石 旭，葛勇勝，莢衛(wèi)東，王 濤，任 超

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤，也是世界上最常見和致命的癌癥之一[1-2]。近年來，研究[3]表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)的極化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其包括經(jīng)典的促炎激活M1型和替代的抗炎激活M2型。巨噬細(xì)胞極化的失常普遍存在于多種包括HCC在內(nèi)的惡性腫瘤中，并與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。核不均一核糖核蛋白L(heterogeneous-nuclear ribonucleoprotein L，hnRNP L)是一種多功能RNA結(jié)合蛋白，在正常組織中微弱表達(dá)或不表達(dá)，但在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá),且與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[6-10]。然而，hnRNP L在HCC組織中的表達(dá)及其在HCC中的作用機(jī)制尚不清楚。有研究[11]表明hnRNP L可能具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的潛力，這也可能是其參與肝癌進(jìn)程的機(jī)制之一。該研究將對(duì)hnRNP L與肝癌中巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究回顧性收集了90例肝癌石蠟標(biāo)本，標(biāo)本來源于2011年1月～2016年12月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝臟外科并在住院期間行根治性肝癌切除術(shù)的患者。術(shù)后病理均明確診斷為肝細(xì)胞癌。其中男71例，女19例，年齡20～80(51.79±12.51)歲。同時(shí)收集了20對(duì)新鮮冰凍肝癌組織及相對(duì)應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤邊緣至少2 cm)用于后續(xù)Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定。本研究中所有納入病例手術(shù)前未接受放療、化療、靶向治療及介入等抗腫瘤治療。

1.2 主要試劑兔抗人多克隆抗體hnRNP L(北京bioss公司)；鼠抗人多克隆抗體CD68、兔抗人多克隆抗體CD206、兔抗人多克隆抗體CD11c(美國Proteintech Group公司)；DAB顯色試劑盒、蘇木精、通用山羊抗鼠/兔二抗、β-actin(北京中杉金橋公司)；TRIzol試劑、ECL超敏發(fā)光試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；PCR引物(上海生工生物工程公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組化染色 采用免疫組化SP法檢測(cè)hnRNP L及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CD68、CD11c、CD206)的表達(dá)。制作2 μm厚度的肝癌石蠟組織連續(xù)切片。二甲苯脫蠟并在梯度乙醇中進(jìn)行水化。之后將組織切片置于EDTA抗原修復(fù)溶液中進(jìn)行高壓抗原修復(fù)。將切片在3%過氧化氫中孵育20 min阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性。孵育一抗，即添加兔抗人多克隆抗體hnRNP L(稀釋比例為1 ∶200)、鼠抗人多克隆抗體CD68(稀釋比例為1 ∶400)、兔抗人多克隆抗體CD206(稀釋比例為1 ∶100)、兔抗人多克隆抗體CD11c(稀釋比例為1 ∶100)，然后4 ℃下孵育過夜。用PBST溶液沖洗后加入通用型二抗在37 ℃下孵育30 min。PBST洗片后，進(jìn)行DAB顯色；終止顯色后，蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、透明、封片及鏡下觀察。免疫組化結(jié)果的判定由兩名臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師雙盲下完成。hnRNP L免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn)：400倍顯微鏡下隨機(jī)選擇切片組織上5個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行免疫組化評(píng)分，評(píng)分包括染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比。染色強(qiáng)度定義如下：棕褐色：3分；棕黃色：2分；淡黃色：1分；著色弱或不著色：0分；陽性細(xì)胞百分比即染色細(xì)胞占視野內(nèi)全部細(xì)胞的百分比評(píng)分，定義如下：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。切片最終評(píng)分=著色細(xì)胞強(qiáng)度評(píng)分×陽性細(xì)胞百分比評(píng)分。最終評(píng)分0分記為陰性，1～3分記為弱陽性，4～6分記為中等強(qiáng)度陽性，9～12分記為強(qiáng)陽性，≥6分者定義為高表達(dá)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞染色判定：400倍鏡下選取5處代表性區(qū)域，評(píng)估其陽性細(xì)胞百分比，取平均值，最后大于平均值即定義為高表達(dá)，小于平均值定義為低表達(dá)。

1.3.2Western blot 各稱取新鮮冰凍肝癌及癌旁組織100 mg，然后添加1 ml含PMSF的RIPA裂解液勻漿，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液。制配SDS-PAGE凝膠，按照1 ∶4比例添加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水下充分變性。等量上樣后進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜置入Western洗滌液內(nèi)，持續(xù)漂洗5 min。添加5%的脫脂奶粉，室溫下水平搖床上緩動(dòng)封閉2 h。PBST沖洗PVDF膜后添加稀釋后的一抗(兔抗人多克隆抗體hnRNP L稀釋比例為1 ∶500，β-actin抗體稀釋比例為1 ∶1 000)。在4 ℃下緩慢搖動(dòng)孵育過夜。按照1 ∶10 000比例稀釋HRP標(biāo)記的二抗在室溫下緩動(dòng)孵育2 h。PBST洗膜3次。之后進(jìn)行條帶顯影操作，使用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白印跡，Image J軟件分析條帶灰度值。內(nèi)參β-actin蛋白操作參照hnRNP L。

1.3.3qRT-PCR 用TRIzol提取20對(duì)新鮮冰凍肝癌和癌旁組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。二步法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃、2 min；95 ℃、5 s；60 ℃、10 s，40個(gè)循環(huán)。各引物序列如下：hnRNP L正向序列：5′-AGACTCTGGGCTTCCTGAAC-3′，反向序列：5′-TGTCTTCCTGCTCAGATGGG-3′，擴(kuò)增長度為140 bp；β-actin正向序列：5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，反向序列：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′，擴(kuò)增長度為96 bp。最后2-ΔΔCt作為hnRNP L mRNA的最終相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 hnRNP L在肝癌組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示hnRNP L主要在肝癌及癌旁組織的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，細(xì)胞核中偶見表達(dá)。其中，hnRNP L在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為77.7%(72/90)，在癌旁組織中的陽性表達(dá)率為53.3%(48/90)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.908,P=0.001)，見圖1。qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，hnRNP L在肝癌組織的表達(dá)顯著高于相對(duì)應(yīng)癌旁組織，hnRNP L mRNA在肝癌組織及癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量分別是(1.19±0.51)和(0.61±0.31)，見圖2，hnRNP L在肝癌組織及癌旁組織蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別是(1.09±0.22)和(0.48±0.11)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.690，P<0.001；t=15.829，P<0.001)，見圖3。

2.2 hnRNP L在肝癌組織中的表達(dá)及臨床病理因素分析臨床病理資料分析結(jié)果顯示：hnRNP L在肝癌組織中的高表達(dá)與年齡、血管侵犯、腫瘤Edmondson分級(jí)及BCLC分期顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018、0.039、0.001、0.018)。而與患者其他臨床資料如性別、腫瘤包膜、血清AFP、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、肝硬化及HBsAg則未見明顯關(guān)系，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 hnRNP L在肝癌組織中的表達(dá)與巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)性為了探究hnRNP L在肝癌組織中的表達(dá)與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系，采用了免疫組織化學(xué)法對(duì)連續(xù)切片進(jìn)行染色，同時(shí)Kappa一致性檢驗(yàn)法分析用于評(píng)估二者之間的關(guān)系。結(jié)果顯示TAMs標(biāo)記主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，染色結(jié)果見圖4。hnRNP L的表達(dá)強(qiáng)度與CD68(總巨噬細(xì)胞Marker)和CD206(M2巨噬細(xì)胞Marker)的浸潤密度呈正向的一致性(κ=0.448，P<0.001；κ=0.455，P<0.001)，但與CD11c(M1巨噬細(xì)胞Marker)的表達(dá)呈負(fù)向的一致性(κ=-0.394，P<0.001)(表2)。

圖1 hnRNP L在肝癌及癌旁組織的免疫染色情況

A、C：hnRNP L在HCC組織中的表達(dá)；B、D：hnRNP L在癌旁組織中的表達(dá)；1、2：病例；A、B：×100；C、D：×400

圖2 hnRNP L在20對(duì)HCC組織和癌旁組織中的相對(duì)mRNA表達(dá)水平與癌旁組織比較：***P<0.001

圖3 Western blot檢測(cè)hnRNP L在20對(duì)HCC組織和癌旁組織中的表達(dá)

A：在4對(duì)代表性HCC組織(T)和癌旁組織(P)中hnRNP L蛋白表達(dá)條帶；B：20對(duì)HCC組織和癌旁組織中hnRNP L蛋白的表達(dá)情況；與癌旁組織比較：***P<0.001

表1 hnRNP L在HCC組織中的表達(dá)與HCC患者臨床病理因素之間的關(guān)系(n=90)

圖4 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物在HCC組織中的免疫組織化學(xué)染色 ×400A：總巨噬細(xì)胞(CD68)；B:M2巨噬細(xì)胞(CD206)；C:M1巨噬細(xì)胞(CD11c)

表2 hnRNP L的表達(dá)與巨噬細(xì)胞極化之間的相關(guān)性

3 討論

hnRNP L是一類富含甘氨酸及脯氨酸的RNA結(jié)合蛋白，也是一類剪接調(diào)節(jié)蛋白，其主要調(diào)節(jié)盒式剪接，對(duì)哺乳動(dòng)物T細(xì)胞的發(fā)育和功能至關(guān)重要[6]。越來越多的研究[7-9]表明hnRNP L在多種惡性腫瘤異常高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Goehe et al[8]發(fā)現(xiàn)hnRNP L在非小細(xì)胞肺癌中顯著高表達(dá)，并與外顯子剪接沉默相互作用，調(diào)節(jié)caspase-9前mRNA的加工，從而影響非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的致瘤能力。Zhou et al[7]還發(fā)現(xiàn)hnRNP L與前列腺癌侵襲性特征呈正相關(guān)性，并且通過影響細(xì)胞周期和固有凋亡信號(hào)，在前列腺癌中發(fā)揮促增殖和抗凋亡作用。Lv et al[9]在敲低膀胱癌細(xì)胞中的hnRNP L表達(dá)后發(fā)現(xiàn)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G1-S期阻滯，抑制MAPK信號(hào)通路表達(dá)調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的命運(yùn)。Liu et al[12]在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)hnRNP L作為一種伴侶蛋白協(xié)同lncRNA uc.345促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，并對(duì)患者的生存有較好的預(yù)測(cè)作用。hnRNP L也被發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，Jia et al[13]發(fā)現(xiàn)hnRNP L調(diào)節(jié)致癌剪接因子SRSF3的表達(dá)和外顯子4的選擇性剪接，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移同時(shí)參與G2/M細(xì)胞周期進(jìn)程抑制細(xì)胞凋亡。Yau et al[10]在HCC中發(fā)現(xiàn)hnRNP L自身抗體的高滴度與腫瘤大小增加和生存率降低有關(guān)。

基于以往的研究，hnRNP L可能在惡性腫瘤中發(fā)揮致癌蛋白的作用。在此研究中，免疫組化、Western blot及qRT-PCR結(jié)果顯示hnRNP L在HCC中的表達(dá)顯著高于在癌旁組織中的表達(dá)。同時(shí)臨床資料分析顯示hnRNP L在HCC患者中的高表達(dá)與年齡、血管侵犯、Edmondson分級(jí)和BCLC分期等不良臨床病理特征顯著相關(guān)。關(guān)于hnRNP L表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，之前的研究[6]表明，hnRNP L可通過激活其自身的毒物外顯子6A復(fù)合物來自動(dòng)調(diào)節(jié)其在可變剪接水平上的表達(dá)，從而介導(dǎo)無義衰變。因此，hnRNP L的異常表達(dá)可能與自調(diào)節(jié)環(huán)路失衡有關(guān)。但是，詳細(xì)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

hnRNP L在腫瘤中的特異性作用機(jī)制尚不清楚。以往的研究[7-9,14]表明，hnRNP L能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，同時(shí)參與DNA損傷反應(yīng)的調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞凋亡。腫瘤在進(jìn)展中的機(jī)制往往是多樣化的，hnRNP L還可能具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的作用。既往研究[4]表明M2及M1型巨噬細(xì)胞極化的失常與惡性腫瘤密切相關(guān)。在HCC主要浸潤于的TAMs是M2型巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移[5]。此研究初步探討了hnRNP L與巨噬細(xì)胞極化之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，在HCC中hnRNP L的表達(dá)強(qiáng)度與CD68和CD206的表達(dá)強(qiáng)度呈正向的一致性，與CD11c呈負(fù)向的一致性。提示hnRNP L可能通過調(diào)節(jié)TAMs的極化來參與HCC進(jìn)展。關(guān)于其調(diào)節(jié)通路，可能與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。Vergadi et al[15]發(fā)現(xiàn)PI3K或Akt激酶的激活或過表達(dá)是巨噬細(xì)胞極化過程中必不可少的重要步驟，同時(shí)Akt1的缺失促進(jìn)M1激活的上調(diào)而Akt2的缺失導(dǎo)致M2激活的上調(diào)。Klingenberg et al[14]發(fā)現(xiàn)hnRNP L可以增強(qiáng)Akt的磷酸化而Akt1是hnRNP L敲低后最顯著調(diào)節(jié)的因子。上述研究支持了hnRNP L通過PI3K/AKT信號(hào)通路參與巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)的假設(shè)，但是還需要更深入的機(jī)制研究。此外，hnRNP L有可能不是單獨(dú)起作用，一些研究[11,14]表明hnRNP L作為一種結(jié)合蛋白與lncRNA關(guān)系密切，兩者通常形成復(fù)合物而共同作用。Atianand et al[11]發(fā)現(xiàn)lincRNA EPS聯(lián)合hnRNP L可以抑制巨噬細(xì)胞對(duì)LPS介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答，而其中M1巨噬細(xì)胞在應(yīng)答中發(fā)揮重要作用；由lncRNA形成的調(diào)節(jié)復(fù)合物能夠指導(dǎo)巨噬細(xì)胞等免疫譜系的發(fā)育。因此，lincRNA-EPS與hnRNP L可能共同參與巨噬細(xì)胞的極化。但其與hnRNP L在巨噬細(xì)胞極化中的關(guān)系及其特定的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

此研究揭示了hnRNP L在HCC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，并與HCC的惡性特征相關(guān)。此外，HCC中hnRNP L表達(dá)水平的增加與巨噬細(xì)胞的極化相關(guān)。然而，hnRNP L參與HCC發(fā)展的特異性分子機(jī)制及其對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響仍需要進(jìn)一步研究。