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      不同農(nóng)藥對單細胞動物—草履蟲毒性的研究

      2019-10-16 08:49:32潘曉燕
      周口師范學院學報 2019年5期
      關(guān)鍵詞:草履蟲氯氟氰樂果

      周 琳,潘曉燕

      (周口師范學院 生命科學與農(nóng)學學院,河南 周口 466001)

      目前中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常使用大量的有機磷農(nóng)藥[1],對水中的動植物產(chǎn)生嚴重污染.當今國內(nèi)學者主要研究集中在農(nóng)藥對魚類等多細胞動物的毒性影響,而在原生動物草履蟲研究方面數(shù)據(jù)還比較少.草履蟲是最簡單的原生動物代表[2],在水中運動速度快,能和水中的物質(zhì)緊密接觸,對毒性的敏感度遠高于多細胞動物,是研究河水中是否具有有毒物質(zhì)的一種較為理想的實驗材料.筆者經(jīng)過探究不同濃度的養(yǎng)樂果、吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯對草履蟲的急慢性毒性作用,探索不同濃度的3種農(nóng)藥對草履蟲的生長和種群密度的影響,從而為進一步研究農(nóng)藥的安全、水質(zhì)檢測和生態(tài)環(huán)境的保護提供實驗數(shù)據(jù)和事實依據(jù)[3].

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 實驗對象

      所用草履蟲采集于周口川匯區(qū)的生活污水.

      1.1.2 藥品

      40%的養(yǎng)樂果;10%吡蟲啉;2.5%的高效氯氟氰菊酯.

      1.1.3 實驗器具

      顯微鏡、解剖鏡、LRH-250-CT光照恒溫培養(yǎng)箱、移液槍、載玻片、蓋玻片、燒杯、量筒、容量瓶.

      1.2 方法

      1.2.1 制備稻草液

      稻草培養(yǎng)液是草履蟲培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)液之一.稻草培養(yǎng)液的制備:新鮮稻草稈采集于周口公園附近,并剪成2 cm左右的小段,按照100 mL水中加入1 g稻草的比例進行配制,在燒杯中煮沸15 min[4].待稻草液顏色變成黃褐色后停止加熱,用pH計調(diào)節(jié)pH值.在燒杯上面蓋雙層紗布,扎緊,放在實驗室靜置24 h.

      1.2.2 草履蟲的采集

      草履蟲喜歡生活在陽光充足,并含有腐草的水溝、池塘或生活污水中[5],尤其喜歡生活在細菌豐富的水域中[6].本實驗所采用的草履蟲采集于周口市川匯區(qū)內(nèi)的生活污水,時間在4月份左右,水溫為20 ℃左右.采集后可對著光源用肉眼進行觀察,如同針尖大小快速游動的就是草履蟲.

      1.2.3 草履蟲的純化

      應(yīng)用微量分離法[7].每次用移液槍取0.01 mL含草履蟲的水體滴到載片上,經(jīng)不斷重復(fù)分離鏡檢,直到得到不含其他任何雜質(zhì)的純凈草履蟲.將得到的純凈草履蟲加入稻草培養(yǎng)液中,在25 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右[8].

      1.2.4 草履蟲的數(shù)量統(tǒng)計

      測量計數(shù)前,先將待測的培養(yǎng)液充分搖勻[9],用移液槍取0.01 mL培養(yǎng)液采樣并進行鏡檢計數(shù),得到草履蟲個數(shù)并計算其種群密度.

      1.2.5 實驗處理方法

      用稻草培養(yǎng)液分別配制養(yǎng)樂果、吡蟲啉、高效氯氟氰菊酯的稀釋液,其中養(yǎng)樂果試劑配制濃度分別為0.05,0.08,0.10,0.15,0.20,0.50,0.80,1.00 mg/L,吡蟲啉試劑配制濃度為25,50,80,100,120,150,200 mg/L,高效氯氟氰菊酯試劑配制濃度分別為0.20,0.50,1.00,2.00,5.00,10.00,20.00 mg/L,每種試劑每個濃度設(shè)置3個平行組,并設(shè)置3組空白對照,空白對照組為不添加任何試劑的稻草培養(yǎng)液.在每個試管內(nèi)均加入0.1 mL含有不同濃度藥劑的稻草液,并放入10個生活狀態(tài)良好的草履蟲,然后放置在25 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).急性毒性實驗的培養(yǎng)時間為1 h,慢性毒性實驗的培養(yǎng)時間為48 h.待1 h和48 h后對草履蟲的存活個數(shù)計數(shù),并記錄.

      1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法

      取毒性稻草培養(yǎng)液進行鏡檢,計數(shù)出0.1 mL培養(yǎng)液內(nèi)草履蟲的死亡個數(shù),從而計算出草履蟲1 h急性毒性的死亡率,并確定不同農(nóng)藥對草履蟲的完全致死濃度含量以及最小致死濃度的含量.在48 h后,從每管待測液中取出草履蟲進行鏡檢,計數(shù)出草履蟲的存活個數(shù).并計算出0.1 mL內(nèi)的草履蟲的種群密度(種群密度=待測物種的個數(shù)/待測體積)[10].

      2 結(jié)果與分析

      2.1 急性攻毒實驗結(jié)果

      2.1.1 養(yǎng)樂果的急性毒性實驗結(jié)果

      在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)下,1 h后計算每個試管內(nèi)草履蟲的死亡個數(shù),結(jié)果如表1所示.

      表1 養(yǎng)樂果對草履蟲1 h的急性毒性實驗結(jié)果

      注:1,2,3為三個平行組,空白為稻草培養(yǎng)液

      在空白對照中,草履蟲的死亡率為0;當濃度為0.05 mg/L時,草履蟲才開始死亡;而在濃度為1.00 mg/L時,草履蟲全部死亡,死亡率高達100%.同時隨著養(yǎng)樂果濃度的不斷增長,草履蟲的死亡個數(shù)也不斷增加.分析數(shù)據(jù)可知養(yǎng)樂果對草履蟲具有較強的急性毒性作用,同時也確定了養(yǎng)樂果的完全致死濃度為1.00 mg/L,最小致死濃度則為0.05 mg/L.

      2.1.2 吡蟲啉的急性毒性實驗結(jié)果

      在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)下,1 h后計數(shù)出每個試管內(nèi)草履蟲的死亡個數(shù),結(jié)果如表2所示.在空白對照中,草履蟲的死亡率為0;在濃度為25 mg/L時,草履蟲開始出現(xiàn)死亡個體;而在濃度為200 mg/L時,草履蟲已經(jīng)全部死亡.同時伴隨著吡蟲啉濃度的升高,草履蟲死亡的數(shù)量也不停的增加.這說明吡蟲啉對草履蟲具有一定的毒性,同時可得吡蟲啉的完全致死濃度為200 mg/L,最小致死濃度則為25 mg/L.

      表2 吡蟲啉對草履蟲1 h的急性毒性實驗結(jié)果

      注:1,2,3為三個平行組,空白為稻草培養(yǎng)液

      2.1.3 高效氯氟氰菊酯急性毒性實驗結(jié)果

      在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)條件下,1 h后計算每個試管內(nèi)草履蟲的死亡個數(shù),結(jié)果如表3所示.

      表3 高效氯氟氰菊酯對草履蟲1 h的急性毒性實驗結(jié)果

      注:1,2,3為三個平行組,空白為稻草培養(yǎng)液

      在空白對照中,草履蟲的死亡率為0;濃度是0.20 mg/L時,草履蟲才剛開始出現(xiàn)死亡個體,并且隨著高效氯氟氰菊酯濃度的升高,草履蟲的死亡數(shù)量急劇上升;而當濃度為20.00 mg/L時,草履蟲完全死亡.分析數(shù)據(jù)可得高效氯氟氰菊酯對草履蟲的完全致死濃度是20.00 mg/L,而最小的致死濃度則為0.20 mg/L.

      2.2 慢性急性攻毒實驗結(jié)果

      2.2.1 養(yǎng)樂果慢性毒性實驗

      25 ℃的恒溫光照箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后,計算出每個試管內(nèi)草履蟲的存活個數(shù)以及空白對照組中的存活個數(shù),結(jié)果如表4所示.在濃度為0.05 mg/L時,草履蟲的存活個數(shù)達到峰值,種群密度高達686.66 個/mL;在0.05~0.80 mg/ L范圍內(nèi),隨著養(yǎng)樂果濃度的增加,草履蟲的存活個數(shù)減少,種群密度不斷下降;在濃度為1.00 mg/L時,草履蟲全部死亡.與空白對照組進行對比,看出空白對照組中的草履蟲種群密度明顯低于濃度為0.05 mg/L的養(yǎng)樂果培養(yǎng)液,說明在一定濃度范圍內(nèi)的養(yǎng)樂果,對草履蟲種群的繁殖具有一定的促進作用,而且濃度越低,促進作用越明顯.

      表4 養(yǎng)樂果對草履蟲48 h的慢性毒性實驗結(jié)果

      注:1,2,3為三個平行組,空白為稻草培養(yǎng)液.

      2.2.2 吡蟲啉慢性毒性實驗

      25 ℃的恒溫光照箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后,計算出不同濃度的吡蟲啉中草履蟲的存活個數(shù)以及空白對照組中草履蟲的存活個數(shù),結(jié)果如表5所示.當濃度為25 mg/L時,草履蟲的存活個數(shù)達到峰值,種群密度最大為583.33 個/mL;在濃度25~150 mg/ L 的范圍內(nèi),隨著吡蟲啉濃度的不斷增加,草履蟲的存活個數(shù)逐漸減少,種群密度不斷降低;濃度達到200 mg/L時,草履蟲全部死亡.與空白對照組進行對比,可以看出空白對照組中的草履蟲種群密度為266.66個/mL,明顯低于濃度為25 mg/L的吡蟲啉培養(yǎng)液中草履蟲的種群密度.由此說明在一定濃度范圍內(nèi)的吡蟲啉,對草履蟲種群的繁殖具有一定的促進作用,而且濃度越低,促進作用越明顯.

      表5 吡蟲啉對草履蟲48 h的慢性毒性實驗結(jié)果

      注:1,2,3為三個平行組,空白為稻草培養(yǎng)液.

      2.2.3 高效氯氟氰菊酯的慢性毒性實驗

      25 ℃的恒溫光照箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后,計算出每個試管中草履蟲的存活個數(shù),結(jié)果如表6所示.濃度為20.00 mg/L時,草履蟲的存活個數(shù)最多,種群的密度最高達到383.33 個/mL;在0.20~20 mg/L 范圍內(nèi),隨著高效氯氟氰菊酯的濃度降低,草履蟲的存活個數(shù)越來越少,當濃度為0.20 mg/L時,草履蟲的存活個數(shù)達到最低值.與空白對照組進行對比,可看出在濃度為0.20~0.50 mg/L范圍內(nèi)的草履蟲存活個數(shù)低于空白對照組中草履蟲的存活個數(shù).可見在一定濃度范圍內(nèi),濃度較低的高效氯氟氰菊酯對草履蟲的生長繁衍產(chǎn)生遏制作用,而相反高濃度則會加速種群的生長繁殖.

      表6 高效氯氟氰菊酯對草履蟲48 h的慢性毒性實驗結(jié)果

      注:1,2,3為三個平行組,空白為稻草培養(yǎng)液.

      3 討論

      在養(yǎng)樂果、吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯對草履蟲的1 h急性毒性實驗中,養(yǎng)樂果濃度為0.05 mg/L時,草履蟲開始出現(xiàn)死亡,濃度為1.00 mg/L時,草履蟲全部死亡,說明養(yǎng)樂果對草履蟲的完全致死濃度為1.00 mg/L;吡蟲啉濃度為200 mg/L時草履蟲完全死亡,濃度為25 mg/L時才出現(xiàn)死亡個體,說明吡蟲啉的完全致死濃度為200 mg/L;而高效氯氟氰菊酯在濃度為0.20 mg/L時開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,在濃度為20 mg/L出現(xiàn)全部死亡現(xiàn)象,說明高效氯氟氰菊酯對草履蟲完全致死濃度為20 mg/L.上述分析數(shù)據(jù)表明三種農(nóng)藥的濃度與草履蟲的死亡率成正比,即農(nóng)藥的濃度越高,草履蟲的死亡率越大.通過對三種農(nóng)藥的實驗數(shù)據(jù)進行比對,顯示草履蟲對養(yǎng)樂果的毒性敏感度高于高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉.

      在養(yǎng)樂果、吡蟲啉對草履蟲48 h慢性毒性實驗中,養(yǎng)樂果和吡蟲啉在一定濃度范圍內(nèi),草履蟲的存活個數(shù)及種群密度與養(yǎng)樂果和吡蟲啉的濃度成反比,即養(yǎng)樂果和吡蟲啉的濃度越低,草履蟲的存活個數(shù)越多,種群密度越大.說明在一定濃度范圍內(nèi),吡蟲啉和養(yǎng)樂果對草履蟲的生長和種群的繁殖具有促進作用.這一現(xiàn)象與內(nèi)分泌干擾物[11]效應(yīng)相類似.

      內(nèi)分泌干擾物是指在環(huán)境中存在著干擾人類和動物內(nèi)分泌系統(tǒng)功能并產(chǎn)生不利影響的物質(zhì).一般通過攝入、積累等途徑進入動物體內(nèi),對生物體的生長、繁殖、代謝等功能具有嚴重危害[12].近年來國內(nèi)外學者對內(nèi)分泌干擾物對生物體的影響做了許多研究,但多以高等動物作為研究對象,而對單細胞動物的研究卻較少.Chantana等[13]和 Padungtod等[14]都研究了內(nèi)分泌干擾物對人體內(nèi)分泌系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)造成的影響.同時胡好遠等[15]探究得出鎘對單細胞草履蟲種群密度的增長具有促進作用,因此猜測這種影響的產(chǎn)生是因為鎘具有內(nèi)分泌干擾物效應(yīng).但是對于養(yǎng)樂果和吡蟲啉是否也具有內(nèi)分泌干擾物的作用還有待進一步研究.

      本實驗中,高效氯氟氰菊酯對草履蟲的48 h慢性毒性實驗結(jié)果與養(yǎng)樂果和吡蟲啉的實驗結(jié)果具有明顯區(qū)別.實驗數(shù)據(jù)顯示: 在濃度為0.20~20.00 mg/L 范圍內(nèi),高效氯氟氰菊酯的濃度越高,草履蟲的存活數(shù)量越多,種群密度越高,即在一定濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)草履蟲的種群密度隨濃度的增大而增大的現(xiàn)象.這種現(xiàn)象與環(huán)境雌激素效應(yīng)[16-17]相類似.外國學者Snell[18]和Radix等[19]首次研究證明,當水體具有雌激素活性的污染物后,會影響輪蟲的生長繁衍.王莉霞等[20]探究了氰戊菊酯在單細胞動物中的影響,得出氰戊菊酯可能具有一定的雌激素效應(yīng).但高效氯氟氰菊酯是否也具有環(huán)境雌激素效應(yīng)還有待更深入的探討.

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