu)化前的26 倍，所選組合得到了成功驗(yàn)證.

2.4 小球藻開放培養(yǎng)配方的改良

開放培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對小球藻生長的影響如圖3 所示.

圖3 開放條件下不同糖濃度對小球藻生長的影響Fig.3 Effects of glucose concentration on the Chlorella sp.growth in open condition

由圖3 可以看出，開放培養(yǎng)條件下，小球藻細(xì)胞濃度隨葡萄糖含量呈先升后降的趨勢，葡萄糖質(zhì)量濃度為0.3 g/L 時，藻細(xì)胞濃度達(dá)到9.9×107CFU/mL，顯著高于其他處理，是不加糖處理的12 倍.培養(yǎng)基中的葡萄糖不僅能給小球藻提供碳源，同時也是多數(shù)細(xì)菌的優(yōu)質(zhì)碳源，在開放條件下培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度超過0.5 g/L 時，滋生的細(xì)菌對小球藻生長產(chǎn)生一定的抑制作用.因此，開放培養(yǎng)條件下葡萄糖的適宜添加量為0.3 g/L.

篩選的小球藻開放培養(yǎng)配方在3.5 L 玻璃缸、65 L玻璃缸、1 000 L 玻璃槽和1 000 L 塑料袋中得到了成功放大，藻細(xì)胞濃度為 6.5×107～9.8×107CFU/mL，是不加糖培養(yǎng)基中藻細(xì)胞濃度的10 倍左右.此方法無需特殊裝置，無需滅菌，適合大面積推廣應(yīng)用.

2.5 小球藻對氨氮的去除效果

小球藻對培養(yǎng)基中氨氮的去除效果如圖4 所示.

圖4 小球藻對氨氮去除效果Fig.4 NH4+-N removal efficiency of the Chlorella sp.

由圖4 可看出，在所試濃度范圍內(nèi)小球藻對氨氮去除率比較接近，在71%～81%之間，但對氨氮的絕對去除量隨著底物濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢.當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為100 mg/L 時，小球藻對氨氮的去除量為71 mg/L，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為1 000 mg/L 時，小球藻對氨氮的去除量達(dá)到787 mg/L，去除速率達(dá)到16.4 mg/（L·h）.這可能是因?yàn)樾∏蛟逄幱谕⒌膶?shù)生長期，培養(yǎng)基中的氯化銨作為氮源被小球藻快速利用.3.40 mg/L；周連寧等[20]模擬小球藻污水脫氮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氨氮質(zhì)量濃度低于35 mg/L 時，小球藻的脫氮率為78%.

2.6 小球藻對硝酸鹽氮去除效果

小球藻對培養(yǎng)基中硝酸鹽氮的去除效果如圖5所示.

圖5 小球藻對硝酸鹽氮去除效果Fig.5 NO-3-N removal efficiency of the Chlorella sp.

由圖5 可以看出，小球藻對硝酸鹽氮的去除率和去除量均隨底物濃度的升高呈上升趨勢，去除率在61.4%～85.6%之間.底物質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 時，小球藻對硝酸鹽氮的絕對去除量達(dá)到855.8 mg/L，去除速率達(dá)到17.8 mg/（L·h）.硝酸鹽是小球藻培養(yǎng)基常用的氮源，硝酸鹽氮的去除大部分也是因?yàn)樾∏蛟宓纳L消耗所致.

3 討論與結(jié)論

小球藻可以利用CO2或碳酸鹽進(jìn)行自養(yǎng)生長，部分藻種也可利用有機(jī)碳源進(jìn)行混養(yǎng)生長或異養(yǎng)生長.孔維寶等[15]的研究表明，葡萄糖的添加顯著促進(jìn)了小球藻生物量的積累，且混養(yǎng)培養(yǎng)的生物量接近自養(yǎng)和異養(yǎng)生物量之和，因此提出混養(yǎng)是最佳的藻細(xì)胞培養(yǎng)方式.本研究在無菌培養(yǎng)條件下，添加5 g/L 的葡萄糖混養(yǎng)培養(yǎng)，其藻細(xì)胞濃度達(dá)到2.15×108CFU/mL，是自養(yǎng)培養(yǎng)的26 倍；在開放培養(yǎng)條件下，添加0.3 g/L的葡萄糖混養(yǎng)培養(yǎng)，藻細(xì)胞濃度也達(dá)到9.9×107CFU/mL，是自養(yǎng)培養(yǎng)的12 倍.這說明本研究中的藻株混養(yǎng)培養(yǎng)優(yōu)于自養(yǎng)培養(yǎng).

碳和氮是細(xì)胞原生質(zhì)結(jié)構(gòu)中的重要組成成分，對細(xì)胞的生長代謝活動具有重要意義，磷是小球藻正常生長所需元素之一.保持培養(yǎng)基中合適的碳、氮、磷比例，可使培養(yǎng)基中的氮、磷完全去除[23].本研究對培養(yǎng)基中的碳、氮、磷成分進(jìn)行了正交優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)尿素的質(zhì)量濃度為0.2 g/L、 氯化銨的質(zhì)量濃度為0.5 g/L、碳酸氫鈉的質(zhì)量濃度為0.75 g/L、 磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為0.03 g/L、葡萄糖的質(zhì)量濃度為5 g/L 時利于小球藻生長，且在所試的濃度范圍內(nèi)，葡萄糖、碳酸氫鈉、尿素對小球藻的生長有顯著影響，影響因子大小依次為葡萄糖＞碳酸氫鈉＞尿素＞氯化銨.小球藻培養(yǎng)中常用的有機(jī)碳源有葡萄糖、乙酸鈉、各種有機(jī)酸等，常用的氮源有 KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4和尿素等，各種形態(tài)的碳、 氮對小球藻混養(yǎng)生長的影響不盡相同.研究表明，在混養(yǎng)情況下，混合氮源更能滿足小球藻生長的需求[18].本研究培養(yǎng)基中含有機(jī)和無機(jī)碳、氮源，在無菌條件下培養(yǎng)的最終藻細(xì)胞濃度可達(dá)到億級每毫升，高于已有報道[1，15]，進(jìn)一步證明了混合培養(yǎng)有利于小球藻生長.已有關(guān)于小球藻培養(yǎng)基優(yōu)化的研究均是在無菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)基需要滅菌，生產(chǎn)需要特殊的設(shè)備，不利于推廣應(yīng)用.本研究不僅在無菌條件下對培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，而且在開放條件下對無菌優(yōu)化的配方進(jìn)行了改良，在其他成分不變的情況下，葡萄糖質(zhì)量濃度降為0.3 g/L，利用自然光照，常溫培養(yǎng)3～5 d，藻細(xì)胞濃度也達(dá)到了千萬級，且不需要特殊設(shè)備.

微生物原位修復(fù)脫氮相對于其他生物修復(fù)技術(shù)具有見效快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，而單細(xì)胞藻類由于自身能利用無機(jī)氮源作為生長繁殖的物質(zhì)，且能高密度培養(yǎng)，是污水處理脫氮常用的微生物資源.劉娥等[19]固定化小球藻7 d 可將養(yǎng)殖廢水中10 mg/L 的氨氮降至本研究中的小球藻藻株對氨氮和硝酸鹽氮的去除率也較高，分別為71%～81%和61.4%～85.6%，說明該藻株可用于有機(jī)質(zhì)含量豐富、氮濃度高的污水脫氮.