姚 遠,陶玉貴,葛 飛,朱龍寶

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)

桑葚米酒是以桑葚汁和大米為主要原料,經(jīng)液化、糖化、發(fā)酵、澄清步驟釀造出的低度酒精飲品,其酒體鮮艷、口感獨特、滋味豐富，富含花色苷等生物活性物質(zhì)；同時桑葚中的活性物質(zhì)還具有降低血糖、血脂、抗氧化[1-5]以及抗腫瘤[6]等多種保健作用。在桑椹米酒的儲存過程中,由于米酒中富含蛋白質(zhì)、果膠和多酚類物質(zhì),酒體容易出現(xiàn)渾濁從而影響米酒的食用品質(zhì)[7-8],因此需要對米酒進行澄清處理。目前常用的酒類澄清劑主要是皂土、殼聚糖、明膠、雞蛋清、果膠酶、硅藻土等。劉亞萍[9]等發(fā)現(xiàn),經(jīng)皂土和殼聚糖澄清處理后的石榴酒顏色透亮，感官品質(zhì)較好。于潤美[10]等采用皂土-殼聚糖作為復(fù)合澄清劑,對紅樹莓酒進行水浴澄清處理,澄清后紅樹莓酒的透光率可達91.26%。魯榕榕[11]等研究了不同澄清劑對葡萄酒香氣成分的影響,發(fā)現(xiàn)澄清劑會導(dǎo)致原酒部分香氣成分的損失,但大部分主要香氣成分都得到保留。

實驗選取殼聚糖、皂土、明膠作為澄清劑考察了不同澄清劑對桑葚米酒澄清效果的影響,并選取皂土和殼聚糖為復(fù)合澄清劑，采用單因素及響應(yīng)面實驗分析了復(fù)合澄清劑配比、水浴時間、水浴溫度對桑葚米酒澄清效果的影響,優(yōu)化了桑葚米酒的澄清工藝,并對澄清前后桑葚米酒中香氣物質(zhì)進行了GC-MS分析,研究了澄清處理對桑葚米酒香氣成分的影響,為桑葚米酒澄清工藝的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

(1)材料與試劑。桑葚米酒(實驗室自釀)；皂土、殼聚糖、明膠(食品級)；氯化鈉(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

(2)儀器與設(shè)備。HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；L-550離心機(湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司)；GC-MS-OP 2010 plus(日本島津公司)；手動固相微萃取進樣器、100 μm PDMS萃取頭(美國Supelco公司)；L3可見分光光度計(上海儀電儀器分析有限公司)。

1.2 方法

(1)桑葚米酒最佳透光波長的測定。蒸餾水作空白對照,桑葚米酒在8 000 r/min條件下離心10 min后取上清液在450～750 nm波長范圍內(nèi)對其進行透光率測量,確定最佳透光波長。

(2)桑葚米酒色度的測定。以蒸餾水作空白對照,分別測定桑葚米酒上清液在420 nm和520 nm處的吸光度,桑葚米酒的色度值:

A=A420+A520。

(3)澄清后桑葚米酒透光率的測定。取澄清后桑葚米酒20 mL在8 000 r/min條件下離心10 min后取上清液在最佳透光波長處測定其透光率。

(4)桑葚米酒中風(fēng)味物質(zhì)的分析[12]。采用頂空-固相微萃取(HS-SPME)法處理樣品,取桑葚米酒8 mL加入到25 mL萃取瓶中,加入1.0 g NaCl,以聚四氟乙烯隔墊密封。將老化處理后的萃取針頭插入萃取瓶中并推出萃取針頭,樣品置于45 ℃水浴中萃取45 min后撥出萃取頭插入GC-MS分析儀器進樣口,解析5 min后啟動儀器采集樣品數(shù)據(jù)。

①色譜條件[13]。色譜柱為DB-5MS(30 mm×0.25 mm,0.25 μm)；進樣口溫度為250 ℃；升溫程序:35 ℃保持4 min,以10 ℃/min升至110 ℃,保持3 min,再以5 ℃/min升至150 ℃,保持2 min,最后以7 ℃/min升至230 ℃,保持6 min；載氣(He)流速1.00 mL/min,壓力53.5 kPa；不分流。②質(zhì)譜條件。電離方式：電子電離(electron ionization,EI)源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；采集模式：全掃描；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～550；掃描速率769 u/s；質(zhì)譜圖利用NIST 08譜庫進行檢索。

GC-MS檢測數(shù)據(jù)由島津GC-MSD數(shù)據(jù)工作站進行處理,檢測出的化合物與NIST08譜圖庫進行對比,對相似度大于80%的物質(zhì)進行質(zhì)譜圖的比對和分析,同時參考相關(guān)文獻確定桑葚米酒中風(fēng)味物質(zhì)的成分,利用峰面積歸一法確定桑葚米酒中風(fēng)味物質(zhì)的相對含量。

(5)不同澄清劑對桑葚米酒澄清效果的影響。 皂土添加量對桑葚米酒澄清效果的影響：取20 mL桑葚米酒,分別添加皂土溶液0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L,充分攪拌后靜置澄清48 h,測定桑葚米酒的透光率和色度。殼聚糖添加量對桑葚米酒澄清效果的影響：取20 mL桑葚米酒,分別添加殼聚糖溶液0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L,充分攪拌后靜置澄清48 h,測定桑葚米酒的透光率和色度。明膠添加量對桑葚米酒澄清效果的影響：取20 mL桑葚米酒,分別添加明膠溶液0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L,充分攪拌后靜置澄清48 h,測定桑葚米酒的透光率和色度。

(6)澄清工藝單因素實驗。 澄清劑復(fù)合配比對桑葚米酒澄清的影響：取20 mL桑葚米酒,確定復(fù)合澄清劑添加量為0.6 g/L,復(fù)合澄清劑比例(皂土/殼聚糖)分別為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3時,在水浴溫度為40 ℃下水浴處理40 min,澄清48 h后測定桑葚米酒的透光率和色度,考察復(fù)合澄清劑比例對桑葚米酒澄清的影響。水浴溫度對桑葚米酒澄清的影響：取20 mL桑葚米酒,添加0.6 g/L(皂土/殼聚糖)為1∶2.5的復(fù)合澄清劑,充分攪拌后分別在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下水浴40 min,澄清48 h后測定桑葚米酒的透光率和色度,考察水浴溫度對桑葚米酒澄清的影響。水浴時間對桑葚米酒澄清的影響：取20 mL桑葚米酒,添加0.6 g/L(皂土/殼聚糖)為1∶2的復(fù)合澄清劑,充分攪拌后在40 ℃下分別水浴處理30 min、40 min、50 min、60 min、70 min,澄清48 h后測定桑葚米酒的透光率和色度,考察水浴溫度對桑葚米酒澄清的影響。

(7)響應(yīng)面實驗優(yōu)化設(shè)計。在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken法進行響應(yīng)面實驗設(shè)計,以復(fù)合澄清劑比例、水浴時間、水浴溫度作為響應(yīng)變量,桑葚米酒的透光率為響應(yīng)值,并利用Design-Expert 8.0.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。響應(yīng)面實驗因素水平表如表1所示。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面實驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚米酒最佳透光波長的確定

桑葚米酒吸收波長掃描圖如圖1所示。由圖1可以看出,桑葚米酒在波長450～750 nm范圍內(nèi)的最大吸收波長為520 nm,為減小誤差設(shè)定桑葚米酒色度值A(chǔ)=A420+A520；當(dāng)波長超過600 nm時桑葚米酒的吸光度迅速減小,當(dāng)波長達到700 nm時桑葚米酒的吸光度值<0.01,在此條件下測得桑葚米酒透光率的背景干擾和誤差較小,因此選擇700 nm為桑葚米酒最佳透光波長。

2.2 不同澄清劑對桑葚米酒澄清效果的影響

(1)皂土添加量對桑葚米酒澄清效果的影響如圖2所示。由圖2可知,未添加皂土澄清劑時桑葚米酒的透光率較低、色度較高,說明未經(jīng)澄清處理的桑葚米酒顏色渾濁、澄清度較差。皂土吸水膨脹后會在溶液中形成膠體懸浮液,這些帶有負電荷的懸浮顆粒與米酒中的蛋白質(zhì)等帶正電荷的渾濁物結(jié)合形成絮狀沉淀,使米酒變得澄清。添加皂土后米酒的色度明顯下降、透光率明顯上升,且桑葚米酒的色度和透光率呈反比,隨著皂土添加量的增加米酒的透光率呈先上升后下降的趨勢,當(dāng)皂土添加量達到0.3 g/L時桑葚米酒的透光率達到最大為92.7%,但皂土添加量超過0.3 g/L時米酒的透光率會略微下降。因此皂土添加量為0.3 g/L時米酒的澄清效果最好。

圖1 桑葚米酒吸收波長掃描圖 圖2 皂土添加量對桑葚米酒澄清效果的影響

(2)殼聚糖添加量對桑葚米酒澄清效果的影響如圖3所示。殼聚糖是一種有機澄清劑,其在稀酸溶液中會形成帶正電荷的膠體懸浮顆粒,殼聚糖可以吸附米酒中帶負電荷懸浮顆粒,從而使果膠等物質(zhì)沉淀達到澄清的目的。由圖3可知,米酒的透光率隨著殼聚糖添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)殼聚糖添加量達到0.2 g/L時，米酒的透光率達到最大值92.9%,此時澄清效果最好。當(dāng)殼聚糖添加量超過0.2 g/L,過量的殼聚糖會在米酒中形成膠體從而阻礙米酒的澄清。因此當(dāng)殼聚糖添加量為0.2 g/L時，桑葚米酒的澄清效果最好。

(3)明膠添加量對桑葚米酒澄清效果的影響如圖4所示。明膠是一種蛋白澄清劑,它能和酒中的單寧結(jié)合形成帶正電荷的化合物,并吸附酒中帶有負電荷的渾濁顆粒形成沉淀,從而達到使米酒澄清的效果。由圖4可知,隨著明膠添加量的增加米酒的透光率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)明膠添加量為0.2 g/L時，米酒的透光率達到最大值82.2%,米酒澄清透亮。當(dāng)明膠添加量超過0.2 g/L時，米酒的透光率降低,這是因為明膠濃度過大會使米酒變得粘稠反而不利于米酒的澄清。明膠相較于殼聚糖和皂土，其澄清效果較差,因此選用皂土和殼聚糖作為復(fù)合澄清劑。

圖3 殼聚糖添加量對桑葚米酒澄清效果的影響 圖4 明膠添加量對桑葚米酒澄清效果的影響

2.3 桑葚米酒澄清工藝單因素實驗結(jié)果

(1)復(fù)合澄清劑比例對桑葚米酒澄清的影響如圖5所示。經(jīng)5種不同比例復(fù)合澄清劑澄清后桑葚米酒的平均透光率達到94.6%,澄清效果優(yōu)于單一澄清劑。當(dāng)皂土和殼聚糖比例為1∶2.5時，澄清效果最好,澄清后桑葚米酒的透光率達到96.5%。在米酒的澄清過程中，皂土主要吸附米酒中蛋白質(zhì)等帶正電荷的懸浮物,而殼聚糖主要吸附果膠等帶負電荷的渾濁物,皂土和殼聚糖協(xié)同作用能提高桑葚米酒的澄清效果。但殼聚糖添加量過高會導(dǎo)致酒液粘度變大,桑葚米酒的澄清效果變差。

(2)水浴溫度對桑葚米酒澄清效果的影響如圖6所示。由圖6可知,隨著水浴溫度的不斷上升，澄清后桑葚米酒的透光率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)水浴溫度在30～40 ℃時,澄清后米酒的透光率不斷上升，在40 ℃時透光率達到最大值95.9%。當(dāng)水浴溫度超過40 ℃，米酒的透光率又逐漸下降。隨著溫度的增加，部分蛋白質(zhì)會沉淀析出,皂土和殼聚糖更容易與米酒中的蛋白質(zhì)、果膠等渾濁物結(jié)合形成沉淀,但溫度過高會導(dǎo)致桑葚米酒中花色苷等色素的降解從而使透光率降低,同時溫度過高會造成米酒中部分風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)從而影響桑葚米酒的風(fēng)味。

圖5 復(fù)合澄清劑配比對桑葚米酒澄清效果的影響 圖6 水浴溫度對桑葚米酒澄清效果的影響

圖7 水浴時間對桑葚米酒澄清效果的影響

(3)水浴時間對桑葚米酒澄清效果的影響如圖7所示。由圖7可知,隨著水浴時間的增加，澄清后米酒的透光率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在40 min達到最大值94.9%。合適的水浴時間能使澄清劑與蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)充分結(jié)合形成沉淀,達到澄清的目的；但水浴時間過長會造成澄清劑粘度變大反而不利于米酒的澄清。

2.4 響應(yīng)面實驗優(yōu)化桑葚米酒的澄清工藝

(1)桑葚米酒澄清工藝響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析。利用Box-Behnken法設(shè)計響應(yīng)面實驗,以澄清劑復(fù)合配比、水浴溫度、水浴時間為應(yīng)變量,澄清后桑葚米酒的透光率作為響應(yīng)值,優(yōu)化桑葚米酒的澄清工藝參數(shù)。響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果如表2所示。

(2)響應(yīng)面實驗回歸方程方差分析如表3所示。由表3響應(yīng)面回歸方程方差分析可知,方差分析結(jié)果表明模型極其顯著(P<0.01),而失擬項不顯著(P>0.05),且該模型的決定系數(shù)R2=0.963 4,說明該模型在線性范圍內(nèi)擬合度較好,實驗誤差較小,可以很好地預(yù)測桑葚米酒的澄清效果。模型中一次項A(復(fù)合澄清劑配比)、B(水浴溫度),二次項BC(水浴溫度*水浴時間)、A2、B2、C2對桑葚米酒透光率的影響極其顯著(P<0.01)。一次項C(水浴時間)對桑葚米酒透光率影響顯著(P<0.05)。根據(jù)F值可知各因素對桑葚米酒透光率影響大小順序為：B(水浴溫度)>A(復(fù)合配比)>C(水浴時間)。

采用Design-Expert 8.0.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析,得到回歸方程：

Y(透光率)=+94.86+0.67A-0.88B+0.43C-0.35AB-0.30AC-0.80BC-

1.73A2-2.33B2-2.73C2。

(3)水浴溫度和水浴時間交互作用對桑葚米酒透光率的影響如圖8所示。由圖8可知，隨著水浴溫度和水浴時間的增加,澄清后桑葚米酒的透光率都呈現(xiàn)出了先上升后下降的趨勢。在水浴處理40 min、水浴溫度40 ℃左右時，桑葚米酒的透光率達到最大,澄清工藝中水浴時間和水浴溫度的交互作用對桑葚米酒透光率的影響極其顯著(P<0.01)。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實驗結(jié)果

表3 響應(yīng)面實驗回歸方程方差分析

注：“**”表示極其顯著,P<0.01；“*”表示顯著,P<0.05。

圖8 水浴溫度和水浴時間交互作用對桑葚米酒澄清的影響等高線和響應(yīng)面圖

(4)利用Design-Expert 8.0.5軟件對回歸方程進行優(yōu)化,得出桑葚米酒澄清工藝的最佳工藝條件為復(fù)合配比(皂土：殼聚糖)1∶2.60、水浴溫度38.90 ℃、澄清時間40.99 min,結(jié)合實際選取復(fù)合配比1∶2.6、水浴溫度39 ℃、水浴時間41 min,此條件下桑葚米酒的透光率達到95.6%，與預(yù)測值95.04%十分接近,表明該模型能較好地預(yù)測桑葚米酒的澄清效果。

2.5 澄清前后桑葚米酒中風(fēng)味物質(zhì)的變化

(1)桑葚米酒風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子圖如圖9所示。澄清前后桑葚米酒風(fēng)味物質(zhì)匯總表如表4所示。由圖9和表4可知,澄清前桑葚米酒中共檢測出49種風(fēng)味物質(zhì),其中酯類物質(zhì)20種、醇類物質(zhì)8種、酸類物質(zhì)5種、醛類物質(zhì)3種、酚類物質(zhì)3種、酮類物質(zhì)2種、其他物質(zhì)9種。澄清后的桑葚米酒中共檢測出38種風(fēng)味物質(zhì),其中酯類物質(zhì)17種、醇類物質(zhì)6種、酸類物質(zhì)5種、醛類物質(zhì)4種、酚類物質(zhì)2種、酮類物質(zhì)1種、其他物質(zhì)3種。澄清后桑葚米酒中風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量較澄清前有所減少,但作為酒類主要呈香物質(zhì)的酯類和醇類物質(zhì)基本被保留。澄清后對米酒風(fēng)味有重要貢獻的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的相對含量有所上升,如乙酸異戊酯可以賦予酒類新鮮果香和蘋果樣的香氣,澄清后桑葚米酒中乙酸異戊酯的相對含量達到了12.84%,明顯高于澄清前的5.13%。苯乙醇作為一種芳香醇類,其香氣閾值很低，香氣值很高(濃度/閾值)并具有玫瑰花的香氣,是形成酒類特殊風(fēng)味的重要香氣物質(zhì),澄清后桑葚米酒中苯乙醇的相對含量較澄清前也有很大提升。對米酒進行澄清處理會使米酒中的揮發(fā)性物質(zhì)有所損失,但米酒中酯類和醇類等主要風(fēng)味物質(zhì)的相對含量都有所提升；同時,米酒中烴類等對風(fēng)味無明顯貢獻的揮發(fā)性物質(zhì)減少。

圖9 桑葚米酒風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子圖

表4 澄清前后桑葚米酒風(fēng)味物質(zhì)匯總表

編號醇類化合物分子式相對含量/%澄清前澄清后1苯乙醇C8H10O11.6215.452β-香茅醇C10H20O0.140.2135-甲基-2-庚醇C8H18O0.0841-十三醇C13H28O0.250.215橙花叔醇C15H26O0.190.156香柏醇C15H26O0.190.287法尼醇C15H26O0.461.028香葉基香葉醇C20H34O0.76

編號酸類化合物分子式相對含量/%澄清前澄清后1辛酸C8H16O20.761.42癸酸C9H20O20.40.663肉豆蔻酸C14H28O20.184棕櫚酸C16H32O21.140.35亞油酸C18H32O21.670.616己酸C6H12O20.4

編號醛類化合物分子式相對含量/%澄清前澄清后1壬醛C9H18O0.090.112月桂醛C12H24O0.230.313棕櫚醛C16H32O20.410.224癸醛C10H20O0.11

編號酚類化合物分子式相對含量/%澄清前澄清后12,4-二叔丁基苯酚C14H22O4.487.8422,6-二叔丁基-4-仲丁基苯酚C18H30O5.2934,4'-(1,4-亞苯基二異丙基)二苯酚C24H26O20.750.19

編號酮類化合物分子式相對含量/%澄清前澄清后1香葉基丙酮C13H22O0.182植酮C18H36O0.1132,2,4,4-四甲基-3-戊酮C9H16O0.14

編號其他化合物分子式相對含量/%澄清前澄清后14-甲基-3,5-二氧雜環(huán)戊烷C5H10BNO23.183.3424,6-二甲基十二烷C14H300.53十二烷C14H300.194十四烷C14H300.125十七烷C17H360.166二十一烷C21H440.17亞硫酸戊基十四烷C19H40OS0.3582,3,5-三甲基-1,4-苯醌C9H10O20.229亞硫酸,2-乙基己酯C12H28O3S0.16104-十八烷基嗎啉C22H45NO3.211N,N-二甲基-1-十五胺C17H37N1.84

(2)澄清前后桑葚米酒中風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量和相對含量對比如圖10所示。由圖10可知,澄清前桑葚米酒風(fēng)味物質(zhì)中酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)的數(shù)量要多于澄清處理后的米酒,但澄清后的桑葚米酒中酯類和醇類物質(zhì)的相對含量明顯高于澄清前,同時酸類、醛類和酚類物質(zhì)的相對含量有些許降低。這表明澄清前后桑葚米酒在風(fēng)味組成上差異較大,澄清處理后米酒中對香氣有重要貢獻的酯類和醇類物質(zhì)的相對含量分別提高了7.44%和3.63%,同時酸類等物質(zhì)的相對含量降低,澄清處理使米酒在風(fēng)味組成上更加協(xié)調(diào),米酒的香氣也更加濃郁醇厚。

圖10 澄清前后米酒風(fēng)味物質(zhì)成分數(shù)量和相對含量對比

3 結(jié)論

實驗研究了桑葚米酒的澄清工藝及澄清處理對桑葚米酒香氣的影響?？疾煸硗?、殼聚糖、明膠三種澄清劑對桑葚米酒澄清的影響,結(jié)果表明皂土和殼聚糖的澄清效果較好,澄清處理后米酒的透光率達92%以上。以皂土和殼聚糖作為復(fù)合澄清劑考察復(fù)合配比、水浴時間、水浴溫度對桑葚米酒澄清效果的影響,優(yōu)化桑葚米酒的澄清工藝,結(jié)果得出復(fù)合配比1∶2.6、水浴溫度39 ℃、水浴時間41 min為最佳澄清工藝,此工藝條件下桑葚米酒的透光率達到95.6%。對澄清前后的桑葚米酒中風(fēng)味物質(zhì)進行GC-MS檢測,結(jié)果表明澄清前后米酒中分別檢測出49和38種揮發(fā)性物質(zhì),澄清后米酒中酯類和醇類物質(zhì)基本保留,烷烴及其他對風(fēng)味貢獻較小的物質(zhì)減少,澄清后桑葚米酒中酯類和醇類物質(zhì)的相對含量上升,米酒中香氣物質(zhì)組成更加協(xié)調(diào),酒體的香氣也更加濃郁厚重。