外源硝普鈉與EDTA強化黑麥草耐鎘性及鎘積累

張 倩，陳為峰，董元杰

（山東農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院/土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東泰安 271018）

隨著工業(yè)的發(fā)展以及城市的快速擴張，我國土壤重金屬污染日益嚴重，其中鎘因在土壤中含量較高(0.05～0.38 mg/kg)[1]且對人類健康威脅較大而被確定為優(yōu)先控制的重金屬[2]。鎘易被植物吸收積累，從而影響其生長發(fā)育，最終導致作物減產(chǎn)[1,3]。作物中的鎘通過食物鏈進入人體，還會對人體重要器官造成損害，并可能導致癌癥和其他致命的健康危害[4]。因此，尋找有效的修復方法以減輕土壤鎘污染的社會需求十分迫切。

植物修復是一種簡便有效且環(huán)境友好的土壤污染修復方法，但目前發(fā)現(xiàn)的超富集植物普遍具有生物量小、生長周期長等問題[5-7]。黑麥草(Lolium perenneL.)是我國北方草坪的常用草，它對鎘的富集能力強、適應性廣、覆蓋面積大、生長速度快且產(chǎn)量高[8-9]。通過對黑麥草重復修剪收割，可以逐漸減少土壤中重金屬離子的含量[10]。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種植物體內普遍存在的氣體信號分子，在植物抵抗逆境脅迫過程中起重要作用[11-12]。研究表明，NO參與了植物對重金屬脅迫的反應調控[13]。硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)是一種廣泛應用的金屬-NO配合物，在水溶液中溶解時能夠釋放NO，因此普遍用作外源NO供體[14]。研究表明，外源添加SNP能夠有效緩解鎘對黑麥草的毒害作用[15-16]。乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA)是一種人工合成的螯合劑，研究表明EDTA能夠活化土壤中的重金屬，促進重金屬向植株地上部運輸，進而提高植物對重金屬的修復作用[17]。Han等[18]研究認為，EDTA處理提高了喜鹽鳶尾地上與地下部Pb、Cd的積累量。還有研究表明，施用EDTA能夠提高黑麥草中Pb、Cd、Zn的積累[19-20]。到目前為止，已有部分關于植物生長調節(jié)劑與重金屬螯合劑聯(lián)用強化植物修復效率的報道，但有關SNP與EDTA聯(lián)合施用對重金屬污染土壤植物修復影響的研究尚未見報道。

因此，本研究以黑麥草為研究對象，研究鎘脅迫下外源添加SNP與EDTA對黑麥草生理特性及鎘積累的影響，以期明確SNP與EDTA強化黑麥草修復土壤鎘污染的效應與機制，為SNP與EDTA在強化植物修復土壤重金屬方面的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2018年3月在山東農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院植物營養(yǎng)學實驗室進行。選取大小均勻、無病蟲害的黑麥草(紳士)種子，經(jīng)0.1%的HgCl2消毒處理后，置于SPX-2501C型人工智能氣候箱中25℃下恒溫培養(yǎng)。待種子露白后，播于洗凈的蛭石中，萌發(fā)后用1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌，1周后每盆移苗25株，完全營養(yǎng)液培養(yǎng)，營養(yǎng)液調pH至6.5～6.8，幼苗生長條件的室內晝/夜溫度為25/18℃，光強為100 μmol/(m2·s)，光照時間 14 h/d。

1.2 試驗設計

試驗共設8個處理，其中4個為非Cd脅迫處理，包括Hoagland營養(yǎng)液處理(CK)及在營養(yǎng)液中加入 0.5 mmol/L EDTA(EDTA)、100 μmol/L SNP(SNP)、0.25 mmol/L EDTA 和 50 μmol/L SNP(EDTA + SNP)；另外， 4個Cd脅迫處理為以上4個處理中添加100 μmol/L CdCl2，分別記為Cd、Cd +EDTA、Cd + SNP、和Cd + EDTA + SNP，每個處理重復三次，每盆每次用250 mL配制的混合液進行處理。每2 d換一次營養(yǎng)液，處理18 d后進行各項指標的測定。

1.3 測定項目及方法

株高、鮮重和干重采用常規(guī)直尺測量和天平稱量方法。光合色素含量采用乙醇提取、紫外分光光度法測定。

電解質滲出率采用DDS-307A電導儀測定初電導值S1，封口沸水浴20分鐘后冷卻并測定終電導值S2。相對電導值(%)= S1/S2× 100；電解質滲出率(%)=(樣品相對電導值-對照相對電導值)/(100%-對照相對電導值)× 100。產(chǎn)生速率采用羥胺氧化反應法測定，H2O2含量測定參照Patterson等[21]的方法，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定采用紫外分光光度法[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)和繪表，采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncan法(P＜0.05)進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同處理對Cd脅迫下黑麥草生長的影響

由表1可知，非鎘脅迫下外源添加SNP和EDTA顯著降低黑麥草株高和根長，與單獨添加相比，二者復合添加有一定緩解作用但差異不顯著。Cd處理顯著抑制了黑麥草生長，與CK相比，Cd處理下黑麥草株高、根長分別降低28.3%和27.5%，鮮重和干重分別顯著降低37.1%和38.0%。添加SNP能夠緩解鎘對黑麥草的脅迫作用，二者復合處理同樣緩解了鎘對黑麥草的生長抑制。其中Cd +EDTA + SNP處理的株高、根長較Cd處理分別增加了68.8%和59.6%，鮮重和干重分別顯著增加了62.6%和60.0%。

表1 外源SNP與EDTA對黑麥草生長及根系活力的影響Table1 Effects of extraneous SNP and EDTA on growth and root activity of ryegrass under Cd stress

根系活力反映了植物根系的生長狀況與生命力強弱。由表1可知，非鎘脅迫下，外源添加EDTA、SNP及二者復合處理顯著抑制了黑麥草的根系活力，較CK處理分別降低了17.5%、8.93%和4.62%；而與單獨添加相比，二者復合添加顯著提升其根系活力。與CK相比，Cd處理顯著降低了黑麥草的根系活力。鎘脅迫下，單獨添加SNP與EDTA處理的黑麥草根系活力較Cd處理分別提高了34.4%和71.0%，二者復合處理下其根系活力較Cd處理提高了107%，差異顯著。說明SNP與EDTA均可提高黑麥草在鎘脅迫下的根系活力以促進其生長，其中二者復合施用效果更加明顯。

由表2可知，非鎘脅迫下，SNP和EDTA單獨添加或者同時添加均顯著降低了黑麥草葉中葉綠素和胡蘿卜素的含量，尤以EDTA的負作用最大。鎘脅迫顯著降低了黑麥草光合色素的含量。與CK相比，Cd處理的黑麥草葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量分別降低32.2%、23.9%、22.7%。鎘脅迫下，添加SNP顯著提高了黑麥草Chl a、Chl b和類胡蘿卜素的含量，添加EDTA沒有顯著作用，同時添加EDTA + SNP提高色素含量的效果顯著大于SNP和EDTA單獨施用。EDTA + SNP處理的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量比Cd處理分別提高了82.5%、55.6%和82.4%，甚至顯著高于CK。由此說明SNP與EDTA復合處理能夠明顯緩解黑麥草鎘脅迫，提高其耐鎘性。

表2 外源SNP與EDTA下黑麥草光合色素含量(mg/g，F(xiàn)W)Table2 Chlorophyll contents of ryegrass affected by extraneous SNP and EDTA

2.2 不同處理對Cd脅迫下黑麥草活性氧產(chǎn)生的影響

如圖1所示，非鎘脅迫下，SNP和EDTA單獨添加或者同時添加均顯著提高了黑麥草的產(chǎn)生速率和H2O2含量，其中單獨添加EDTA作用最明顯。Cd處理顯著提高了黑麥草的產(chǎn)生速率和H2O2含量。與CK相比，Cd處理下黑麥草地上和地下部產(chǎn)生速率分別提高了48.1%、64.0%，地上部和地下部H2O2含量分別提高了78.6%、103%，說明鎘脅迫引起了黑麥草的過氧化作用。外源添加SNP與EDTA均可降低其產(chǎn)生速率和H2O2含量，其中二者復合施用效果最明顯。與Cd處理相比，Cd + SNP +EDTA處理葉片和根系中的產(chǎn)生速率分別降低了29.0%和26.1%，H2O2含量分別減少了42.5%和40.2%，且均差異顯著。

圖1 添加SNP和EDTA黑麥草葉和根中超氧陰離子產(chǎn)生速率(A)及過氧化氫含量(B)Fig.1 generation rate(A)and H2O2 content(B)in leaf and root of ryegrass affected by extraneous SNP and EDTA

由圖2A可見，非鎘脅迫下，SNP和EDTA單獨添加或者同時添加均顯著提高了黑麥草丙二醛(MDA)含量。Cd脅迫下黑麥草葉片和根系丙二醛含量均顯著增加，從而促使脂膜過氧化，對黑麥草產(chǎn)生傷害。與CK相比，Cd處理下黑麥草葉片和根系的MDA含量分別提高了104%和42.5%。添加SNP與EDTA均能減少MDA積累，其中二者復合施用效果更明顯。與Cd處理相比，Cd + SNP +EDTA處理中葉片和根系MDA含量分別降低了30.4%、21.8%，且差異性顯著，說明其對提高黑麥草耐鎘性有較好的效果。

圖2 添加外源SNP與EDTA黑麥草丙二醛含量(MDA)及電解質滲出率Fig.2 MDA content and electrolyte leakage of ryegrass affected extraneous SNP and EDTA under Cd stress

鎘脅迫下黑麥草電解質滲出率顯著增加(圖2B)。與CK相比，Cd處理下黑麥草電解質滲出率增加了61.7%。而添加SNP與EDTA可降低其電解質滲出率，其中SNP單獨施用和二者復合處理均與Cd處理差異顯著。與Cd處理相比，Cd + SNP + EDTA處理下黑麥草電解質滲出率降低了31.3%，表現(xiàn)出較好的緩解作用。

2.3 不同處理對Cd脅迫下黑麥草抗氧化酶活性的影響

非鎘脅迫下，單獨添加EDTA顯著抑制黑麥草地上與地下部超氧化物歧化酶(SOD)活性(圖3A)，與CK相比分別降低了3.03%和10.1%。鎘脅迫同樣顯著抑制黑麥草SOD活性，與CK相比，Cd處理下黑麥草地上部和地下部SOD活性分別降低了26.5%、40.3%。SNP和EDTA的單獨與復合施用均可顯著緩解這一現(xiàn)象。其中，復合處理對黑麥草地下部SOD活性的提高效果最為明顯，與Cd處理相比，Cd +SNP + EDTA處理下黑麥草地上與地下部SOD活性分別提高了32.5%、67.6%。

過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性變化趨勢與SOD活性變化趨勢基本相似(圖3-B、D)。與CK相比，Cd處理下二者均顯著降低，其中葉片與根系中的POD活性分別降低了42.3%、17.0%，APX活性分別降低了62.9%、52.6%。但添加SNP和EDTA及二者復合處理后，POD與APX活性均有提高。與Cd處理相比，Cd + SNP + EDTA處理下黑麥草地上與地下部POD活性分別提高了49.8%、67.6%，APX酶活性分別提高了134%、102%，均具有顯著的差異性。

為適應鎘脅迫，Cd處理下黑麥草葉片中過氧化氫酶(CAT)活性較CK有所提高，但差異不顯著(圖3C)。而與CK相比，Cd處理下黑麥草根系中CAT活性顯著降低了42.1%。SNP與EDTA的復合施用明顯提高了黑麥草根系內CAT活性，與Cd相比，Cd + SNP + EDTA處理下黑麥草CAT活性提高了45.4%，且差異顯著。

2.4 不同處理對Cd脅迫下黑麥草脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

逆境條件下植物體內脯氨酸會大量積累以增強其抗逆性。由圖4A可見，在鎘脅迫下黑麥草葉片和根系中脯氨酸含量均顯著提高。與CK相比，Cd處理下黑麥草葉片和根系中脯氨酸含量分別增加了75.0%、115%。鎘脅迫下，單獨添加EDTA降低了脯氨酸含量，但單獨添加SNP或二者復合施用均顯著提高了黑麥草脯氨酸含量，且復合施用效果更明顯。與Cd處理相比，Cd + SNP + EDTA處理下黑麥草葉片與根系脯氨酸含量分別提高了8.52%、7.43%。

圖3 外源SNP與EDTA復合施用對鎘迫下黑麥草SOD、POD、CAT及APX酶活性的影響Fig.3 Effects of extraneous SNP and EDTA on SOD, POD, CAT and APX activities of ryegrass under Cd stress

圖4 外源SNP與EDTA復合施用對鎘迫下黑麥草脯氨酸及可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effects of extraneous SNP and EDTA on proline and solution protein contents of ryegrass under Cd stress

黑麥草可溶性蛋白含量在鎘脅迫下顯著降低(圖4B)。與CK相比，Cd處理使黑麥草葉片和根系的可溶性蛋白含量分別減少了47.9%和51.8%。單獨添加SNP與EDTA能夠提高其可溶性蛋白含量，但復合施用效果更明顯。與Cd處理相比，Cd + SNP +EDTA處理下黑麥草葉片與根系可溶性蛋白分別提高89.8%、89.1%，且差異顯著。

2.5 不同處理對Cd脅迫下黑麥草鎘含量的影響

由圖5可見，單獨添加SNP能夠降低黑麥草葉片中的鎘含量，同時增加其根系中鎘含量。而單獨添加EDTA或SNP和EDTA復合施用均可顯著提高黑麥草地上和地下部黑麥草鎘含量。與Cd處理相比，Cd + SNP + EDTA處理下黑麥草地上與地下部鎘含量分別提高了89.7%和30.2%，且差異顯著，表明其能夠明顯提高黑麥草地上部對鎘的吸收積累。

圖5 外源SNP與EDTA復合施用對鎘迫下黑麥草鎘含量的影響Fig.5 Effects of extraneous SNP and EDTA on Cd content of ryegrass under Cd stress

3 討論

3.1 外源SNP與EDTA復合施用對鎘脅迫下黑麥草生長的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，非鎘脅迫下單獨或復合添加EDTA與SNP均顯著抑制黑麥草生長(表1)。這可能是由于EDTA的添加增強了金屬的溶解性，破壞了礦質元素平衡，從而導致生物膜結構破壞，細胞代謝紊亂，植株光合色素含量減少，光合作用受到抑制，最終影響植株生長發(fā)育[23]。He等[19]研究表明，非鉛脅迫下外源添加EDTA能夠顯著抑制黑麥草的生長，這與本實驗結果一致。同時，有研究表明過量的NO能夠抑制光合色素合成，破壞電子傳遞鏈，造成DNA損傷，抑制植物生長發(fā)育[24]，本試驗采用的SNP濃度為鎘脅迫下緩解黑麥草生長抑制的適宜濃度[15]，因此在非脅迫條件下，添加該濃度的SNP可能對黑麥草生長產(chǎn)生一定的抑制作用。

Cd脅迫會抑制植物生長、促使葉片失綠、根系活力下降和生物量下降，嚴重時甚至導致植物死亡[25]。本研究中，添加100 μmol/L的CdCl2顯著抑制了黑麥草的株高、根長、干鮮重及根系活力。鎘脅迫下單獨添加EDTA降低了黑麥草的株高根長和葉綠素含量，這可能是由于高濃度EDTA本身對植物也存在一定的脅迫作用。但添加SNP可有效緩解鎘脅迫作用，且二者復合施用效果更佳。添加SNP與EDTA可以通過提高其根系活力促進其對礦物質的吸收，同時增加光合色素的合成，能夠促進其光合作用，從而提高其耐鎘性。已有研究表明，SNP能夠在植株體內釋放NO，并通過NO調控修復鎘對黑麥草生長及葉綠素合成的抑制作用[15]，這與本試驗結果(表2)一致。同時，相關研究證明SNP能夠通過提高Δ1-吡咯-5-羧酸合成酶(P5CS)活性、降低脯氨酸脫氫酶(ProDH)活性，促進脯氨酸在植物體內的合成與積累[26]。而脯氨酸可以清除ROS，提高抗氧化能力，穩(wěn)定生物大分子的結構[27]。本研究中游離脯氨酸在鎘脅迫下能夠在植物體內大量積累(圖4)，而外源添加SNP與EDTA能夠進一步提高黑麥草地上、地下部游離脯氨酸含量，這與前人研究結果一致[28-29]。此外，有研究證明，豆科植物最初的葉子中60%～70%的Pb以Pb-EDTA形式存在[30]。因此，二者聯(lián)合施用對其脅迫作用緩解效果更好可能是由于黑麥草中的Cd大多以螯合態(tài)Cd-EDTA形式存在，使之積累在葉肉細胞的液泡內或柵欄組織的細胞內和細胞間隙，從而將有毒的鎘離子隔離在原生質外[31]，同時添加SNP能夠緩解EDTA本身對黑麥草的生長抑制(表1)，二者通過促進脯氨酸的合成，提高黑麥草的滲透調節(jié)能力，增強其耐鎘性以此維持黑麥草的正常生長。

3.2 外源SNP與EDTA復合施用對鎘脅迫下黑麥草脂質過氧化作用的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，非鎘脅迫下外源添加EDTA顯著抑制黑麥草抗氧化酶活性(圖3)，這可能是由于EDTA能夠破壞礦質元素平衡致使細胞質膜受損、代謝紊亂[23]，從而嚴重抑制了植株抗氧化酶活性，導致活性氧簇(ROS)大量積累，影響植株正常生長。Cd脅迫下，和H2O2在植物體內大量積累，同時高濃度的Cd能夠抑制植物體內抗氧化酶的活性。研究表明，ROS的積累會抑制植物的光合作用，破壞植物細胞膜結構，從而對植物的生長發(fā)育造成脅迫[32]。本研究中，Cd處理明顯提高了產(chǎn)生速率、H2O2含量(圖1)、MDA含量以及電解質滲出率，同時抑制了黑麥草中SOD、POD和APX活性(圖3)，這與前人研究結果一致[15]。而外源添加SNP或二者復合施用均能緩解這一抑制作用。Fan等[33]研究表明，SNP處理下百慕大草中MDA含量明顯低于無SNP的處理，這與本試驗結果一致。Cd能夠增加細胞膜透性，而添加外源SNP能夠通過降低和H2O2的積累來減緩脅迫條件下植物的膜脂過氧化作用[34]。Dong等[35]研究表明，外源添加SNP能夠有效提高鎘脅迫下花生中抗氧化酶活性。而EDTA能夠與Cd2+形成螯合物，緩解Cd2+取代植物體內酶中心原子造成的酶失活現(xiàn)象，提高鎘脅迫下抗氧化酶活性。同時添加SNP能夠緩解EDTA本身對抗氧化酶活性的抑制作用，因此，二者復合作用效果最佳。外源添加SNP和EDTA可能是通過二者共同作用提高黑麥草體內抗氧化酶活性，清除過量積累的ROS，并修復受損細胞，從而達到緩解對黑麥草的氧化脅迫，提高其耐鎘性。

3.3 外源 SNP與EDTA復合施用對鎘脅迫下黑麥草鎘含量的影響

鎘進入植物地上部可能通過質外體途徑經(jīng)由細胞間隙進行遷移，也可能通過共質體途徑由原生質體通道向地上部遷移[36]。然而，研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫會加速細胞成熟，促進根部凱氏帶的形成，從而使Cd不易通過質外體途徑向地上部移動[37]。Qiu等[38]認為，Cd主要通過消耗能量的共質體途徑在植物體內進行轉運，質外體途徑只占較少部分。但根系細胞內液泡的區(qū)室化作用易將共質體吸收的Cd滯留在根部[39]，因此一般植物地上部鎘積累量較低。本試驗結果表明，單獨添加EDTA與復合施用SNP和EDTA均顯著提高黑麥草地上部鎘含量(圖5)。有研究認為，EDTA能夠與重金屬螯合增加土壤溶液中的重金屬含量，螯合態(tài)重金屬呈中性，能夠減少根表吸附而直接進入植物根系[40]。且在金屬螯合物作用下，能夠破壞植物根系內皮層的凱氏帶[41]，使重金屬更易進入根部組織并向地上部轉運。

4 結論

非鎘脅迫下，添加100 μmol/L SNP與0.5 mmol/L EDTA顯著抑制黑麥草生長。而鎘脅迫下添加外源SNP與EDTA緩解了黑麥草的脂質過氧化作用，提高其滲透調節(jié)能力，從而減輕了鎘對黑麥草生長的抑制作用。同時，EDTA的添加促進了黑麥草對鎘的吸收，顯著提高了黑麥草地上部的鎘積累量。本試驗各處理中，同時添加EDTA和硝普鈉的處理可提高黑麥草鎘積累，并有效增強黑麥草的耐鎘性，其效果最為明顯。