中藥中糖類定性及定量研究進(jìn)展

趙春霞， 余河水， 王春華， 李 正

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津300193）

中藥及制劑中，小分子的脂溶性成分一直作為中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)，而其中的單糖、寡糖以及多糖的研究成為近年來研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要研究對(duì)象。糖類因其多樣的生物活性而受到廣泛關(guān)注，見表1，但其水溶性強(qiáng)，寡糖及多糖分子量大，結(jié)構(gòu)難確證，成為現(xiàn)代中藥研究的難點(diǎn)。本研究綜述關(guān)于中藥中單糖、寡糖、多糖的定性以及多糖的定量分析方法等，總結(jié)近年來科研工作者對(duì)中藥中糖類成分的定性及定量研究進(jìn)展，以期為中藥中糖類成分的定性和定量以及質(zhì)量控制提供參考，有利于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的全面研究以及中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提升。

1 定性方法

單糖是糖類物質(zhì)的基本單元，通過共價(jià)鍵結(jié)合生成寡糖和多糖。單糖的分析分為游離單糖的分析和多糖中單糖的分析，但對(duì)多糖中的單糖分析時(shí)須選用合適的降解方法降解多糖后，采用適宜的方法分析單糖。單糖的分析是1種解決糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定的重要方法，是分析寡糖和多糖的重要手段［13］，它是1 種多羥基醛或酮，無熒光特性，具有很高的親水性，結(jié)構(gòu)具有相似性，存在差向異構(gòu)體［14］。單糖的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其分析具有一定難度，近年來，已有很多方法對(duì)單糖進(jìn)行定性及定量分析，如高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、薄層色譜法（TLC）、毛細(xì)管電泳法（HPCE）、核磁共振波譜法（NMR） 等。常用的單糖定性方法及優(yōu)缺點(diǎn)見表2。

表1 主要生物活性

表2 單糖的主要定性方法及優(yōu)缺點(diǎn)

1.1 HPLC 單糖的HPLC 分析可分為衍生化和不需衍生化兩大類，包含多樣化的分離模式（離子交換柱、親水色譜柱、反相柱） 和檢測(cè)器（用于衍生化單糖檢測(cè)的二極管陣列檢測(cè)器、質(zhì)譜、紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器和脈沖安培檢測(cè)器等，用于直接檢測(cè)的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器）［14］。單糖幾乎無紫外吸收，也無熒光特性，可通過衍生化將其轉(zhuǎn)化成具有紫外吸收或可以產(chǎn)生熒光的物質(zhì)后，采用色譜進(jìn)行分離分析，此法可使糖類衍生物通過紫外或熒光的方法痕量檢出。液相色譜中常用的糖類物質(zhì)檢測(cè)的衍生化試劑包括氨基吡啶類、酰肼類、苯胺類、氨基苯甲酸酯類熒光衍生試劑。Ding 等［15］采用1 種新型熒光試劑4-［ （氨基氧基） 甲基］ -6-氯-7-羥基香豆素（AOCC）衍生化單糖生成肟后，用2-甲基吡啶-硼烷進(jìn)行還原衍生物，并采用HPLC 分析，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，此方法可用于高精度高靈敏度和高選擇性的單糖分析，也為分析其他碳水化合物提供參考。余慧劍等［16］采用CarboPac PA10 分離柱對(duì)當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的單糖（阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、核糖） 和蔗糖進(jìn)行分離后，用脈沖安培檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，方法檢出限在3.8～200.5 μg／L 范圍，此方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，分離效果好，靈敏度高，適用于當(dāng)歸補(bǔ)血湯中單糖和蔗糖的測(cè)定。Tanaka 等［17］介紹了1 種使用常規(guī)HPLC 系統(tǒng)區(qū)分醛糖對(duì)映體的新方法，醛糖與L-半胱氨酸甲酯和芳基異硫氰酸酯的一系列反應(yīng)產(chǎn)生2-（多羥基烷基） -3-（鄰甲苯基硫代氨基甲?；?-噻唑烷-4-（R） 羧酸甲酯。反應(yīng)混合物直接用HPLC 分析，在紫外檢測(cè)器250 nm 處檢測(cè)區(qū)分了醛糖的D-、L-對(duì)映異構(gòu)體。見圖1。

圖1 醛糖與L-半胱氨酸甲酯和芳基異硫氰酸酯的反應(yīng)

1.2 GC 氣相色譜分辨率和靈敏度較高，易與不同檢測(cè)器耦合，適用于復(fù)雜混合物的分析，GC 和GC-MS 法可用于氣體或低沸點(diǎn)有機(jī)物的分析，因單糖的沸點(diǎn)較高，需要將其衍生化處理［18］。Wang 等［19］采用正丙胺和乙酸酐衍生化單糖，用GC 對(duì)單糖衍生物進(jìn)行分析，在最佳優(yōu)化條件下，可同時(shí)獲得7 種中性單糖（鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖） 和2 種糖醛酸（L-葡萄糖醛酸、L-半乳糖醛酸） 的衍生物，通過GC 法可實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確度和高精密度的分離和檢測(cè)。但此法對(duì)酮糖和一些罕見或特殊的單糖，如果糖、古洛糖、塔羅糖、阿洛糖、芹菜糖等的分離和分析效果不理想。

1.3 離子色譜法 單糖分析一般采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC-PAD），近年來發(fā)展的1 種新技術(shù)，高效陰離子交換色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPAEC-MS） 用于單糖的分析具有簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)。Zhang 等［20］建立了1種HPAEC-PAD 來分析酸性糖、中性糖和氨基糖，此方法對(duì)每種糖的定量限為12.5×10-3nmol，并且在很寬的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。且不需要單糖衍生化處理，適用于分析復(fù)雜的碳水化合物的單糖組成，如不同的糖胺聚糖、藻酸鹽、褐藻糖膠、聚糖等。Xu 等［21］采用高效陰離子交換色譜（HPAEC） 與電噴霧電離（ESI） 質(zhì)譜（MS） 相結(jié)合法，對(duì)果膠中的單糖進(jìn)行分析，并向HPAEC 柱的流出液中加入含有機(jī)溶劑的鞘液，提高了ESI-MS 對(duì)糖的靈敏度，此法可用于痕量果膠樣品中共洗脫單糖的分離和分析。

1.4 HPCE 毛細(xì)管電泳法是分析碳水化合物的可行技術(shù)，分離機(jī)制有毛細(xì)管區(qū)帶電泳 （CZE）、毛細(xì)管等速電泳（CITP）、毛細(xì)管等電聚焦 （CIEF） 等，糖分析多采用CZE；檢測(cè)器有紫外（UV） 檢測(cè)器、激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、MS 檢測(cè)器等，糖檢測(cè)通常使用UV 檢測(cè)器［22］。Chen 等［23］以8 種標(biāo)準(zhǔn)單糖為對(duì)照，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)單糖和天冬多糖水解物衍生化處理，然后在40 mmol／L 四硼酸鈉緩沖液（pH ＝10.1）中通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離，并在245 nm 處通過紫外吸收檢測(cè)，結(jié)果表明，來自天冬的多糖由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸組成。這種方法簡(jiǎn)單快速，可實(shí)現(xiàn)高效分離，可用于天冬的質(zhì)量控制和深度研究。陳乃東等［24］采用PMP 柱前衍生化HPCE 法分析測(cè)定多糖的單糖組成，并比較了不同種源霍山石斛、銅皮石斛及野生河南石斛藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的相似性，結(jié)果表明，5 種石斛中共檢測(cè)出6 種單糖（木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸、核糖），不同種源的石斛樣品單糖組成及含有量明顯不同。

1.5 NMR 核磁共振技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)藥研發(fā)、材料檢測(cè)等方面，在對(duì)化合物定性、定量和結(jié)構(gòu)分析等方面有著重要作用［25］。張宏利等［25］采用NMR 分析技術(shù)，鄰苯二甲酸氫鉀作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)幾種果汁中的葡萄糖、蔗糖和果糖定量分析，并與HPLC 測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明2 種方法的測(cè)定結(jié)果無明顯差異。NMR法樣品用量較少，不需要任何處理，分析速度較快，為葡萄糖、蔗糖和果糖的分析提供了可行方法。

2 寡糖的定性方法

寡糖又稱低聚糖，由2 ～9 個(gè)單糖通過苷鍵連接而成，是生物體內(nèi)1 種重要的信息類物質(zhì)。許多中藥中含有寡糖，中藥寡糖具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗抑郁、血糖調(diào)節(jié)等多種藥理作用［26］。中藥寡糖具有的重要且特殊的生物活性，引起食品、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域人員的廣泛關(guān)注和研究。目前，寡糖的常用定性方法包括TLC、HPLC、離子色譜法、HPCE。

2.1 TLC 周斌等［27］采用TLC 對(duì)巴戟天中3 種寡糖（蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃基耐斯糖） 進(jìn)行定性定量分析。以正丁醇-異丙醇-水-醋酸為展開劑， （α-萘酚） -硫酸為顯色劑，烘烤溫度110 ℃，掃描波長(zhǎng)577 nm。結(jié)果表明，此法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性較好，可用于定量分析巴戟天藥材及其產(chǎn)品中3 種寡糖。

2.2 HPLC Tie 等［28］建立了1 種基于新型衍生化預(yù)處理（圖2） 和超高效液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-HRMS）的新型低聚糖分析方法，用于快速分析淫羊藿寡糖。在溫和條件下，寡糖被2，4-雙（二乙基氨基） -6-肼基-1，3，5-三嗪衍生化后，不需要純化，可直接采用UPLC-HRMS 法分析，根據(jù)高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)52 個(gè)淫羊藿樣品的寡糖進(jìn)行分析，這種方法靈敏、高效、可靠，可用于中草藥中寡糖的分析。Liang 等［29］采用親水相互作用液相色譜對(duì)澤蘭中棉子糖族寡糖進(jìn)行分離、純化和定量，結(jié)果表明，澤蘭地上部分沒有低聚糖，根部的總含有量686.5 mg／g，其中棉 子 糖 66.5 mg／g、 水 蘇 糖 289.0 mg／g、 毛 蕊 花 糖212.4 mg／g、筋骨草糖118.6 mg／g，此方法有效、靈敏，可用于寡糖的分離，純化和定量。陳凌霄等［30］采用微波輔助提取法制備棉子糖系列寡糖提取物，高效液相色譜聯(lián)用電噴霧檢測(cè)器（HPLC-CAD）對(duì)不同植物中（水蘇、生地黃、車前草） 棉子糖系列寡糖（RFOs） 定性和定量，結(jié)果表明，RFOS 在水蘇和生地黃中含有量較高，車前草中含有量極低，建立的HPLC-CAD 方法有利于對(duì)RFOs 及其產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。

圖2 寡糖衍生過程［28］

2.3 離子色譜 陳梅蘭等［31］采用高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC-IPAD） 對(duì)5 種殼寡糖（聚合度DP ＝2～6） 標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分離和檢測(cè)，建立殼寡糖的保留因子與聚合度的關(guān)系，根據(jù)建立的相關(guān)關(guān)系對(duì)未知的殼寡糖進(jìn)行定性分析。結(jié)果表明，殼寡糖聚合度的對(duì)數(shù)值與其保留因子的對(duì)數(shù)值具有線性關(guān)系，利用線性回歸方程對(duì)樣品中的4 種未知?dú)す烟菢悠范ㄐ苑治?，結(jié)果為殼七糖、殼八糖、殼九糖和殼十糖。

2.4 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法 郭懷忠等［32］建立了1 種1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）為寡糖衍生化試劑，毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離分析中藥寡糖的方法，并應(yīng)用于板藍(lán)根活性多糖的控制降解寡糖產(chǎn)物的分析。結(jié)果表明，板藍(lán)根寡糖組分可按照分子量分離，分離效果較好。此法操作簡(jiǎn)單，高效，可用于中藥寡糖樣品分析。

3 多糖概述

多糖是由10 個(gè)及10 個(gè)以上的單糖分子通過糖苷鍵連接而成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的聚合物，一般具有一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。由1 種單糖組成的多糖為均多糖，2 種及以上單糖組成的多糖為雜多糖，按照多糖的性質(zhì)可分為中性多糖、酸性多糖和還原糖。其分子量較大，性質(zhì)與單糖和低聚糖不同。多糖無甜味、無還原性、無變旋性、有旋光性。分子量較小的多糖易溶于水，分子量較大的多糖難溶于水，不溶于高濃度乙醇。中藥中的活性多糖主要存在于菌類、藻類、根莖類藥材中。研究表明，中藥多糖具有保護(hù)血管、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗腫瘤等藥理作用［33］，且不良反應(yīng)小，因此廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品保健等領(lǐng)域。

3.1 多糖定性 多糖的定性方法有近紅外光譜法、糖譜法、高效液相色譜法、核磁共振波譜法、黏度計(jì)法、多糖轉(zhuǎn)化氰醇測(cè)定法等［34］。常用的多糖定性方法及優(yōu)缺點(diǎn)見表3。

3.1.1 近紅外光譜 近紅外光譜是在780 ～2 526 nm 波長(zhǎng)范圍吸收光譜，由于近紅外光譜圖復(fù)雜，信號(hào)重疊嚴(yán)重，很難找出光譜圖吸收峰的歸屬直接分析樣品信息，通常需要建立模型才能進(jìn)行定性和定量［35］。魯亮等［36］采集了102 組中藥提取物口服液樣品的近紅外光譜，結(jié)合多糖化學(xué)檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)用偏最小二乘法，通過考察和優(yōu)化不同光譜預(yù)處理方法，得到近紅外光譜技術(shù)快速測(cè)定口服液中多糖的最佳模型。結(jié)果表明，通過近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立口服液中多糖快速測(cè)定方法具有一定可行性。

3.1.2 糖譜法 糖譜法通過系列定位酶切技術(shù)聯(lián)用高效分子排阻色譜法（HPSEC）、高效薄層色譜法（HPTLC）、熒光輔助凝膠電泳（PACE） 等色譜分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)多糖的定性分析，對(duì)中藥多糖及其產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。由于多糖對(duì)不同酶定位水解的響應(yīng)差異和水解產(chǎn)物的色譜特征，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同來源的多糖進(jìn)行鑒別分析。PACE 適用于高聚合度的糖分析，而HPTLC 適合低聚合度糖和單糖的分析，因此將PACE 和HPTLC 組合使用可全面分析多糖的水解特征［37-38］。Wu 等［38］采用糖譜法對(duì)7 種天然蟲草和培養(yǎng)蟲草的多糖進(jìn)行了研究和比較，經(jīng)α-淀粉酶，β-葡聚糖酶和果膠酶降解后，用PACE 和HPTLC 法進(jìn)行分析，獲得多糖水解產(chǎn)物的綜合概況和特征，結(jié)果表明天然和培養(yǎng)的冬蟲夏草，培養(yǎng)的蛹蟲草，天然蟲草中都含有1，4-α-D-葡萄糖苷、1，4-β-D-糖苷、1，4-α-D-半乳糖苷鍵，根據(jù)糖譜可區(qū)分不同種類的天然蟲草和培養(yǎng)蟲草，有助于深入了解冬蟲夏草不同種類的多糖結(jié)構(gòu)特征，提高天然蟲草和培養(yǎng)蟲草多糖的質(zhì)量控制。Wu 等［39］采用糖譜法對(duì)51 批次中國(guó)枸杞水溶性多糖進(jìn)行研究和比較，經(jīng)部分酸水解，單一和復(fù)合酶降解后，用PACE 和HPTLC 法進(jìn)行分析，結(jié)果表明，中國(guó)枸杞多糖中存在β-1，3-糖苷、α-1，4-半乳糖醛酸和α-1，5-阿拉伯糖苷鍵，多糖相似性很高，基于PACE 和HPTLC 的糖譜法可作為多糖質(zhì)量控制的常規(guī)方法。

3.1.3 高效液相色譜法 每個(gè)化合物具有特定的圖譜，可利用其保留值的特性，采用標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖對(duì)檢測(cè)樣品定性［34］。栗園等［40］采用異硫氰酸熒光素（FITC） 標(biāo)記太子參均一多糖，高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法對(duì)太子參均一多糖進(jìn)行檢測(cè)，考察了不同溶劑、流動(dòng)相、色譜柱對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，確定了最佳檢測(cè)條件，結(jié)果表明，此方法準(zhǔn)確有效，可用于檢測(cè)分析太子參均一多糖，為太子參的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。秦垂新等［41］建立了黃精多糖水解物柱前衍生HPLC 指紋圖譜，黃精多糖柱前衍生指紋圖譜標(biāo)示出10 個(gè)共有峰，鑒別了7 個(gè)共有峰（D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖）。

表3 多糖主要定性方法及優(yōu)缺點(diǎn)

3.2 多糖的單糖組成分析 單糖組成是多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)研究的重要內(nèi)容。研究單糖組成對(duì)研究多糖的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)及構(gòu)效關(guān)系具有重要意義。分析時(shí)，一般需將多糖降解，目前已有的降解方法為堿水解、酸水解、酶解和電磁輻射、超聲波裂解法等［42］。單糖組成的分析方法主要包括高效液相色譜法、離子色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法，核磁共振波譜法等。

3.2.1 高效液相色譜法 HPLC 適用于大多數(shù)糖類的單糖組成分析，具有分析速度快、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［42］，可分為需要柱前衍生化和不需要柱前衍生化兩大類。柱前衍生化HPLC 法是檢測(cè)多糖中單糖組成的常用方法，但需要選擇合適的分析柱以及衍生化方法，才能實(shí)現(xiàn)較好的分離和檢測(cè)結(jié)果。PMP 是還原性糖的衍生化試劑之一，在堿性條件下與單糖縮合成單糖-PMP 衍生物后，可用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)［43］，不需柱前衍生化方法常選用氨基色譜柱等分離單糖，通過示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器等通用檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)［44］。鄺婷婷等［45］用硫酸水解蔓菁多糖后，加入PMP 試劑進(jìn)行衍生化，采用反相高效液相色譜法分析蔓菁多糖中單糖的衍生物，結(jié)果表明，蔓菁多糖由半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸7 種單糖組成，其物質(zhì)的量之比1 ∶0.26 ∶0.54 ∶1.06 ∶0.84 ∶0.05 ∶4.17。此研究建立了1 種準(zhǔn)確可靠的單糖分析方法，適用于蔓菁多糖中單糖組成的測(cè)定。任紅等［46］首先將銀杏葉中多糖水解成單糖，采用液相色譜法分離單糖，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，建立了1 種穩(wěn)定準(zhǔn)確、重復(fù)性好的HPLC-ELSD法分析銀杏葉多糖的單糖種類及含有量，可用于銀杏葉的質(zhì)量控制。

3.2.2 離子色譜法 離子色譜是用于分析陰離子和陽離子的1 種液相色譜方法，多糖水解后產(chǎn)生的單糖在堿性條件下可解離成帶有不同負(fù)電荷的陰離子，可采用陰離子交換柱實(shí)現(xiàn)分離，脈沖安培法進(jìn)行檢測(cè)［47］。離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法簡(jiǎn)便快捷，靈敏度較高，且不需衍生化，可直接對(duì)單糖進(jìn)行定性和定量。饒君鳳等［48］采用水提醇沉法提取三青葉塊根，葉子中的粗多糖，在100 ℃下用2 mmol／L 硫酸水解粗多糖后，采用CarboPac PA10 分析柱分離，脈沖安培法測(cè)定其多糖的單糖組成，結(jié)果表明，三葉青塊根和葉中多糖由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 種單糖組成，葉子中還含有果糖，多糖各單糖組分的摩爾比具有一定差異。Xie 等［49］建立了1 種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的HPAEC-PAD 法用于測(cè)定青錢柳多糖中的單糖組成，結(jié)果表明，青錢柳多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖組成，物質(zhì)的量之比1.00 ∶1.85 ∶3.26 ∶3.12 ∶0.85 ∶0.29。何連軍等［50］采用超聲輔助水浴提取多花黃精粗多糖，經(jīng)硫酸水解后，用HPAECPAD 測(cè)定其多糖中單糖的組成，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的多花黃精多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成，此方法分離效果好，靈敏度較高，可用于多花黃精的單糖組成的分析。

3.2.3 氣相色譜法 氣相色譜法用于多糖中單糖的組成，具有靈敏度和準(zhǔn)確度較高，所需試樣較少等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于多糖的研究［51］。因單糖揮發(fā)性較小，需通過衍生化增加其揮發(fā)性后用于氣相色譜分析，對(duì)于易揮發(fā)的有機(jī)物可以直接測(cè)定。梁軍等［52］采用三氟乙酸水解麻黃根多糖，將水解物經(jīng)三甲基硅醚化法衍生后，用GC-MS 法對(duì)單糖組成進(jìn)行分析，準(zhǔn)確測(cè)定出麻黃根多糖中單糖的種類和組成比例，麻黃根多糖主要由阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸組成，物質(zhì)的量之比7.59 ∶5.93 ∶9.94，還含有少量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖，此方法簡(jiǎn)單穩(wěn)定，重復(fù)性較好，是1 種酸性雜多糖分析測(cè)定的有效方法。王鑫彤等［53］采用硫酸水解肉蓯蓉多糖后，用GC 法測(cè)定肉蓯蓉多糖中單糖組分，結(jié)果表明肉蓯蓉多糖的單糖組成主要有甘露糖、葡萄糖、半乳糖，物質(zhì)的量之比2.01 ∶5.72 ∶2，此方法準(zhǔn)確可靠，可用于肉蓯蓉多糖中單糖組成分析。

3.2.4 TLC 薄層色譜法用于單糖組成的分析，具有簡(jiǎn)單、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)， 是1 種有效的定性分析方法［54］，但TLC 法靈敏度較低，含有量較少的成分的斑點(diǎn)會(huì)比較模糊。賈偉等［51］采用三氟乙酸水解金銀花多糖后，用TLC 法對(duì)金銀花多糖的單糖組成進(jìn)行初步確定，并采用鹽酸羥胺和乙酸酐制備了糖腈乙酸酯衍生物進(jìn)行GC 分析，結(jié)果表明，金銀花多糖的單糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖及阿拉伯糖組成，物質(zhì)的量之比23.6 ∶3.3 ∶1.8 ∶2.3 ∶1.0 ∶4.2，此方法的建立為金銀花多糖的進(jìn)一步研究提供了參考。肖作奇等［55］采用硫酸水解矮地茶多糖后，用薄層色譜法和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色譜法分析矮地茶多糖的單糖組成，結(jié)果2種方法都表明矮地茶多糖由葡萄糖和半乳糖組成，高效液相色譜測(cè)得葡萄糖和半乳糖物質(zhì)的量之比1 ∶2.36。TLC 法具有簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)，但是只能用于多糖中單糖組成的定性分析，不能對(duì)單糖組成進(jìn)行定量分析；HPLC 法靈敏度和準(zhǔn)確度較高，可用于多糖的單糖組成的定性與定量分析。

3.2.5 HPCE 該法具有樣品用量少、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，可用于多糖的單糖組成分析［56］。鄭春英等［57］采用鹽酸水解茯苓多糖，水解產(chǎn)物經(jīng)PMP 衍生化后，用高效毛細(xì)管電泳分析，結(jié)果表明，茯苓多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，物質(zhì)的量之比為2.657 ∶1.000 ∶2.362，此方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性較好，可用于茯苓多糖中單糖組成的分析。張暉等［58］采用三氟乙酸水解藥桑多糖后，經(jīng)PMP 衍生化，HPCE 分析藥桑多糖的單糖組成，結(jié)果表明，藥桑多糖主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸組成，此法可用于準(zhǔn)確快速測(cè)定藥桑多糖的單糖組成，為其他糖類的分析提供了參考。

3.2.6 NMR de Souza 等［59］探討了硫酸水解多糖的最佳條件以使多糖的糖苷鍵最大程度的水解，同時(shí)使單糖的降解最小化。最終，提出1 種普遍適用的水解多糖的方法，并采用1H-NMR 法對(duì)單糖進(jìn)行定量分析，建立了1 種精確定量測(cè)定多糖單體組成的方法。

4 多糖含有量測(cè)定

多糖含有量測(cè)定方法包括比色法、滴定法、HPLC 法、光譜法等。常用的多糖含有量測(cè)定方法及優(yōu)缺點(diǎn)見表4。

4.1 比色法 苯酚-硫酸法是多糖在硫酸作用下水解成單糖，快速脫水生成糠醛衍生物，衍生物與苯酚縮合后生成有色化合物，在一定范圍內(nèi)，有色化合物的吸收值與糖濃度成線性關(guān)系，可用來測(cè)定多糖含有量。此法不易受蛋白質(zhì)等物質(zhì)的干擾，顯色穩(wěn)定，因此在多糖含有量測(cè)定中應(yīng)用較為廣泛［60］。龐逸敏等［61］采用超聲輔助提取法提取多糖，并以葡萄糖為對(duì)照品，苯酚-硫酸法對(duì)羅漢松實(shí)中的多糖進(jìn)行含有量測(cè)定，結(jié)果表明，羅漢松實(shí)多糖的平均含有量4.74 mg／g，此方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好，具有實(shí)際利用價(jià)值。王國(guó)凱等［62］采用水提醇沉法提取馬蘭多糖，以葡萄糖為對(duì)照品，利用苯酚-硫酸法建立了簡(jiǎn)單、可靠、重復(fù)性好的馬蘭中多糖含有量測(cè)定方法。

蒽酮-硫酸法是多糖在硫酸的作用下水解為單糖，單糖迅速脫水成糠醛或糠醛類似物，再與蒽酮縮合成藍(lán)綠色化合物。在合適的波長(zhǎng)和一定范圍內(nèi)，有色化合物的吸收值與糖濃度呈線性關(guān)系，可比色測(cè)定多糖含有量［63］。但蛋白質(zhì)等物質(zhì)的存在會(huì)干擾蒽酮-硫酸法對(duì)多糖含有量的測(cè)定，因此在測(cè)定前應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理去除蛋白質(zhì)。靳淑敏等［64］采用醇沉法提取多糖，以無水葡萄糖為對(duì)照品，蒽酮-硫酸比色法對(duì)三黃糖敏湯中的多糖進(jìn)行含有量測(cè)定，結(jié)果表明，三黃糖敏湯中多糖的平均質(zhì)量濃度8.6 mg／mL，該方法簡(jiǎn)單易行，可用于三黃糖敏湯中的多糖含有量測(cè)定。

3，5-二硝基水楊酸法是在中性或堿性條件下，還原性糖與3，5-二硝基水楊酸生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，有色物質(zhì)在540 nm 吸收度值與還原糖濃度呈線性關(guān)系。張文芳等［65］采用苯酚-硫酸法測(cè)定茯苓中總糖含有量，采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含有量，總糖含有量與還原糖含有量之差為多糖含有量，建立了1 種準(zhǔn)確可靠的茯苓多糖含有量測(cè)定方法。王法琴等［66］采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法對(duì)五味子中多糖進(jìn)行定量測(cè)定，并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明苯酚-硫酸法測(cè)定結(jié)果更為靈敏，準(zhǔn)確。因此，苯酚-硫酸法是比較理想的定量測(cè)定五味子中多糖的比色方法。

4.2 滴定法 滴定法包括斐林滴定法和間接碘量法等。斐林滴定法是1 種還原滴定法，不能排除還原糖的干擾，且此方法需在沸騰狀態(tài)下滴定，易受溫度和滴定速度的影響［67］。間接碘量法是基于氧化還原反應(yīng)原理的分析方法，可以定量總糖和單糖含有量，兩者之差為多糖含有量。此法在一定程度上可排除還原糖的干擾，但在操作過程中滴定速度，振搖速度等都會(huì)導(dǎo)致測(cè)量誤差，因此在滴定過程中應(yīng)操作規(guī)范，以減小實(shí)驗(yàn)誤差［68］。

4.3 HPLC 高效液相色譜是中藥質(zhì)量控制的重要手段，可以測(cè)定多糖含有量及分子量分布。高效分子排阻色譜-示差折光檢測(cè)器（HPSEC-RID） 和高效分子排阻色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPSEC-ELSD） 法是通過選用凝膠排斥色譜柱，以不同分子量的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)，在RID 或ELSD 檢測(cè)器中檢測(cè)樣品［69］。楊樹娟等［70］采用水提醇沉透析法制備多糖，以葡聚糖為標(biāo)樣，高效凝膠滲透色譜法對(duì)庫拉索蘆薈中的多糖進(jìn)行分子量和含有量測(cè)定，結(jié)果表明，此方法專屬性強(qiáng)、精密準(zhǔn)確、重復(fù)性較好，可作為蘆薈多糖分子量和含有量的測(cè)定方法。Xu 等［71］采用高效凝膠滲透色譜法對(duì)鐵皮石斛中的糖類成分進(jìn)行定性和定量分析，首次將HPGPC 用于天然多糖的直接定量分析， 結(jié)果表明，HPGPC 法有是1 種高效、穩(wěn)定、方便的分析方法，可用于對(duì)鐵皮石斛的鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)。

HPSEC-RID 和HPSEC-ELSD 法需要建立相應(yīng)多糖對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)多糖定量。但由于多糖較為復(fù)雜，很難獲的相應(yīng)多糖的對(duì)照品。因此，Cheong 等［72］建立了1 種準(zhǔn)確且不需要多糖對(duì)照品的HPSEC-MALLS-RID多糖定量方法，此法首先通過HPSEC 分離多糖后，采用MALLS 測(cè)定多糖的相對(duì)分子質(zhì)量，最后采用多糖濃度與多糖比折光指數(shù)增量值的關(guān)聯(lián)方程求算出多糖含有量，結(jié)果表明HPSEC-MALLS-RID 結(jié)合多糖通用dn／dc 值對(duì)不同多糖對(duì)照品及混合多糖對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定，回收率90.6%～98.3%，并且可以準(zhǔn)確測(cè)定不同組分的比例。Deng 等［73］采用 HPSEC-MALLS-RID、 GC-MS、 NMR、 基 于 PACE 和HPTLC 的糖譜法對(duì)10 批霍山石斛特定多糖的進(jìn)行定性和定量分析。另外，這些方法也可以用于其他藥用植物中多糖的質(zhì)量控制。

4.4 光譜法 近紅外光譜技術(shù)主要是利用一定數(shù)量光譜結(jié)合方法建立模型來預(yù)測(cè)未知的樣品，已在煙草、食品、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域得到了較廣泛應(yīng)用［74-75］?？涤褓Y等［76］建立并且優(yōu)化茯苓中水溶性和堿溶性多糖的分光光度含有量測(cè)定方法，采用建立的分光光度法對(duì)90 個(gè)批次樣品中水溶性和堿溶性多糖進(jìn)行含有量測(cè)定，結(jié)果表明，所建立的方法簡(jiǎn)便快速，適用于茯苓中水溶性多糖和堿溶性多糖的質(zhì)量控制。Zhang 等［77］基于近紅外光譜法，并采用苯酚-硫酸法作為參考方法，對(duì)甘草中多糖進(jìn)行定量分析和預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)可以有效地用于分析甘草多糖的含有量。

高光譜圖像技術(shù)具有多波段、高分辨率、圖譜合一等有優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)多糖含有量快速無損的檢測(cè)。陳東等［78］利用高光譜圖像采集系統(tǒng)獲得何首烏的高光譜圖像，基于不同波段下圖像的平均光譜反射值建立BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型，研究何首烏中多糖和總糖含有量的檢測(cè)方法，結(jié)果表明，該研究能夠有效預(yù)測(cè)何首烏中多糖和總糖含有量，為其含有量的無損檢測(cè)提供依據(jù)。于慧春等［79］基于高光譜圖像光譜與紋理信息檢測(cè)枸杞多糖和總糖含有量，根據(jù)相關(guān)系數(shù)篩選出最適宜的特征來提高模型的預(yù)測(cè)性能，減少計(jì)算的復(fù)雜性，此研究為枸杞整體品質(zhì)的快速無損檢測(cè)提供了參考。

表4 多糖主要含有量測(cè)定方法及優(yōu)缺點(diǎn)

多糖含有量測(cè)定法除上述方法外，還有氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層掃描法等，測(cè)定方法的適用范圍和條件不同，應(yīng)根據(jù)多糖及其化學(xué)成分的性質(zhì)進(jìn)行選擇。中性多糖的含有量測(cè)定常采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，酸性多糖的測(cè)定常采用硫酸咔唑法和聯(lián)苯硫酸法。多糖含有量測(cè)定時(shí)應(yīng)盡量排除其他水溶性成分和雜質(zhì)的影響，并選用合適的對(duì)照品。苯酚-硫酸法用于測(cè)定均多糖時(shí)，以其組成糖為對(duì)照品；測(cè)定復(fù)雜雜多糖時(shí)，應(yīng)盡量明確多糖組成，采用和雜多糖組成相同的混合多糖作為對(duì)照品［80］。蒽酮-硫酸法對(duì)照品不能選擇與樣品組成差異較大的作為對(duì)照；當(dāng)樣品組成無法確定時(shí)，選擇DNS 法較好［81］。色譜法與滴定法和比色法相比具有更好的專一性和準(zhǔn)確性。HPLC可用于多糖的分離純化、單糖組成分析、定量分析、相對(duì)分子量測(cè)定等，是分析糖類物質(zhì)的最主要方法［82］。HPCE在蛋白質(zhì)、多肽、核酸等大分子物質(zhì)的分析中應(yīng)用較多，而很少用于糖分析。近年來，常采用HPCE 經(jīng)柱前衍生或非衍生化直接或間接的紫外檢測(cè)、熒光檢測(cè)、電極脈沖安培檢測(cè)對(duì)多糖進(jìn)行分析［67］。

5 總結(jié)

糖類是中藥中普遍存在的成分，多糖的分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差，使多糖的定性和定量具有一定困難。多糖的生物活性不僅與其初級(jí)結(jié)構(gòu)（分子量大小與分布、單糖組成、糖苷鍵連接方式、結(jié)構(gòu)單元和分支度） 有關(guān)，與高級(jí)結(jié)構(gòu)如鏈的空間構(gòu)象及柔韌度等也有密切關(guān)系。中藥多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等生物活性，藥效顯著且不良反應(yīng)較小，使多糖不斷地被開發(fā)利用，多糖的質(zhì)量控制顯得更加重要。本研究對(duì)中藥中單糖、寡糖及多糖的定性以及多糖的定量分析方法進(jìn)行綜述，各種定性與定量分析方法的適用條件不同，有時(shí)采用1 種方法往往達(dá)不到理想結(jié)果，多種方法聯(lián)用才能夠彌補(bǔ)各種方法的不足。因此在選擇分析方法時(shí)，應(yīng)考慮樣品本身的物理、化學(xué)性質(zhì)及使用條件，在綜合考慮實(shí)驗(yàn)條件與方法的基礎(chǔ)上建立樣品分析的方法，使樣品糖類成分的定性定量的分析結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，以期為中藥中糖類成分的質(zhì)量控制提供一定的理論依據(jù)。