外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞角蛋白19片段21-1檢測在非小細(xì)胞肺癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值

官燕飛，陳健鋒，袁 斌，劉 君，陳 昂，袁春雷，童輝純，陳志強(qiáng)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占全部肺癌的85%，5年生存率僅為16.10%，位居全球惡性腫瘤死亡率的榜首[1]。2015年中國NSCLC發(fā)病例數(shù)約50萬，同年，死亡的NSCLC病例則達(dá)到40萬，嚴(yán)重危害人們生命安全[2]。究其主因是缺乏有效的早期診斷方法，NSCLC確診時(shí)70%～80%均為中晚期。國內(nèi)外學(xué)者研究數(shù)據(jù)證實(shí)：I期NSCLC患者5年生存率可達(dá)60%～70%，而IV期肺癌生存率則不到5%[3-4]。開展早期篩查是降低NSCLC相關(guān)死亡率、顯著提高其5年生存率的關(guān)鍵。但是目前尚無公認(rèn)的NSCLC早期篩查最佳模式。因此，尋找診斷效能高的NSCLC早期篩查方法顯得非常緊迫。該研究通過檢測肺部健康組、良性組及惡性組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)和細(xì)胞角蛋白19片段21-1(cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA21-1)水平，比較CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測在三組的陽性率差異及診斷NSCLC的效能差異，綜合評估CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合診斷NSCLC的價(jià)值，為探討一種無創(chuàng)而便捷、敏感又特異的NSCLC篩查手段提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料臨床回顧并通過隨機(jī)數(shù)字表選取2017年2月～2018年10月中山市博愛醫(yī)院、中山大學(xué)腫瘤防治中心的172例肺部健康體檢者(健康組)、156例肺部良性病變患者(良性組)、118例NSCLC患者(惡性組)作為研究對象?；颊呔鶠樵l(fā)性肺部病變或腫瘤，未合并其他腫瘤。健康組：男98例，女74例，年齡16.9～86.3(40.6±6.9)歲；良性組：男88例，女68例，年齡21.5～78.9(41.8±5.8)歲；惡性組男68例，女50例，年齡34.6～81.5(42.5±6.3)歲。三組之間的年齡及性別構(gòu)成比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

NSCLC的入選參照《2015 版WHO肺部腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)》執(zhí)行，包括：腺癌、鱗癌、腺鱗癌、大細(xì)胞肺癌[5]。NSCLC的TNM分期參照國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)2017年第8版分期執(zhí)行，包括：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期[6]。良性組：包括肺良性腫瘤、肺塵埃沉著病、慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核、肺炎等良性病變患者。抽取三組研究病例的靜脈血液標(biāo)本并檢測CTC與CYFRA21-1水平。CTC和CYFRA21-1聯(lián)合檢測采用的是平行試驗(yàn)，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為：兩個(gè)檢測結(jié)果中只要有一個(gè)結(jié)果為陽性即診斷為陽性；反之，只有兩個(gè)結(jié)果均為陰性才診斷為陰性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過，獲得研究對象的知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要試劑及儀器 COBAS E601全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及CYFRA21-1檢測試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，CTC分離富集、檢測試劑盒及PathfinderTM CYTTEL READER and ANALYZER全自動掃描圖像分析系統(tǒng)購自萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2.2CYFRA21-1檢測及判定標(biāo)準(zhǔn) 采用電化學(xué)發(fā)光方法檢測CYFRA21-1水平，質(zhì)控品檢測值在設(shè)定的范圍內(nèi)。參考試劑說明書及相關(guān)文獻(xiàn)[7]，CYFRA21限值為3.3 ng/ml。CYFRA21≥3.3 ng/ml，提示CYFRA21檢查結(jié)果異常。本研究中定為陽性；CYFRA21<3.3 ng/ml，CYFRA21檢查結(jié)果正常，本研究中定為陰性。

1.2.3CTC分離富集、檢測及判定標(biāo)準(zhǔn) 陰性富集CTC技術(shù)基于免疫學(xué)原理，借助免疫磁微粒技術(shù)，通過逐步去除血液中的血漿、紅細(xì)胞、白細(xì)胞等成分，實(shí)現(xiàn)血液中CTC的富集。imFISH CTC鑒別技術(shù)，將基因水平的FISH技術(shù)和蛋白水平的免疫熒光染色技術(shù)結(jié)合，建立的兼具細(xì)胞形態(tài)和核遺傳變異的精準(zhǔn)CTC鑒別方法。操作流程及判定標(biāo)準(zhǔn)，參考試劑盒及相關(guān)文獻(xiàn)[8]：抽取研究對象的靜脈血，ACD抗凝，混勻，血漿分離、紅細(xì)胞裂解、白細(xì)胞去除、涂片干燥、免疫熒光染色、鏡下觀察。將細(xì)胞核內(nèi)探針信號>2個(gè)，無血源性白細(xì)胞表面抗原(紅色)陽性的細(xì)胞定為CTC。CTC數(shù)目≥2個(gè)的患者定為CTC陽性患者。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測在三組的陽性率差異及診斷NSCLC的效能(靈敏度、特異度、符合率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值)差異的比較采用χ2檢驗(yàn)?？傮w差異檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。三組間進(jìn)一步做兩兩比較時(shí)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α′=0.02(0.05/3)。TNM分期的I到Ⅳ期間進(jìn)一步做兩兩比較時(shí)檢驗(yàn)標(biāo)水準(zhǔn)α″=0.008(0.05/6)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者八號染色體(CEP8)探針信號表達(dá)情況熒光顯微鏡下顯示，NSCLC患者CEP8探針信號從0-1個(gè)(非CTC，亞二倍體)，2個(gè)(二倍體)，3到數(shù)個(gè)(CTC，超二倍體)不等，染色體數(shù)量具有多樣性。圖1中藍(lán)色部分為細(xì)胞核DAPI染色，橙色部分為探針?biāo)谖恢谩?/p>

圖1 NSCLC患者八號染色體(CEP8)探針信號表達(dá)情況 ×400

A：未檢測到探針信號(CEP8信號缺失)；B：僅檢測到1個(gè)探針信號(CEP8信號缺失)；C：檢測到2個(gè)探針信號(二倍體)；D：NSCLC患者CTC(三倍體)；E：NSCLC患者CTC(四倍體)；F：NSCLC患者CTC(五倍體)

2.2 CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測在三組研究對象中陽性率的差異CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測在肺部健康組、良性組與惡性組的陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽性率均在惡性組中最高。進(jìn)一步做兩兩比較，與健康組與良性組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.02)。見表1。

表1 CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測在三組研究對象中陽性率的比較[n(%)]

2.3 CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測在惡性組各TNM分期中陽性率的比較CTC檢測陽性率在惡性組的各TNM分期中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.18，P=0.03)，CTC的陽性率跟惡性組TNM分期相關(guān)，隨著分期的增加而增加，在Ⅳ期中最高。CYFRA21-1、CTC聯(lián)合CYFRA21-1檢測的陽性率，在不同的TNM分期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，跟TNM分期無關(guān)。見表2。

2.4 CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測診斷NSCLC的效能比較CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測診斷NSCLC靈敏度、特異度、符合率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值總體差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。靈敏度最高的是CTC聯(lián)合CYFRA21-1檢測法，與CTC、CYFRA21-1單獨(dú)檢測差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.02)。特異度最高的是CTC檢測法，與CYFRA21-1、聯(lián)合檢測差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.02)。符合率最高的是CTC檢測法，與CYFRA21-1檢測差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.02)。陽性預(yù)測值最高的是CTC檢測法，與CYFRA21-1、聯(lián)合檢測差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.02)。陰性預(yù)測值最高的是CTC聯(lián)合CYFRA21-1檢測法，與CYFRA21-1檢測差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.02)。約登指數(shù)最大的是CTC聯(lián)合CYFRA21-1檢測法(達(dá)到0.864 5)。見表3。

3 討論

目前NSCLC早期篩查方法是：低劑量CT掃描(LDCT)篩查和血液分子標(biāo)志物的檢測。研究[9]表明：與普通X線比較，對NSCLC的高危人群進(jìn)行LDCT篩查可使其死亡率下降20.3%。而傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物對早期NSCLC的篩查敏感性和特異性較低[10]。因此，傳統(tǒng)的NSCLC篩查方案也許警示研究人員另辟蹊徑建立一種更為高效的篩查模式顯得日益迫切。

研究[11]證實(shí)：CTC的出現(xiàn)可能更優(yōu)先于影像學(xué)能發(fā)現(xiàn)更微小病灶。研究[12-13]表明： CYFRA21-1對早期NSCLC輔助診斷中具有一定的臨床意義。但是，CTC聯(lián)合CYFRA21-1檢測診斷NSCLC的價(jià)值，尚未見報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示CTC、CYFRA21-1、CTC與CYFRA21-1聯(lián)合檢測跟肺部病變程度緊密相關(guān)。至于研究中CTC出現(xiàn)于肺部良性病變患者中，可能是肺部良性病變(如慢性阻塞性肺疾病患者)發(fā)生后，機(jī)體處于一種應(yīng)急狀態(tài)，血液中出現(xiàn)了CTC。而CYFRA21-1出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的良性組患者中，與Holdenrieder et al[14]研究報(bào)道的急性肺炎、肺結(jié)核患者中該指標(biāo)明顯升高，容易影響診斷實(shí)驗(yàn)特異性的結(jié)論基本一致。

表2 CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測在惡性組各TNM分期中陽性率的比較

表3 CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測診斷NSCLC的效能比較

本研究通過CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測在惡性組各TNM分期中陽性率的比較，可得出一個(gè)結(jié)論：CTC的陽性率跟惡性組TNM分期是緊密相關(guān)的，這一發(fā)現(xiàn)可能有助于病情的治療與預(yù)后，進(jìn)而提高NSCLC的生存率。

本研究通過CTC、CYFRA21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢測診斷NSCLC的效能比較，結(jié)果顯示，CTC作為一種新型的無創(chuàng)性檢測手段，在區(qū)分NSCLC與肺部良性病變，預(yù)測惡性組的TNM分期，診斷NSCLC中均有較好的作用。但是，CTC與CYFRA21-1聯(lián)合檢測能表現(xiàn)出更佳的綜合性能，可能更有助于減少NSCLC的誤診和漏診，因而建議在臨床診療中進(jìn)行聯(lián)合檢測實(shí)用價(jià)值更高。

熒光顯微鏡下NSCLC患者CEP8探針信號從0～1個(gè)(非CTC)，3到多倍體(CTC)不等。之所以出現(xiàn)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能跟NSCLC患者腫瘤的基因突變發(fā)生方式有關(guān)，正常細(xì)胞是以染色體二倍體的形式出現(xiàn)(如圖1C)。但是，部分患者發(fā)生基因的缺失突變后，染色體畸變?yōu)橐粭l甚至為零，圖1A和圖1B即為亞二倍體。而另外部分患者則發(fā)生了染色體數(shù)目的變化，增加了一條或者數(shù)條，圖1D、1E、1F即為超二倍體?？傊?，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生異常改變，腫瘤細(xì)胞基因發(fā)生突變，細(xì)胞DNA含量增高或者減低，染色體可以出現(xiàn)三倍體、四倍體，甚至是多倍體。也可以出現(xiàn)染色體丟失的變化。而這種染色體異倍體變化常常優(yōu)先于腫物的出現(xiàn)。因此，染色體CTC的檢測，有助于對癌變的腫瘤作出早期診斷。

綜上所述， CTC和CYFRA21-1聯(lián)合檢測與單獨(dú)檢測相比，在NSCLC篩查及分期中擁有較高的綜合性能。這一結(jié)論與腫瘤的多因素、多步驟的發(fā)生機(jī)制吻合。本研究從CTC(染色體角度)和CYFRA21-1(腫瘤標(biāo)志物角度)兩個(gè)不同角度進(jìn)行聯(lián)合檢測，效果高于單個(gè)角度。

本研究盡管受到研究時(shí)限及樣本容量的限制，初步得到了聯(lián)合檢測對NSCLC篩查及臨床分期較有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論。后續(xù)的研究中我們將在擴(kuò)大樣本容量的同時(shí)，進(jìn)一步深入探討CTC與CYFRA21-1聯(lián)合檢測與NSCLC的耐藥性、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、療效評估、生存評估等的相關(guān)性，或許能對NSCLC的生物學(xué)行為及腫瘤機(jī)制有更深刻的理解，能進(jìn)一步促進(jìn)NSCLC的精準(zhǔn)治療，有效地提高NSCLC患者生存率。