槲皮素對SW620 細(xì)胞遷移和侵襲的影響

黃文濤， 周 進(jìn)*， 王貴玉

（1.武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢430000；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤科，黑龍江哈爾濱150040）

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢［1］，發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第4 位，死亡率居第5 位［2］。手術(shù)、放療、化療為結(jié)直腸癌主要治療方式，但毒副作用較大，預(yù)后效果不佳［3］，故尋找毒副作用較小的高效藥物具有重要意義。

槲皮素是一種存在于車前子、紫花地丁等多種中藥中的黃酮類化合物，具有抗菌消炎、保護(hù)心血管、抗腫瘤等作用［4］，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，延長細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑制作用［5-7］。Avinaba 等［8］發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過調(diào)節(jié)STAT3 信號通路來誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞凋亡；Yang 等［9］報(bào)道，槲皮素可通過調(diào)節(jié)Akt／c-Myc 信號通路來誘導(dǎo)結(jié)直腸癌HT-29 細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期停滯，從而抑制細(xì)胞增殖，但尚無關(guān)于槲皮素調(diào)控STAT3 表達(dá)來影響結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞遷移、侵襲的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察槲皮素對SW620 細(xì)胞活力、遷移、侵襲的抑制作用，以及對STAT3 表達(dá)的影響，探討相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO） 購自美國Gibco 公司；槲皮素、胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；BCA 試劑盒、PBS緩沖液、 MTT 試劑盒購自美國 Sigma 公司；Transwell 小 室 購 自 美 國Corning 公 司； β-actin、STAT3 一抗購自英國Abcam 公司；HRP 二抗購自上海碧云天生物科技公司； Trizol 試劑、Lipofectamine TM 2000、SDS-PAGE 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自寶生物工程 （大連） 有限公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；ABI-7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自上海普迪生物技術(shù)有限公司；NanoDrop 微量核酸測定儀購自美國賽默飛世爾科技公司；凝膠成像分析儀購自柯達(dá)公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)NCM460、SW620 細(xì)胞，每2 d 換液1 次，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后用0.25% 胰酶消化并傳代，待細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集匯合度約50%的SW620 細(xì)胞，按照Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書分別加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 與 si-NC、 si-STAT3、 pcDNA、STAT3，并依次標(biāo)記為si-NC 組、si-STAT3 組、槲皮素＋pcDNA 組、槲皮素＋STAT3 組。

2.2 給藥及分組 DMSO 溶解槲皮素， 配成20 mmol／L貯備液，于-20 ℃下保存，使用時(shí)用RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋，用于細(xì)胞培養(yǎng)。將其加入到SW620 細(xì)胞培養(yǎng)液中，槲皮素終濃度分別為0、25、50、100 μmol／L，重復(fù)5 次，各組細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2下常規(guī)培養(yǎng)24 h，50 μmol／L槲皮素處理的細(xì)胞分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，每組重復(fù)5 次。

2.3 細(xì)胞存活率檢測 采用MTT 法。取槲皮素0 μmol／L 組、 25 μmol／L 組、 50 μmol／L 組、100 μmol／L組，si-NC 組，si-STAT3 組細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后的槲皮素＋pcDNA 組和槲皮素＋STAT3 組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入槲皮素，調(diào)整終濃度為50 μmol／L。培養(yǎng)24 h 后，各組細(xì)胞加入20 μL MTT 孵育4 h，棄去培養(yǎng)基， 每孔加150 μL DMSO， 振蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長處各孔光密度（OD） 值，計(jì)算存活率，公式為存活率＝ （實(shí)驗(yàn)組OD 值／對照組OD 值） ×100%。

2.4 細(xì)胞遷移和侵襲檢測 采用Transwell 法。各組細(xì)胞加入2.5 μg／mL 絲裂霉素C 干預(yù)24 h 以抑制細(xì)胞分裂，培養(yǎng)結(jié)束后加入適量胰酶消化，PBS緩沖液清洗后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為3×104／mL，取200 μL 接種于包被、未包被基質(zhì)膠的小室中，放到含完全培養(yǎng)基的下室中常規(guī)培養(yǎng)24 h，棄去多余培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌后加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并隨機(jī)選取6 個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)。

2.5 STAT3 mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-PCR 法。收集各組對數(shù)生長期的細(xì)胞，充分研磨后加入Trizol 試劑提取總RNA，NanoDrop 微量核酸測定儀檢測RNA 純度和濃度，凝膠電泳系統(tǒng)檢測RNA 完整性。 TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin 為內(nèi)參，置于ABI-7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，引物序列見表1，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 STAT3 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot 法。各組細(xì)胞超聲粉碎后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解5 min，4 ℃、12 000 r／min 離心15 min，收集上清，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。取50 μL 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳， 結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉PBST 封閉2 h，加入稀釋過的βactin 或STAT3 單克隆抗體，一抗于4 ℃下孵育過夜，PBST 漂洗3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，PBST 漂洗3 次，ECL 試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（表示，組間比較采用單因素方差分析和SNK-q 法，不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對SW620 細(xì)胞存活率的影響 圖1 顯示，與對照組（0 μmol／L） 比較，50、100 μmol／L槲皮素處理后細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），考慮到成本方面，選擇50 μmol／L；與對照組（0 h）比較，50 μmol／L 槲皮素處理24、48、72 h 后其存活率也顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），考慮到效率方面，選擇48 h。

圖1 槲皮素對SW620 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of quercetin on the survival rate of SW620 cells

3.2 槲皮素對SW620 細(xì)胞遷移、侵襲的影響 圖2 顯示，50 μmol／L 槲皮素處理48 h 后，細(xì)胞遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目較對照組（0 μmol／L） 顯著降低（P＜0.05）。

圖2 槲皮素對SW620 細(xì)胞遷移、侵襲的影響Fig.2 Effects of quercetin on the migration and invasion of SW620 cells

3.3 槲皮素對STAT3 mRNA 表達(dá)的影響 圖3 顯示，與NCM460 細(xì)胞組比較，SW620 細(xì)胞組STAT3 mRNA 表 達(dá) 顯 著 上 調(diào) （P ＜0.01）； 與 對 照 組（0 μmol／L） 比較，50、100 μmol／L 槲皮素處理后其mRNA 表達(dá)顯著下調(diào) （P ＜0.05）； 與對照組（0 h） 比較，處理24、48、72 h 后其mRNA 表達(dá)也顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 槲皮素對STAT3 mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of quercetin on STAT3 mRNA expression

3.4 敲低STAT3 對SW620 細(xì)胞存活率、遷移、侵襲的影響 圖4 顯示，敲低STAT3 后其蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；與si-NC 組比較，si-STAT3 組細(xì)胞存活率、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目顯著降低（P＜0.05）。

圖4 敲低STAT3 對SW620 細(xì)胞存活率、遷移、侵襲的影響Fig.4 Effects of knockdown of STAT3 on the survival，migration and invasion of SW620 cells

3.5 過表達(dá)STAT3 對SW620 細(xì)胞存活率、遷移、侵襲的影響 圖5 顯示，與對照組比較，槲皮素組STAT3 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P ＜0.05），而過表達(dá)STAT3 后槲皮素＋STAT3 組蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；槲皮素組細(xì)胞存活率、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目顯著降低（P＜0.05），而過表達(dá)STAT3 后槲皮素＋STAT3 組生存、遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。

圖5 過表達(dá)STAT3 對SW620 細(xì)胞存活率、遷移、侵襲的影響Fig.5 Effects of overexpression of STAT3 protein expression on the survival， migration and invasion of SW620 cells

4 討論

結(jié)直腸癌發(fā)生與年齡、性別、遺傳等多種因素有關(guān)，我國結(jié)直腸癌患者主要為中老年人，其中男性居多［10］。目前，手術(shù)是主要治療手段，輔以放療、化療，但對患者毒副作用較強(qiáng)，影響患者預(yù)后生活質(zhì)量。研究顯示，中藥在結(jié)直腸癌治療中能提高機(jī)體免疫力，減輕放療、化療引起的不良反應(yīng)，提高預(yù)后生存率［11］。

槲皮素在腫瘤細(xì)胞中能阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］，例如在肺癌細(xì)胞中通過抑制極光激酶B（Aurora B） 活性來抑制腫瘤生長［13］；在胃癌細(xì)胞中通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶、核轉(zhuǎn)錄因子-κB、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1／2） 表達(dá)來抑制細(xì)胞遷移和侵襲，發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［14］；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中通過調(diào)節(jié)STAT3 表達(dá)來抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲［15］；在結(jié)直腸癌的研究中不僅能通過調(diào)節(jié)Akt／c-Myc 信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑 制 細(xì) 胞 增 殖［9］， 還 能 通 過 調(diào) 節(jié)Wnt／βcatenin 信號通路來延長細(xì)胞周期， 抑制細(xì)胞凋亡［16］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，槲皮素能呈劑量、時(shí)間依賴性地抑制SW620 細(xì)胞存活率、 遷移、 侵襲， 以50 μmol／L下處理48 h 效果最佳，同時(shí)也能呈劑量、時(shí)間依賴性地抑制STAT3 表達(dá)。

STAT3 是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT）家族的一員，能調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期、免疫應(yīng)答等相關(guān)基因的表達(dá)，并參與血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡等生物過程， 是JAK／STAT 信號通路中的重要因子［17-18］，存在于多種腫瘤細(xì)胞中，激活時(shí)能抑制癌 細(xì) 胞 凋 亡， 促 進(jìn) 腫 瘤 發(fā) 生［19］。 研 究 表 明，STAT3 能通過靶向Bcl-2、Bcl-xl、細(xì)胞周期蛋白D1 等下游靶基因來調(diào)節(jié)乳腺癌腫瘤的生長［20］，敲除STAT3 能抑制Bcl-2、Bcl-xl 表達(dá)，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡［21］；干擾STAT3 表達(dá)能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋 亡， 抑 制 細(xì) 胞 侵 襲［22-23］； Zhang 等［24］報(bào) 道，激活STAT3 信號傳導(dǎo)途徑能增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移， 促進(jìn)腫瘤發(fā)生。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 敲低STAT3 能抑制SW620 細(xì)胞存活、遷移、侵襲，與前期報(bào)道［22-24］一致；槲皮素處理后，STAT3 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞存活率、遷移和侵襲能力明顯減弱，過表達(dá)STAT3 能逆轉(zhuǎn)槲皮素對SW620 細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用。

綜上所述，槲皮素能抑制SW620 細(xì)胞存活、遷移、侵襲， 其機(jī)制可能與抑制SW620 細(xì)胞中STAT3 表達(dá)有關(guān)，表明槲皮素可能對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展具有抑制作用，可為相關(guān)深入研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。