張 靜 ，高 雅 ，李新宇 ，朱香熹 ，孫碩遙 ，肖 可 ，王 靜 ，劉嘉岳 ，趙玉龍 ，李光明 ，朱 澤

（1.天津醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070；3.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)臨床醫(yī)學(xué)系，珠海519090；4.多倫多大學(xué)圣喬治校區(qū)，多倫多ONM5S）

惡性外周神經(jīng)鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一類具有高度惡性，發(fā)展迅速，易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)且預(yù)后差的侵襲性軟組織肉瘤，約占所有軟組織肉瘤的5%～10%，其中將近50%的MPNST與NF1基因相關(guān)，NF1的病人一生中有10%～15%的風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)變成MPNST[1-4]。另外，腫瘤抑制因子（TP53和p16INK4A）的喪失和生長(zhǎng)因子受體信號(hào)（例如EGFR或PDGFR）過度激活在神經(jīng)纖維瘤的惡性轉(zhuǎn)化中也起著重要作用。因此，基于這種關(guān)聯(lián)，MPNST最經(jīng)典基因?qū)W研究大多集中在NF1基因的缺失以及TP53和CDKN2A/p16基因的缺失上[5]。然而最近的一些對(duì)MPNST病人的組織標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序的研究結(jié)果顯示，在MPNST中PRC2的組成單元SUZ12和EDD的突變失活也屬頻發(fā)事件[5-9]。PRC2可以調(diào)節(jié)組蛋白H3的27位點(diǎn)上的酪氨酸三甲基化，而SUZ12作為PRC2復(fù)合體的重要組分，可以通過穩(wěn)定PRC2復(fù)合體保證H3K27me3在表觀遺傳修飾過程中功能正常發(fā)揮。

CRISPR/Cas9是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)，通過crRNA識(shí)別、Cas蛋白裂解來抵抗病毒和噬菌體的入侵，因其敲除效率高，脫靶率低，敲除效果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)被用于替代傳統(tǒng)的TALEN技術(shù)和ZEN技術(shù)，已成為一種主流的基因編輯工具[10-11]。因此，為了進(jìn)一步研究SUZ12基因在MPNST中的作用，筆者使用慢病毒載體構(gòu)建SUZ12過表達(dá)及CRISPR/Cas9敲減的MPNST穩(wěn)定細(xì)胞株，為針對(duì)SUZ12在MPNST中的生物學(xué)功能、作用機(jī)制和疾病診斷治療的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 ST88-14細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院楊吉龍教授饋贈(zèng)；293T細(xì)胞和大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)保存；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；慢病毒載體系統(tǒng)（GV492、GV371、pHelper1.0、pHelper2.0），Lenti-CAS9-puro 慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Promega公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Genechem公司；FastQuant RT Kit、SuperRealPreMix Plus購(gòu)自天根公司；SUZ12引物由北京索真公司合成；MTT試劑盒購(gòu)自索萊寶公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MPNST細(xì)胞系ST88-14在含10%的胎牛血清和1%的雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，7.5% CO2溫箱中孵育。

1.3 SUZ12基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1 SUZ12目的基因PCR擴(kuò)增 SUZ12基因PCR擴(kuò)增引物，正向引物：5′-AGGTCGACTCTAGA GGATCCCGCCACCATGGCGCCTCAGAAGCACGGC GGTG-3′，反向引物：5′-TCCTTGTAGTCCATACCG AGTTTTTGTTTTTTGCTCTGTTTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為2 261bp。PCR 體系反應(yīng)條件：98℃ 5 min，98℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 90 s，循環(huán) 30次，72 ℃ 8 min。擴(kuò)增完成后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定結(jié)果。

1.3.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建 將GV492載體用BamHI/AgeI酶切，PCR產(chǎn)物與載體進(jìn)行交換，構(gòu)建重組質(zhì)粒（設(shè)置一組不含SUZ12片段的質(zhì)粒作為對(duì)照組）。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，將其涂布在含有氨芐青霉素的平板上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，之后進(jìn)行菌落PCR的鑒定，正義鏈：5′-GATGTTAATGAAGGAGAGAAAG-3′，反義鏈：5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑菌，質(zhì)粒抽提，進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.4 SUZ12敲減載體的構(gòu)建

1.4.1 sgRNA靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)與合成 在NCBI中明確SUZ12基因的CDS外顯子區(qū)域，使用麻省理工學(xué)院的CRISPR設(shè)計(jì)工具（http//crispr.mit.edu/）設(shè)計(jì)3對(duì)SUZ12基因的sgRNA序列，并在其兩端加入BbsⅠ位點(diǎn)，序列見表1。引物退火形成帶有粘性末端的雙鏈，稀釋200倍后使用。

表1 3對(duì)特異性sgRNA序列Tab 1 3 pairs of specific sgRNA sequences

1.4.2 sgRNA載體的構(gòu)建 將GV371載體用BbsⅠ酶切，與退火形成雙鏈的sgRNA混合，配置酶切連接反應(yīng)體系進(jìn)行連接，酶切體系：Vector plasmid（100 ng/μL）1 μL，Oligo 雙鏈 DNA（0.089 μmol/L）2 μL，10×Buffer Tango 2 μL，DTT（10 mmol/L）1 μL，ATP (10 mmol/L)1 μL，T7 DNA Ligase 0.5 μL，BbsI 1 μL，H2O 11.5 μL；將上述反應(yīng)物置于 PCR 儀，37 ℃5 min，21 ℃ 5 min，16 ℃ 30 min，共 6 個(gè)循環(huán)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，接種到含Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中過夜。挑菌，質(zhì)粒抽提，進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 慢病毒包裝與滴度測(cè)定

1.5.1 慢病毒包裝 將GV載體質(zhì)粒、pHelper1.0載體質(zhì)粒、pHelper 2.0載體質(zhì)粒按照一定比例（20 μg∶15 μg∶10 μg） 加到 2.4 mL 的 Opti-MEM 和 100 μL的Lipofectamine2000中，共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后收集293T細(xì)胞上清液，超速離心去除上清，加入病毒保存液，充分溶解后，高速離心，分裝上清，-80℃保存。

1.5.2 慢病毒的滴度檢測(cè) 測(cè)定前24 h，接種293T細(xì)胞到96孔板（4×104個(gè)/孔）：在EP管中加入90 μL的無血清培養(yǎng)基，取待測(cè)的病毒原液10 μL加入到EP管中，倍比稀釋到最后一管；棄去293T細(xì)胞培養(yǎng)基，加入90 μL稀釋好的病毒溶液，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24 h后加入完全培養(yǎng)基，96 h后觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.6 確定慢病毒感染的最適MOI，以及嘌呤霉素（Puro）篩選的最適劑量

1.6.1 感染預(yù)實(shí)驗(yàn) ST88-14細(xì)胞在病毒感染前一天鋪板，至細(xì)胞匯合度為20%～30%；病毒于冰上融化，依次將病毒稀釋至滴度 1×108TU/mL，1×107TU/mL，1×106TU/mL，吸棄培養(yǎng)液加入病毒及相應(yīng)感染增強(qiáng)液，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；感染72 h后，用熒光顯微鏡觀察感染效率。

1.6.2 確定嘌呤霉素的最適劑量 將ST88-14細(xì)胞接種于48孔板中，48 h后加入Puro進(jìn)行篩選，Puro 濃度梯度設(shè)置為 0、0.5、1、2、4、6 μg/mL；Puro處理48 h后細(xì)胞全部死亡的最低藥物濃度作為篩選穩(wěn)定株的藥物濃度。

1.7 慢病毒感染ST88-14細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞株的建立1.7.1 過表達(dá)穩(wěn)定株的構(gòu)建 制備密度為3～5×104個(gè)/mL的ST88-14細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種到96孔板中，37℃培養(yǎng)24 h；病毒冰上融化，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)MOI值進(jìn)行稀釋；吸棄培養(yǎng)液加入病毒及相應(yīng)感染增強(qiáng)液，在37℃、7.5% CO2溫箱中培養(yǎng)，12h后換回常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；感染72 h后，加入2 μg/mL的Puro篩選48 h以上。之后降低Puro濃度到1 μg/mL，繼續(xù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選和擴(kuò)增，同時(shí)收集細(xì)胞行下游RT-qPCR檢測(cè)。

1.7.2 CRISPR/Cas9敲除穩(wěn)定株的構(gòu)建 制備密度為 3～5×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，每孔 100 μL 接種到96孔板中，37℃培養(yǎng)24 h；Cas9病毒冰上融化，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)MOI值適當(dāng)稀釋；吸棄培養(yǎng)液加入病毒及相應(yīng)感染增強(qiáng)液，在37℃，7.5% CO2溫箱中培養(yǎng)，12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；感染72 h后，加入2 μg/μL的 puromycin篩選至少 48 h以上，得到ST88-14-Cas9細(xì)胞。將ST88-14-Cas9細(xì)胞鋪6孔板，用含1 μg/mL劑量的Puro的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至30%，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)感染條件分別感染3個(gè)sgRNA的Lenti-sgRNA-GFP病毒，12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)液，感染48～72 h后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)情況。用含1 μg/mL的Puro的完全培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)傳代、擴(kuò)增進(jìn)行鑒定。

1.8 SUZ12過表達(dá)和敲減穩(wěn)定株的鑒定

1.8.1 熒光顯微鏡觀察 用含1 μg/mL Puro篩選兩周后，用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)效率，并拍照。

1.8.2 RT-qPCR鑒定 用TRIzol提取SUZ12過表達(dá)組和敲減組總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)，SUZ12 引物序列為：SUZ12-F：AGAAAACGAAATCGTGAGGATGG；SUZ12-R：GCAC GTAGGTCCCTGAGAAA。PCR反應(yīng)體系為:cDNA template 4 μL，Primer F （20 μmol/L）2 μL，Primer R（20 μmol/L）2 μL，SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Rox Dye 0.04 μL，加水至 20 μL；PCR 反應(yīng)條件：98℃ 2 min，98℃ 10 s，68 ℃ 30 s，循環(huán) 40次，95 ℃ 15 s，60℃1 min，99℃15 s。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.9 SUZ12過表達(dá)和敲減組細(xì)胞增殖活性的測(cè)定 胰酶消化各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種到96孔板；分別在 24、48、72 h后棄上清，加入90 μL完全培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液，孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清，每孔加入110 μL DMSO溶液，避光震蕩10 min，490 nm處測(cè)吸光度，繪制增長(zhǎng)曲線。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0處理數(shù)據(jù)，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 過表達(dá)重組質(zhì)粒SUZ12的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后得到一個(gè)2 261bp的特異性條帶，與預(yù)期大小一致，見圖1。GV492載體經(jīng)BamHI/AgeI酶切后與SUZ12基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌后進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，得到469bp的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，見圖2。酶切鑒定陽(yáng)性的克隆經(jīng)過測(cè)序，結(jié)果與NCBI中的人SUZ12基因（ID：23512）進(jìn)行比對(duì)，序列一致，表明過表達(dá)重組載體構(gòu)建成功。

圖1 SUZ12基因擴(kuò)增電泳圖Fig 1 PCR amplification of SUZ12

圖2 重組載體PCR產(chǎn)物鑒定及瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 2 Identification of recombinant vector and agarose gel electrophoresis

2.2 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建 為了提高敲除效率，設(shè)計(jì)并合成了3條sgRNA靶向序列，載體GV371（U6-sgRNA-SV40-EGFP）BbsⅠ酶切后，分別與退火獲得的3個(gè)目的片段sgRNA連接過夜，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞、涂板、挑菌、質(zhì)粒抽提、送測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明插入的片段序列與設(shè)計(jì)合成的靶向SUZ12序列一致，見圖3。

圖3 sgRNA表達(dá)載體陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子測(cè)序峰圖Fig 3 sgRNAexpressionvectorpositiveclonetransformantsequencing peak map

2.3 病毒滴度的測(cè)定 在倒置熒光顯微鏡下觀察加入不同稀釋倍數(shù)病毒原液的293T細(xì)胞熒光表達(dá)情況顯示，熒光細(xì)胞的數(shù)目隨病毒稀釋倍數(shù)的增加而逐漸減少，估算過表達(dá)慢病毒和3種Lenti-sgRNA的病毒滴度分別為 5×108TU/mL、1×109TU/mL、1×109TU/mL 和 1.5×109TU/mL，見圖 4。

圖4 不同稀釋倍數(shù)的慢病毒感染293T細(xì)胞的熒光表達(dá)情況（×200）Fig 4 Fluorescenceexpressionsof293Tcellsinfectedwithlentiviruses at different dilutions(×200)

2.4 慢病毒感染的最適MOI及嘌呤霉素篩選的最適劑量 在不同濃度病毒感染ST88-14細(xì)胞72 h后，用顯微鏡觀察熒光表達(dá)豐度，感染效率80%左右，細(xì)胞生長(zhǎng)良好的組所對(duì)應(yīng)的MOI值即可作為后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)的依據(jù)，確定MOI=10為CRISPR/Cas9慢病毒的最佳感染條件，MOI=100為過表達(dá)慢病毒的最佳感染條件，見圖5。待ST88-14細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)加入不同濃度的Puro，篩選48 h以上，當(dāng)Puro的濃度大于等于2 μg/mL時(shí)，ST88-14細(xì)胞全部死亡，因而確定Puro最適劑量為2 μg/mL，見圖6。

2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染ST88-14細(xì)胞的結(jié)果 慢病毒轉(zhuǎn)染ST88-14細(xì)胞2周后，用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，鏡下均可見大量綠色熒光蛋白，并且熒光隨著細(xì)胞傳代可持續(xù)表達(dá)（圖7）。

2.6 穩(wěn)定株細(xì)胞的篩選及鑒定 構(gòu)建好的SUZ12過表達(dá)及敲減慢病毒分別感染ST88-14細(xì)胞后，經(jīng)Puro篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，提取RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。PT-qPCR結(jié)果顯示過表達(dá)組SUZ12 mRNA表達(dá)量明顯較對(duì)照組高（P＜0.05），敲減組SUZ12 mRNA表達(dá)量相比對(duì)照組明顯減少（P＜0.05）。由此說明，SUZ12過表達(dá)和敲減的ST88-14穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功，見圖8。

圖5 過表達(dá)組相同感染條件下不同濃度病毒感染效率比較（×200）Fig 5 Comparison of virus infection efficiency at different concentrations in the same infection conditions(×200)

圖6 不同濃度嘌呤霉素篩選48 h后ST88-14的細(xì)胞狀態(tài)Fig 6 Cell state of ST88-14 after 48 hours at different concentrations of puromycin

圖7 慢病毒轉(zhuǎn)染ST88-14細(xì)胞后穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白（×200）Fig 7 Stable expression of green fluorescent protein after transfection of ST88-14 cells with lentivirus(×200)

圖8 過表達(dá)和敲減組SUZ12 mRNA相對(duì)表達(dá)情況Fig 8 Relative expression of SUZ12 mRNA in overexpressed and knockdown groups

2.7 SUZ12基因過表達(dá)抑制MPNST細(xì)胞增殖 SUZ12過表達(dá)和敲減穩(wěn)定株構(gòu)建完成后，用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞增殖活性的改變。MTT結(jié)果顯示，過表達(dá)組的細(xì)胞增殖活性與陰性對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.05），敲減組的細(xì)胞增殖活性與陰性對(duì)照組相比明顯升高（P＜0.05）。表明SUZ12基因過表達(dá)抑制MPNST細(xì)胞增殖。見圖9。

圖9 過表達(dá)和敲除組細(xì)胞增殖活性的測(cè)定Fig 9 Determination of cell proliferation activity in overexpression and knockout groups

3 討論

SUZ12是多疏抑制復(fù)合物2（PRC2）必不可少的組成部分，它可以通過調(diào)控組蛋白和DNA甲基化修飾轉(zhuǎn)錄過程，借此以穩(wěn)定PRC2，使PRC2的功能正常發(fā)揮[12]，除此之外，SUZ12還可以影響組蛋白三甲基化的活性，參與EED-EZH2復(fù)合物的功能沉默過程[13]。有研究表明SUZ12在胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、套淋巴細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且，SUZ12表達(dá)量的增加提高了腫瘤細(xì)胞無限增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的能力，影響了患者的預(yù)后[14-18]。SUZ12在上述腫瘤中表達(dá)量增加，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展，然而其在血液系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，這表明SUZ12表達(dá)量的減少也促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展，同時(shí)具有抑癌的作用[19-20]，因而，SUZ12在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了雙向功能。

本研究組在對(duì)12例MPNST全基因組進(jìn)行深度測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，在NF1陰性的散發(fā)性MPNST中，SUZ12基因往往呈現(xiàn)缺失狀態(tài)[3]，這提示我們SUZ12可能在散發(fā)性MPNST的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用。Andrew等結(jié)合了全外顯子測(cè)序隊(duì)列的分析、TCGA提供的公開數(shù)據(jù)，以及對(duì)該疾病的前幾代測(cè)序研究的回顧，分析計(jì)算出了MPNST特異性基因突變率，分別為 NF1（56/64=87.5%），SUZ12（69/123=56.1%），EED（40/123=32.5%），TP53（29/72=40.3%），CDKN2A（54/72=75.0%）[5-9]，也證實(shí)在 MPNST 中大多存在SUZ12基因的缺失。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MPNST患者中存在PRC2不同組分功能喪失性突變，而SUZ12和EED的缺失性突變又阻斷了H3K27me3的甲基化進(jìn)程，導(dǎo)致H3K27me3缺失，引起PRC2染色質(zhì)調(diào)節(jié)信號(hào)通路失活[21]。研究者在10%～25%的腎癌、肺癌、胃癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)了H3K36me3的缺失[22-25]，而H3K36me3的缺失與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)相關(guān)基因存在協(xié)同致死效應(yīng)，WEE1抑制劑AZD1775對(duì)H3K36me3缺失的細(xì)胞更加敏感[26]，本課題組之前對(duì)43例MPNST的組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)H3K27me3在65.11%的MPNST患者中均缺失[27]，而H3K36me3缺失可以作為用藥靶點(diǎn)也為由PRC2組分突變所致H3K27me3缺失的腫瘤提供了一個(gè)表觀遺傳學(xué)的治療策略。

本課題組所用的腫瘤細(xì)胞系屬于神經(jīng)細(xì)胞，而神經(jīng)細(xì)胞具有不可分裂的特性，使外源片段的導(dǎo)入比較困難，慢病毒載體是由人類免疫缺陷病毒（HIV-1）改造后產(chǎn)生，具有感染效率高、基因片段容量大、持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)且可感染分裂和非分裂細(xì)胞的特點(diǎn)，因此選用慢病毒載體作為基因操作的工具。CRISPR/Cas9是一項(xiàng)新興的基因編輯技術(shù)，自問世以來，已廣泛應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域的科學(xué)研究，而且有研究表明，CRISPR/Cas9即使不進(jìn)行單克隆篩選，也可永久顯著敲低目的基因的表達(dá)水平[28]。本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒包裝系統(tǒng)制備了SUZ12過表達(dá)和CRISPR/Cas9敲減慢病毒，分別轉(zhuǎn)染ST88-14細(xì)胞后，成功獲得了能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的SUZ12過表達(dá)和敲減穩(wěn)定細(xì)胞株，RT-qPCR的結(jié)果也證明過表達(dá)組SUZ12 mRNA表達(dá)量明顯較對(duì)照組高（P＜0.05），敲減組SUZ12 mRNA表達(dá)量相比對(duì)照組明顯減少（P＜0.05）。MTT結(jié)果顯示，過表達(dá)組的細(xì)胞增殖活性與陰性對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.05），敲減組的細(xì)胞增殖活性與陰性對(duì)照組相比明顯升高（P＜0.05）。由此說明，SUZ12基因過表達(dá)抑制MPNST細(xì)胞增殖。

綜上所述，筆者通過本課題組和其他實(shí)驗(yàn)室的研究數(shù)據(jù)確定了SUZ12基因在MPNST中處于缺失狀態(tài)，而H3K36me3缺失可以作為治療靶點(diǎn)也為PRC2組分缺失突變所致的H3K27me3缺失提供了治療策略，因此筆者構(gòu)建了SUZ12過表達(dá)和敲減的MPNST穩(wěn)定細(xì)胞株，初步探索SUZ12基因表達(dá)狀態(tài)的變化所引起細(xì)胞增殖的改變，本課題組將進(jìn)一步在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中探索細(xì)胞侵襲遷移、周期等功能的改變，以闡明PRC2功能失活在MPNST的發(fā)病演進(jìn)中的作用及其分子機(jī)制，并為MPNST的治療提供了一個(gè)基于表觀遺傳學(xué)的治療策略。