印熙娣，陳 瑾，戈 靖，董智雄，4，朱長軍，4

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3.中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所 中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 200031；4.天津師范大學(xué)分子細胞系統(tǒng)生物學(xué)重點實驗室，天津 300387）

核仁（Nucleolus）是真核細胞內(nèi)無膜包被的亞細胞結(jié)構(gòu)，是真核細胞核糖體生物發(fā)生的場所.核仁通過控制核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成調(diào)控細胞的生長、增殖、分化、代謝及應(yīng)激等各項基本生命活動，核糖體生物發(fā)生的異常會引發(fā)貧血癥、腫瘤等多種人類疾病[1-4].核糖體RNA 加工蛋白15（Ribosome RNA processing protein 15，RRP15）的 cDNA 序列全長有849 個核苷酸，編碼283 個氨基酸，相對分子質(zhì)量約為45×103.RRP15 蛋白在生物進化中高度保守，如在酵母中，RRP15p 參與核糖體60S 大亞基的生物發(fā)生[5]；在小鼠中，RRP15 可以調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞凋亡，并在核糖體RNA 加工中發(fā)揮重要作用[6].有研究表明[7-8]，RRP15 集中定位于核仁，散布于細胞質(zhì).RRP15 除了參與pre-RNA剪切加工以外，還參與調(diào)控rDNA 轉(zhuǎn)錄，抑制RRP15表達可導(dǎo)致細胞內(nèi)47S pre-rRNA 明顯降低，干涉掉RRP15后核仁出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，核仁結(jié)構(gòu)遭到破壞.RRP15缺失會引起嚴重的核糖體壓力（Ribosome stress），導(dǎo)致p53 功能正常的非轉(zhuǎn)化二倍體細胞RPE1 的細胞周期阻滯在G1-G1/S 期，而p53 功能缺陷的腫瘤細胞HeLa和MCF7 阻滯在S-G2/M 期，最終走向凋亡[7-8].這些研究結(jié)果暗示RRP15 可能作為一個腫瘤治療的靶標，應(yīng)用于治療p53 缺陷腫瘤.通過Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，RRP15 在宮頸鱗癌中的表達量明顯高于正常子宮頸組織中的表達量.

以往研究多針對RRP15 表達缺失對腫瘤發(fā)生的影響，RRP15 過表達對核糖體生物發(fā)生及細胞生長增殖等的影響還不清楚.為此，本研究構(gòu)建RRP15 過表達的人宮頸癌細胞HeLa 穩(wěn)篩細胞株及其對照細胞株，利用細胞免疫熒光、核糖體前體提取、MTT 以及蛋白免疫印跡等技術(shù)，研究RRP15 過表達對Hela 細胞的核仁結(jié)構(gòu)、核糖體生物發(fā)生、細胞生長增殖等的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

人宮頸癌細胞株HeLa，購自美國模式菌種收集中心（ATCC）；pFlag、pFlag-RRP15 質(zhì)粒為本實驗室所有.

1.1.2 試劑

DMEM 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司；胎牛血清，美國Hyclone 公司；Opti-MEM、Lipofectamine 3000、P3000、熒光標記或辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗和DAPI，美國 Thermo Fisher Scientific 公司；特異性鼠抗α-Tubulin 單克隆抗體、特異性鼠抗Flag 單克隆抗體，美國Sigma 公司；特異性兔抗RRP15 多克隆抗體，由實驗室自制；特異性鼠抗UBF 單克隆抗體，美國Santa Cruz 公司；特異性鼠抗Nucleolin 單克隆抗體，英國 Abcam 公司；新霉素（G418），德國 Calbiochem 公司；NP-40、 二甲基亞砜，北京索萊寶科技有限公司；MTT，上海碧云天生物技術(shù)有限公司.

1.1.3 儀器

蛋白電泳儀、 酶標儀，美國Bio-Rad 公司；Nikon TS-100 FL 倒置熒光顯微鏡，日本Nikon 公司；超聲波細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；5417R 高速離心機，德國 Eppendorf 公司；Optima L-80 XP 超速離心機，美國貝克曼公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific 公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代

用含有胎牛血清（體積分數(shù)為10%）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌細胞株HeLa，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).2～3 d 后觀察細胞匯合度達到80%～90%，即可用含有EDTA（質(zhì)量分數(shù)為0.02%）的胰酶消化處理進行傳代培養(yǎng).

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染

在 24 孔板中，每孔加入 500 μL 的 DMEM 培養(yǎng)基，接種2×104個HeLa 細胞，混勻后置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.按照說明書采用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染0.2 μg 的 pFlag-RRP15 或 pFlag 質(zhì)粒.混勻后置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h.

1.2.3 G418 篩選

細胞轉(zhuǎn)染24 h 后，用胰酶進行消化，收集細胞后轉(zhuǎn)移到10 cm 的培養(yǎng)皿中，每皿中加入含G418（750 μg/mL）的 DMEM 培養(yǎng)基.培養(yǎng) 5 d 后，更換新鮮的含G418 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).10 d 后在倒置熒光顯微鏡下挑取細胞單克隆，置于24 孔板中培養(yǎng)，待細胞生長擴增后轉(zhuǎn)移至10 cm 培養(yǎng)皿中繼續(xù)擴增培養(yǎng).

1.2.4 蛋白免疫印跡雜交（Western blot）

收集細胞，用1×Sample Buffer 裂解，所得裂解液進行SDS-PAGE 電泳，之后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜.用含有質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉的TBS 緩沖液室溫封閉30 min.隨后室溫一抗孵育2 h，二抗孵育1 h，最后加入ECL顯色液，室溫孵育2 min.暗室曝光，檢測目的條帶.

1.2.5 細胞免疫熒光（Immunofluorescence，IF）

向鋪有細胞爬片的35 mm 平板中接種1.5×105個細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.取出爬片，每板用1 mL 的PBS 洗3 次.之后后用3 mL 福爾馬林固定液室溫固定細胞15 min，棄去固定液，用PBS 洗3 次，再用含有0.1 mol/L 甘氨酸的PBS 終止固定反應(yīng).加入100 μL 封閉液室溫封閉30 min，棄去封閉液.用含有Triton X-100（質(zhì)量分數(shù)為 0.1%）的 PBST 洗 3 次.隨后一抗室溫孵育2 h，熒光標記的二抗室溫避光孵育1 h，再用 1 μg/mL 的 DAPI 染色 3 min.封片，鏡檢.

1.2.6 核糖體前體提取

分別將3.7 mL 的質(zhì)量分數(shù)為30%、20%和10%的蔗糖依次緩慢加入到超速離心管（14 mm×89 mm）內(nèi)，使用 SW41 Ti 轉(zhuǎn)子在 4 ℃、 230 000 r/min 下離心 3 h，建立提取核糖體前體所需的連續(xù)蔗糖密度梯度.用刮刀輕輕刮下 HeLa 細胞（3×106），收集到離心管中，4 ℃、500 r/min 下離心 5 min，用冰冷的 PBS 洗 3 次.用 2 mL低鹽緩沖液（LSB）輕柔重懸細胞，冰上靜置10 min，4 ℃、500 r/min 下離心 5 min.再用 2 mL LSB+（含蛋白酶抑制劑）重懸沉淀，補加66 μL 體積分數(shù)為10%的NP-40 和44 μL 體積分數(shù)為10%的脫氧膽酸鈉，劇烈震蕩 30 s，4 ℃、1 000 r/min 下離心 5 min.用 2 mL 的LSB+重懸沉淀，4 ℃、1 000 r/min 下離心 5 min.用500 μL 超聲裂解緩沖液重懸沉淀，用15%的功率超聲裂解細胞核，超聲 1 s 停止 10 s，超聲 3～5 次，4 ℃、15 000 r/min下離心15 min.將上清小心加入到已建立好的連續(xù)蔗糖密度梯度上，4 ℃、230 000 r/min 下離心3 h.

在離心后的離心管底部打適當大小的孔，將樣品以等體積的量（600～700 μL）收集到 1.5 mL 離心管中.檢測260 nm 處的吸光值A(chǔ)260確定RNA 含量，從而確定核糖體前體在每一管中的豐度大小.根據(jù)測量得到的每一管樣品的A260繪制相對應(yīng)的曲線圖.

1.2.7 MTT 實驗

在96 孔板中每孔接種3 000 個細胞，每種細胞5 個重復(fù).待細胞貼壁完成后，每孔加入20 μL 體積分數(shù)為0.5%的MTT 溶液，37 ℃避光培養(yǎng)4 h 后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液.每孔加入100 μL 二甲基亞砜（DMSO），37 ℃孵育30 min，用酶標儀檢測492 nm波長下每孔的吸光值.

2 結(jié)果與分析

2.1 HeLa-Flag RRP15過表達穩(wěn)篩細胞株的構(gòu)建

通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和G418 篩選，收集挑選的陽性克隆細胞并進行裂解，利用Western blot 檢測細胞內(nèi)源和外源的RRP15 表達水平.在所挑選的18 個克隆中，有6 個克隆表達外源性Flag-RRP15 蛋白，其中，6#克隆表達的外源性Flag-RRP15 蛋白與內(nèi)源性RRP15 水平相近，如圖1（a）所示.經(jīng)過灰度值測定得出，外源RRP15 的表達量是內(nèi)源的1.13 倍；而對照細胞（HeLa-Flag）不表達外源性Flag-RRP15 蛋白.

為進一步確定篩選的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中外源性Flag-RRP15 蛋白在細胞內(nèi)的定位，利用純化的兔抗RRP15 抗體和鼠抗Flag 抗體對細胞進行免疫熒光染色，結(jié)果如圖1（b）所示.在低倍鏡下，HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 細胞均可以被Flag 染色，表明所有細胞均表達了外源性蛋白；在高倍鏡下，對照細胞HeLa-Flag 中Flag 染色均勻分散在整個細胞中，無特異性定位，而Flag-RRP15 過表達細胞株中Flag（外源性Flag-RRP15）與內(nèi)源性RRP15 共定位，主要集中定位于核仁，少量散布于細胞質(zhì)中，與本課題組的前期報道一致[8].由此證實，穩(wěn)定過表達外源Flag-RRP15的細胞株構(gòu)建成功.

圖1 RRP15 過表達穩(wěn)篩細胞株的鑒定Fig.1 Establishment of the RRP15-overexpressed stable cell lines

2.2 RRP15過表達對細胞核仁結(jié)構(gòu)的影響

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，干涉細胞內(nèi)RRP15 的表達后，核仁結(jié)構(gòu)被破壞，核仁定位的蛋白質(zhì)出現(xiàn)彌散現(xiàn)象[8]，但是RRP15 過表達對核仁的影響并不明確.因此利用構(gòu)建的HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 細胞株，分析RRP15 過表達對核仁產(chǎn)生的影響，結(jié)果如圖2 所示.

圖2 過表達RRP15 對核仁的影響Fig.2 Effect of RRP15 overexpression on nucleolus

HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 細胞分別固定后，利用鼠抗nucleolin 抗體分別對2 種細胞進行染色，結(jié)果如圖2（a）所示.由圖2（a）可以看出，RRP15 過表達后，Hela-Flag RRP15 細胞內(nèi)核仁的數(shù)量明顯增加.對HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 細胞的核仁數(shù)量進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖2（b）所示.由圖2（b）可以看出，HeLa-Flag RRP15 細胞的核仁數(shù)量顯著超過HeLa-Flag 細胞的核仁數(shù)量，與免疫熒光檢測的結(jié)果一致.檢測核仁相關(guān)蛋白的表達水平，結(jié)果如圖2（c）所示，RRP15 過表達導(dǎo)致細胞內(nèi)核仁相關(guān)蛋白（Nucleolin 和UBF）的表達水平顯著升高.這些結(jié)果均表明，RRP15 的過表達可導(dǎo)致細胞內(nèi)的核仁數(shù)量顯著增加.

2.3 RRP15過表達對核糖體生物發(fā)生的影響

通過蔗糖密度梯度離心方法分別提取HeLa-Flag和HeLa-Flag RRP15 細胞中的核糖體大小亞基前體，分析RRP15 過表達對2 種細胞核糖體生物發(fā)生的影響，結(jié)果如圖3 所示.由圖3 可以看出，RRP15 過表達后，與 Hela-Flag 細胞相比，Hela-Flag RRP15 細胞的核糖體大亞基前體（pre-60S）和核糖體小亞基前體（pre-40S）的水平均明顯提高，這一結(jié)果表明RRP15 過表達明顯促進了細胞的核糖體生物發(fā)生.

圖3 RRP15 過表達對核糖體生物發(fā)生的影響Fig.3 Effect of RRP15 overexpression on ribosome biogenesis

2.4 RRP15過表達對細胞生長增殖的影響

將同樣數(shù)量的HeLa-Flag 和HeLa-Flag RRP15 細胞分別鋪在96 孔板中，在不同時間內(nèi)檢測2 種細胞的增殖速率，結(jié)果如圖4（a）所示.由圖4（a）可以看出，與Hela-Flag 細胞相比，RRP15 過表達后，Hela-Flag RRP15 細胞的增殖速率明顯提高，隨著培養(yǎng)時間的延長，二者差距增大，120 h 時Hela-Flag RRP15 細胞的增殖量為對照細胞的1.6 倍.利用Western blot 進一步分析細胞周期相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果如圖4（b）所示.HeLa-Flag RRP15 中細胞周期蛋白cyclin D1 和cyclin B1 的表達水平明顯高于HeLa-Flag 細胞的表達水平.由此證實，RRP15 過表達導(dǎo)致細胞增殖能力增強.

圖4 RRP15 過表達對細胞生長增殖的影響Fig.4 Effect of RRP15 overexpression on cell proliferation

3 討論與結(jié)論

核仁是真核細胞內(nèi)核糖體生物發(fā)生的場所，核糖體負責(zé)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成.核糖體生物發(fā)生的異常與人類多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如髓增生異常綜合癥[9]、先天性再生障礙性貧血[10]、結(jié)腸癌等[11].有研究表明，RPL11、RPL5 以及 5S rRNA 可形成蛋白核酸復(fù)合體，抑制癌基因Mdm2 的E3 泛素連接酶活性，Mdm2 可作為E3 泛素連接酶泛素化抑癌基因p53，從而使細胞內(nèi)的p53 蛋白表達維持在較低水平[12-15].這一代謝調(diào)節(jié)通路的異常會導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11，16-17]：細胞受到外界刺激時會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生核糖體壓力，在核糖體壓力條件下，RPL11 和RPL5 從核仁釋放到細胞核基質(zhì)中，與5S rRNA 以及Mdm2 形成復(fù)合體，抑制Mdm2 對p53 的泛素化，使細胞內(nèi)p53 的蛋白水平升高（RP-Mdm2-p53 通路），從而激活細胞周期檢驗點，引起細胞周期的阻滯[18-19].RRP15的缺失也會引起嚴重的核糖體壓力，影響p53 的正常表達[8].

為了解RRP15 過表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本課題組構(gòu)建了穩(wěn)定過表達RRP15 的HeLa 細胞株HeLa-Flag RRP15 及其對照細胞株HeLa-Flag。 研究發(fā)現(xiàn)RRP15 在子宮頸癌細胞中的過表達不僅可以使核仁數(shù)量增多，核仁蛋白的表達量上調(diào)，還可以使細胞的核糖體大小亞基前體的水平上調(diào)，細胞生長增殖速率加快，細胞周期相關(guān)蛋白的表達量增加.這些結(jié)果意味著RRP15 的過表達對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有潛在促進作用.在今后研究中，本課題組將進一步收集子宮頸癌的病例樣本，詳細分析RRP15 與子宮頸癌發(fā)病的關(guān)系，為最終明確RRP15 在腫瘤發(fā)生中的作用機制提供理論依據(jù).