HPLC 法同時(shí)測(cè)定心腦康膠囊中3 種成分

李欽青， 柴金苗， 董虹玲， 賀文彬， 李秀英

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中030619）

心腦康膠囊被2015 年版《中國(guó)藥典》 一部收錄，由丹參、赤芍、九節(jié)菖蒲、地龍、川芎、紅花、遠(yuǎn)志（蜜炙）、牛膝、鹿心粉、酸棗仁（炒）、制何首烏、枸杞子、葛根、澤瀉、郁金、甘草16 味藥材組成，具有活血化瘀、通竅止痛、擴(kuò)張血管、增加冠狀動(dòng)脈血流量的功效［1］，可用于治療冠心病、心絞痛、動(dòng)脈硬化等癥狀，并能降低血液濃度，抑制血小板聚集。前期有對(duì)心腦康膠囊中葛根素、芍藥苷含有量進(jìn)行測(cè)定的文獻(xiàn)，但尚未涉及甘草酸銨等多成分含有量同時(shí)測(cè)定。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定心腦康膠囊中葛根素、芍藥苷、甘草酸銨的含有量，為全面控制該制劑質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料

心腦康膠囊（批號(hào)161108、161101、160901、160702）購(gòu)自山西仁源堂藥業(yè)有限公司。葛根素 （批號(hào)110752-201514）、芍藥苷（批號(hào)110736-201640）、甘草酸銨（批號(hào)110731-201418） 對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。Waters 2695 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；FB224、AUW120D 電子天平（日本島津公司）；ABB5-S 電子天平［十萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；KQ-500E 超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；GZX-9146MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A） -水（含0.2%磷酸） （B），梯度洗脫（0～20 min，15%→35%A；20～35 min，35%→4%A；35～40 min，4%→65%A；40～55 min，65%A；55～70 min，65%→72%A；70～71 min，72%→80%A；71～80 min，80%A；80～81 min，80%→15%A；81～90 min，15%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)241 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取葛根素、芍藥苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，甲醇制成貯備液（三者質(zhì)量濃度分別為123.6、241.6、124.8 μg／mL），分別精密量取1.0 mL，置于5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得（三者質(zhì)量濃度分別為24.72、48.32、24.96 μg／mL）。

2.3 供試品溶液制備 取膠囊（批號(hào)161108） 10 粒，精密稱定內(nèi)容物約0.4 g，置于具塞錐形瓶中，加50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W、40 kHz） 30 min，放冷至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 根據(jù)生產(chǎn)工藝，分別制備缺葛根，赤芍， 甘草及葛根、 赤芍、 甘草的陰性樣品， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0、17.0 mL，置于50 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得葛根素、芍藥苷、甘草酸銨方程分別為Y＝31 488X-3 100.7（r ＝0.999 8）、Y ＝6 206.2X＋1 001（r ＝0.999 9）、Y ＝3 599.7X-204.66（r ＝0.999 8）， 分 別 在2.47 ～41.99、4.83 ～82.14、 2.49 ～42.43 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得葛根素、芍藥苷、甘草酸銨峰面積RSD 分別為0.49%、0.44%、0.42%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3” 項(xiàng)下供試品溶液，于0、1、2、4、8、16 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得葛根素、芍藥苷、 甘草酸銨峰面積RSD 分別為0.75%、1.57%、0.67%，表明溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同1 批膠囊 （批號(hào)161108），按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得葛根素、芍藥苷、甘草酸銨含有量RSD 分別為1.07%、1.00%、1.36%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的50 粒膠囊（批號(hào)161108）內(nèi)容物6 份，每份約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入葛根素（425.6 μg／mL）、芍藥苷（952.8 μg／mL）、甘草酸銨（132.3 μg／mL） 對(duì)照品溶液各1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.10 含有量測(cè)定 取3 批樣品，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定3 次，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)采用甲醇、50%乙醇［2-5］進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)后者提取率更高。采用回流、超聲進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)提取率無(wú)明顯影響，最終選用提取效率更高、操作更簡(jiǎn)便的后者。

3.2 流動(dòng)相篩選 本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，可用于節(jié)省分析時(shí)間［6-9］，分別以甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，并加入磷酸作為改性劑，發(fā)現(xiàn)以前者為流動(dòng)相時(shí)分離效果較好。然后，比較了甲醇-水（0.1%乙酸）、甲醇-水（0.2%磷酸），發(fā)現(xiàn)后者能很好地改善峰形，并且保留時(shí)間及最終峰形均可達(dá)到理想效果。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 本實(shí)驗(yàn)在200～500 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描［10］，發(fā)現(xiàn)葛根素、芍藥苷、甘草酸銨分別在250、230、237 nm 附近吸收明顯。由于三者在241 nm 附近均有較強(qiáng)吸收，而且響應(yīng)值大，雜質(zhì)峰小，峰形好，干擾少，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 指標(biāo)成分篩選 根據(jù)心腦康膠囊藥味組成及所含成分，本實(shí)驗(yàn)曾選擇丹參中丹酚酸B、赤芍中芍藥苷、葛根中葛根素、甘草中甘草酸銨進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)葛根素、芍藥苷、甘草酸銨分離度好，陰性無(wú)干擾，故以三者為指標(biāo)成分。

丹參作為方中君藥，其所含的丹酚酸B 含有量較高，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該成分幾乎檢測(cè)不出來(lái)，其原因可能是心腦康膠囊在制備工藝過(guò)程中丹參經(jīng)過(guò)6 h 水提與濃縮過(guò)程，丹酚酸B 被破壞，含有量大大降低。赤芍對(duì)心臟的保護(hù)機(jī)制主要有避免氧化損傷、調(diào)節(jié)凋亡基因與促凋亡基因的表達(dá)、維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境平衡等作用，其所含的芍藥苷具有擴(kuò)展血管保護(hù)腦缺血、抗血栓形成等活性［11-12］，也是《中國(guó)藥典》 中心腦康膠囊含有量測(cè)定成分。葛根素不僅可擴(kuò)張血管，還能明顯緩解頭痛癥狀，促進(jìn)微循環(huán)，降低心肌氧耗，改善心肌收縮功能，目前已有相應(yīng)注射劑廣泛用于治療冠心病［13-16］。甘草功效益氣補(bǔ)中、祛痰止咳、緩急止痛、緩和藥性、清熱解毒，具有保護(hù)心血管、抗心率失常的作用，其所含的甘草酸銨可用于抗炎［17］。同時(shí)， 《中國(guó)藥典》 中葛根、赤芍、甘草含有量測(cè)定成分分別為葛根素、芍藥苷、甘草酸銨，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇三者作為心腦康膠囊指標(biāo)成分。