乳源六肽預(yù)防和降低小鼠急性酒精性肝損傷及其機(jī)制

席 浩，劉沁雪，陳 曦，王 鵬，李敬文，姚曉煒，呂志昊，許 尹，秦宜德

研究[1-2]表明，生物活性肽具有抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤的生物學(xué)功能，同時(shí)能夠修復(fù)受損的肝細(xì)胞。乳源免疫調(diào)節(jié)肽(immunomodulating peptide，PGPIPN)主要來自于α、β和κ-酪蛋白,多數(shù)為3～9個(gè)氨基酸殘基的短肽[3-4]。目前實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，PGPIPN具有加快酒精代謝，并顯著降低血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)活性的能力。由于PGPIPN良好的免疫調(diào)節(jié)功能和抗氧化作用[5-6]，現(xiàn)通過高濃度酒精連續(xù)灌胃的方法建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，探究PGPIPN的相關(guān)作用機(jī)制，以期進(jìn)一步探究PGPIPN的藥理學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康的60只昆明種雄性小鼠，清潔級(jí)，18～22 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑北京紅星牌56°二鍋頭酒(北京紅星股份有限公司)； PGPIPN(上海生物工程技術(shù)有限公司合成)；谷胱甘肽片(glutathione,GSH,重慶藥友制藥有限公司生產(chǎn))。TNF-α含量檢測(cè)采用北京北方生物技術(shù)研究所的試劑盒，ALT、AST、TG和TC的含量檢測(cè)采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。改良型CBA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒由上海生物工程技術(shù)有限公司提供。

1.3 儀器ST16R低速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；倒置顯微鏡T300型(尼康儀器上海有限公司)；自動(dòng)放免儀(中國(guó)科大中佳公司)；羅氏全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司)。

1.4 分組60只昆明種小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后分成6組：對(duì)照組、模型組、PGPIPN L組、PGPIPN M組、PGPIPN H組和GSH組，每組10只小鼠。分別以0.04、0.4、4 mg/kg進(jìn)行灌胃；陽性對(duì)照GSH組以谷胱甘肽片200 mg/kg灌胃。持續(xù)灌胃2 d，每天1次。正常組和模型組以等量蒸餾水進(jìn)行灌胃。進(jìn)行到給藥第12天開始，模型組及各給藥組小鼠以56°紅星二鍋頭酒灌胃，16 ml/kg，持續(xù)3 d，每天1次。正常組使用等量蒸餾水替代灌胃。各組小鼠均正常飼養(yǎng)。24 h后頸椎脫臼處死小鼠，取相關(guān)組織檢測(cè)指標(biāo)。

1.5 血清和肝勻漿提取末次灌胃結(jié)束后12 h內(nèi)禁食處理，將各組小鼠稱重，分離血清，測(cè)定血清中ALT和AST含量。取肝左葉約1.0 g，剪碎研磨，使用勻漿儀制成10%肝勻漿， 4 ℃ 4 000 r/min離心8 min，取上清液用CBA法檢測(cè)新鮮制作的肝勻漿中蛋白質(zhì)含量，測(cè)定肝臟中TG含量;按試劑盒說明操作,使用放射免疫檢測(cè)TNF-α的含量。

1.6 免疫組化和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)(Tunel detection，Tunel)將小鼠的肝臟組織用10%的甲醛溶液固定、梯度酒精濃度脫水、石蠟包埋、切片，制作常規(guī)組織切片，使用Tunel試劑盒染色，熒光倒置顯微鏡觀察。

1.7 分離原代肝臟組織測(cè)定細(xì)胞的凋亡將小鼠用水合氯醛麻醉，在解剖臺(tái)上固定，打開腹腔，找到門靜脈和下腔靜脈。從門靜脈入針，注入灌流液Ⅰ(250 ml Krebs Ringer with Glucose中加入0.5 ml 50 mmol/L EGTA)，待肝臟組織灰白，將灌流液換成膠原酶Ⅰ，灌流至肝臟出現(xiàn)皸裂或水泡停止。抖落細(xì)胞，400目濾網(wǎng)過濾，靜置后離心，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。

2 結(jié)果

2.1 PGPIPN對(duì)體質(zhì)量、肝重和肝指數(shù)的影響與對(duì)照組相比，模型組的小鼠體質(zhì)量下降，肝指數(shù)增大，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.92，P<0.05)。圖1C可見，與模型組相比，GSH組和PGPIPN H組的肝指數(shù)降低;同時(shí) PGPIPN M組和PGPIPN L組小鼠肝指數(shù)有降低的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 PGPIPN減輕小鼠酒精性肝損傷

2.2.1PGPIPN對(duì)小鼠血清中ALT和AST含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中的ALT和AST活性增加，并且PGPIPN的濃度越高，ALT和AST的活性降低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=132.47，P<0.01)。見圖2。

2.2.2PGPIPN對(duì)小鼠肝勻漿中TNF-α含量的影響 放射免疫法測(cè)定肝勻漿中 TNF-α含量，首先要測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品中含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線圖，再根據(jù)待測(cè)樣品中的CPM值反求濃度值。與對(duì)照組相比，模型組中小鼠體內(nèi)的 TNF-α含量升高。與模型組相比，PGPIPN H組、 PGPIPN M組和PGPIPN L組中的TNF-α含量降低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=712.35，P<0.01)。見圖3。

圖1 小鼠體質(zhì)量、肝重和肝指數(shù)變化

A：體質(zhì)量；B：肝重；C：肝指數(shù)；1：對(duì)照組；2：模型組；3：GSH組；4：PGPIPN L組；5：PGPIPN M組；6：PGPIPN H組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.3 PGPIPN降低小鼠肝細(xì)胞脂肪含量生化分析顯示模型組小鼠血清中TG、TC和肝臟勻漿中TG含量均高于對(duì)照組，且PGPIPN H組、 PGPIPN M組和PGPIPN L組中的TG、TC含量降低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=394.85，P<0.01)，說明PGPIPN可能是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)的代謝來預(yù)防急性酒精性肝損傷的。見圖4。

圖2 PGPIPN對(duì)小鼠血清中ALT、AST含量變化的影響

A：ALT；B：AST；1：對(duì)照組；2：模型組；3：GSH組；4：PGPIPN L組；5：PGPIPN M組； 6：PGPIPN H組；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

圖3 PGPIPN對(duì)小鼠肝臟TNF-α的含量影響

1：對(duì)照組；2：模型組；3：GSH組； 4：PGPIPN L組；5：PGPIPN M組；6：PGPIPN H組；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.4 PGPIPN降低小鼠肝細(xì)胞凋亡

2.4.1Tunel染色的組織學(xué)分析 應(yīng)用Image J對(duì)熒光圖片進(jìn)行半定量分析，熒光密度總和/區(qū)域面積=平均光密度，計(jì)算凋亡指數(shù)。與對(duì)照組相比，模型

圖4 PGPIPN對(duì)小鼠血清中TG/TC和肝勻漿中TG含量變化的影響

1：對(duì)照組；2：模型組；3：GSH組；4：PGPIPN L組；5：PGPIPN M組；6：PGPIPN H組；與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

組肝臟組織有明顯的病理變化。對(duì)照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉排布整齊，肝細(xì)胞邊界清晰，無明顯壞死現(xiàn)象。模型組中肝索結(jié)構(gòu)紊亂，液泡數(shù)目增加，肝細(xì)胞邊界不清晰，細(xì)胞核消失，細(xì)胞皺縮。見圖5、表1。

表1 各組小鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.4.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟細(xì)胞早期凋亡嚴(yán)重，說明小鼠的急性酒精性肝損傷模型造模成功。與對(duì)照組比較，PGPIPN H組、 PGPIPN M組和PGPIPN L組中凋亡細(xì)胞比例降低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1187.42，P<0.05)。見圖6、7。

3 討論

根據(jù)前期的研究[7]表明PGPIPN具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)和緩解炎癥反應(yīng)的功能。急性酒精性肝損傷的發(fā)生機(jī)制就是短時(shí)間內(nèi)大量攝入酒精導(dǎo)致乙醇及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟組織的損傷[8]，主要是氧化應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[9]。在急性酒精性肝損傷的初始階段，肝臟組織內(nèi)的TG和TC含量升高，致使脂肪變性[10]，AST和ALT含量急劇升高，過氧化反應(yīng)明顯。

圖5 各組小鼠肝臟組織的凋亡變化 ×200A：對(duì)照組；B：模型組；C：GSH組；D：PGPIPN L組；E：PGPIPN M組；F：PGPIPN H組

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠肝臟細(xì)胞的凋亡變化A: 對(duì)照組; B: 模型組; C: GSH組; D:PGPIPN L組; E:PGPIPN M組; F:PGPIPN H組

圖7 PGPIPN對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞凋亡百分比的影響

1:對(duì)照組；2:模型組；3:GSH組；4:PGPIPN L組；5:PGPIPN M組；6:PGPIPN H組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

PGPIPN可提高肝臟細(xì)胞的抗氧化能力，清除大量攝入酒精產(chǎn)生的自由基，從而對(duì)肝臟細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。在急性酒精性肝損傷的后期階段，肝臟細(xì)胞中的TNF-α含量大量增加，TNF-α作為標(biāo)志性的炎性因子是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，與發(fā)熱和炎癥的發(fā)生相關(guān)，是典型的促炎細(xì)胞因子。TNF-α人體內(nèi)最重要的靶器官就是肝臟，正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的TNF-α含量較低，但發(fā)生病理現(xiàn)象時(shí)，TNF-α的分泌大量產(chǎn)生，引起各種炎性因子迅速增加，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)細(xì)胞組織損傷嚴(yán)重。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的小鼠急性酒精肝損傷模型是十分成功的。

通過病理學(xué)研究也可以看出，正常狀態(tài)下，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉排布整齊，肝細(xì)胞邊界清晰，未見細(xì)胞皺縮或鼓脹，無明顯壞死現(xiàn)象。而肝臟組織在短時(shí)間內(nèi)大量攝入酒精會(huì)導(dǎo)致肝索結(jié)構(gòu)紊亂，液泡數(shù)目增加，肝細(xì)胞邊界不清晰，細(xì)胞核消失，肝細(xì)胞間存在明顯的炎性浸潤(rùn)。PGPIPN H組、 PGPIPN M組在PGPIPN的保護(hù)作用下，病理狀態(tài)明顯改善。

短時(shí)間內(nèi)大量攝入酒精會(huì)導(dǎo)致肝臟組織脂肪變性，與酒精攝入產(chǎn)生的自由基結(jié)合導(dǎo)致氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)證明了PGPIPN在體內(nèi)能夠有效地緩解短時(shí)間內(nèi)大量酒精攝入對(duì)肝臟組織細(xì)胞的損傷，為臨床上治療急性酒精性肝損傷提供理論依據(jù)。