徐微 劉雅雯 龔愛華

[摘要] 長鏈非編碼RNA（lncRNA）在許多人類癌癥中失調，包括結腸直腸癌（CRC），它是世界上第三大常見的癌癥，與預后不良有關;與此同時，一些lncRNA作為抑癌基因或致癌基因參與CRC的發(fā)生發(fā)展，在診斷、治療及預后方面具有重要價值。lncRNA可以以微泡、外泌體或蛋白質復合物的形式進入人體循環(huán)系統(tǒng)，形成穩(wěn)定的循環(huán)lncRNA，且其濃度水平在健康受試者和患者之間存在差異，可以作為一種新穎、易于獲取、無創(chuàng)的檢測工具。本文簡要回顧近年來關于循環(huán)lncRNA生物學特性的研究進展，著重分析了循環(huán)lncRNA作為結腸直癌篩查和預后監(jiān)測生物標志物的潛在應用。

[關鍵詞] 循環(huán);長鏈非編碼RNA;外泌體;結直腸癌;分子診斷

[中圖分類號] R574.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（b）-0026-05

[Abstract] Long noncoding RNA （lncRNA） is dysregulated in many human cancers， including colorectal cancer （CRC）， which is the third most common cancer in the world and is associated with poor prognosis; at the same time， some lncRNAs are involved in the development of CRC as tumor suppressor genes or oncogenes and are of great value in diagnosis， treatment and prognosis. LncRNA can enter the human circulatory system in the form of microbubbles， exosomes or protein complexes， forming stable circulating lncRNA. Its concentration level is different between healthy subjects and patients， which can be used as a novel， affordable， lightly accessible， non-invasive detection tool. This article briefly reviews recent advances in the biological properties of circulating lncRNA， focusing on the potential applications of circulating lncRNA as a biomarker for colorectal cancer screening and prognosis monitoring.

[Key words] Circulating; Long noncoding RNA; Exosome; Colorectal cancer; Molecular diagnosis

據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，結直腸癌（CRC）是全球男性和女性中第三大常見的癌癥，在癌癥患者死亡中排名第二[1]。結腸鏡檢查是CRC篩查的金標準，然而，由于其價格昂貴，需要預先進行腸道準備，有腸穿孔等并發(fā)癥，或者患者肛管直腸狹窄，有腹膜刺激癥狀、嚴重心肺功能等基礎疾病，因此不能作為一些參與者的篩查或者初始測試[2-3]。此外，目前已知的腫瘤生物標志物如癌胚抗原（CEA）和CA125尚未充分顯示出對檢測癌前病變和早期腫瘤足夠的敏感性和特異性。近年來，檢測癌癥患者體液中與癌癥相關的長鏈非編碼RNA（lncRNA）已被證明是一種特別有價值的診斷癌癥的方法。與傳統(tǒng)的腫瘤組織活檢比較，循環(huán)lncRNA在腫瘤診斷和預后方面具有更大的優(yōu)勢，尤其是其非侵襲性，在臨床常規(guī)應用方面具有很大的潛力[4-6]。因此，本文在討論循環(huán)lncRNA分泌機制的基礎上，重點綜述其在CRC診斷、治療和預后中的潛在應用。

1 循環(huán)LncRNA簡介

人類基因組廣泛轉錄，蛋白質編碼基因卻只占其中的2%，絕大多數轉錄本是非編碼RNA（ncRNAs），對細胞生長或疾病發(fā)展方面發(fā)揮著巨大的作用[7]。NcRNAs分為短鏈非編碼RNA（20～200 nt）和長鏈非編碼RNA（200 nt～10 kb）。lncRNA占ncRNAs的80%以上[8]，作為功能性RNA，可以調節(jié)其他ncRNA的活性，特別是微小RNA（miRNA），通過充當“海綿”，將miRNA遠離天然mRNA靶標（從而充當競爭性內源RNA，ceRNA）。但其作為非編碼RNA仍然存在爭議，最近的分析表明核糖體可參與一些lncRNA的調節(jié)過程，生成小肽[9]。lncRNA的表達模式也非常特殊，可分為正義lncRNA（sense lncRNA）、反義lncRNA（antisense lncRNA）、雙向lncRNA（bidirectional lncRNA）、基因間lncRNA（intergenic lncRNA）、基因內lncRNA（intronic lncRNA）[10]。目前，雖然尚未完全了解lncRNA釋放到細胞外環(huán)境中的確切機制，但已有研究[11-12]表明，一些lncRNA可以以穩(wěn)定形式存在于血清、血漿和其他體液中，不受內源性RNA酶的影響。因此，循環(huán)lncRNA水平非常適合于患者樣本的非侵入性分析。

1.1 循環(huán)lncRNA生物學特性

lncRNA作為癌癥診斷和預后生物標志物的主要優(yōu)勢之一，是其在體液循環(huán)中的高穩(wěn)定性，尤其是在外泌體中[13]。外泌體是50～150 nm大小的脂質雙層胞外囊泡（EVs），含有核酸（mRNA、ncRNA和DNA）、蛋白質和脂質，由多種細胞類型釋放，被認為在包括癌癥在內的許多疾病中發(fā)揮作用[14-15]。外泌體中包裹的lncRNA可通過脂質雙層保護其不被降解，此外，工程化的外泌體可作為靶向遞送干擾RNA（RNAi）分子的治療載體，避開免疫系統(tǒng)的檢測[16]。這些標志物具有微創(chuàng)性，患者對lncRNA的耐受性更好。例如，Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體HOTAIR的表達能夠區(qū)分聲帶息肉和喉部鱗狀細胞癌，敏感性為92.3%，特異性為57.2%，但結合miR-21，分別提高到94.2%和73.5%。此外，Ren等[18]發(fā)現(xiàn)，癌相關成纖維細胞CAF通過轉移外泌體lncRNA H19促進結直腸癌的干性和化療抗性。

1.2 循環(huán)lncRNA在腫瘤耐藥性方面的研究進展

耐藥性往往是臨床化療失敗的主要原因。舒尼替尼耐藥是治療晚期腎細胞癌（RCC）的主要困難。Le等[19]確定了一種lncRNA——lncARSR（在具有舒尼替尼抗性的RCC中激活的lncRNA），其與臨床上不良的舒尼替尼反應相關。lncARSR通過競爭性結合miR-34/miR-449，促進RCC細胞中的跨膜受體酪氨酸激酶AXL和c-MET表達，從而促進舒尼替尼耐藥。此外，lncARSR可以分泌到外泌體中并傳遞給敏感細胞，從而傳播舒尼替尼耐藥性。用靶向lncARSR或AXL/c-MET抑制劑鎖定核酸治療，使對舒尼替尼耐藥的RCC恢復了對舒尼替尼的反應。因此，lncARSR有可能作為舒尼替尼耐藥的預測因子和潛在治療靶點。最近，另外一項研究[20]發(fā)現(xiàn)，刪除裂殖酵母中的一組基因間lncRNAs顯示出明顯的細胞表型——藥物敏感性。對受影響基因的詳細分析顯示，lncRNA nc-tgp1的轉錄通過抑制鄰近的磷酸酯反應酶基因——甘油磷酸二酯轉運體1[tgp1（+）]來調節(jié)藥物耐受性，lncRNA的轉錄控制裂殖酵母中的藥物耐受性。這表明癌細胞可能利用外泌體衍生的lncRNA來改善化療耐藥性。目前，用于治療CRC患者的化療藥物毒性高，療效因患者而異，特別是存在化療藥物耐藥性，針對這一點，臨床迫切需要開發(fā)工具，可以幫助判斷哪些患者適合特定的藥物，以及降低耐藥性。

2 結直腸癌中循環(huán)lncRNA的重大發(fā)現(xiàn)

結腸癌相關轉錄本1（colon cancer associated transcript 1，CCAT1）位于MYC癌基因的上游，一個被稱為超級增強子的區(qū)域[21]。He等[22]發(fā)現(xiàn)CRC患者血漿中CCAT1水平明顯高于健康對照組，其過表達與CRC的增殖、侵襲性、臨床分期、淋巴結轉移及存活時間相關。HOX轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反轉錄調控功能的lncRNA。已被證明降低HOTAIR的表達可以抑制人CRC干細胞的生長[23]，其不僅在CRC患者的原發(fā)性腫瘤中高度表達，在外周血中也存在[24]。Zhao等[25]檢測發(fā)現(xiàn)HOTAIR和CCAT1在CRC患者血漿中表達上調，而lncRNA-p21的表達水平明顯降低。術后14 d CCAT1和HOTAIR的血漿表達水平較術前明顯降低，lncRNA-p21的表達水平則顯著增加。提示這3種lncRNA的表達量高度相關，聯(lián)合可提高對CRC的診斷效能。

細胞外囊泡是由細胞釋放到體液中小的磷脂包繞的囊泡，根據大小和直徑進行分類，包括AB（50～5000 nm）、MV（50～1000 nm）和EXO（40～100 nm）[26-27]。Dong等[27]收集76例術前CRC患者、76例年齡和性別匹配的健康受試者和20例結直腸腺瘤患者的血清，采用qPCR方法檢測了79個與癌癥相關的長鏈RNA在這三種囊泡中的分布，發(fā)現(xiàn)長鏈RNA的含量在3種細胞外囊泡中具有不同的分布。大多數mRNA和lncRNA在EXO中含量最高，而在MV含量最低，進一步研究發(fā)現(xiàn)，2種mRNA（KRTAP5-4和MAGEA3）以及l(fā)ncRNA（BCAR4）的組合具有最佳診斷能力（AUC = 0.936），且血清EXOs中這3種基因的數量在結直腸腺瘤患者與健康受試者有顯著差異。Dong等[27]再次比較了血清總RNA和EXO中的RNA對預測結直腸癌特異性和敏感性的差異，發(fā)現(xiàn)相同樣本總血清RNA的AUC低于外泌體RNA，提示人體循環(huán)體液中外泌體這一載體介質所包含的RNA作為生物標志物對檢測癌癥具有重要價值。

Wang等[28]使用微陣列分析和qRT-PCR方法確定了1種在CRC患者血漿中表達上調的lncRNA（BANCR）和3種表達下調的lncRNA（NR_026817，NR_029373和NR_034119），然后通過嚴格的逐步選擇程序成功建立了一種獨特的血清4-lncRNA組合用于CRC的檢測。進一步Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)NR_029373和NR_034119可作為CRC特異性生存率的獨立預測因子，是預測CRC預后的潛在生物標志物。同時還證實了即使經室溫放置和反復凍融，4條lncRNAs在血清中仍穩(wěn)定存在。

LOC285194、RP11-462C24.1和Nbla12061組成的3-lncRNA模型可作為CRC的診斷指標，其對CRC的診斷能力明顯高于CEA、CA199、CA125和CA724，且聯(lián)合檢測可大大提高診斷能力。Wang等[29]運用qRT-PCR方法檢測了71例CRC患者和70名健康人血清中17種與CRC相關的lncRNAs水平，其中l(wèi)ncRNA LOC285194、RP11-462C24.1和Nbla12061在CRC患者與健康對照組之間表達差異顯著，同期對比30例CRC患者手術前后血清中3種lncRNAs的水平，發(fā)現(xiàn)術后較術前顯著下降。

HOTAIRM1位于人類HOXA1和HOXA2基因之間，可能作為一種髓系特異性lncRNA，在骨髓形成過程中發(fā)揮調控基因表達的作用[30]。Wan等[31]發(fā)現(xiàn)與匹配的正常結腸組織比較，CRC患者組織和血漿中l(wèi)ncRNA HOTAIRM1的表達水平低于對照組，敲低HOTAIRM1導致與細胞增殖相關基因表達明顯變化并促進細胞增殖，表明其在CRC中起著抑癌作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測HOTAIRM1和CEA可將敏感性由原來的64.00%提高到84.00%，但不影響特異性。因此HOTAIRM1的下調可以作為CRC的生物標志物。最后在所有血漿樣本中（訓練組和驗證組）分析并建立ROC曲線，評估HOTAIRM1、CEA、CA19-9和CA125的敏感性和特異性，并比較其診斷CRC的能力，發(fā)現(xiàn)HOTAIRM1與CEA高度相似，優(yōu)于CA19-9和CA125。

目前，CRC患者血漿中l(wèi)ncRNA—XLOC_ 006844、LOC152578和XLOC_000303Shi上調有助于CRC的診斷。Shi等[32]使用lncRNA微陣列，通過多階段驗證和風險評分公式檢測篩選CRC的潛在生物標志物，發(fā)現(xiàn)CRC中有3個lncRNA—XLOC_006844、LOC152578和XLOC_000303與健康對照組相比顯著上調，在訓練集和驗證集下合并面積（AUC）分別為0.919和0.975，然后通過雙盲及穩(wěn)定性表達驗證試驗發(fā)現(xiàn)，XLOC_006844、LOC152578和XLOC_000303 3條lncRNAs組合能從100例血漿樣品中分辨出50例CRC患者的準確率達85%，且在室溫下對這3個lncRNAs進行了12、24 h的擴增，或者對其進行3個循環(huán)的冷凍和解凍，結果顯示所有的過程對這3種物質濃度幾乎沒有影響，提示這3種lncRNAs在血漿中可穩(wěn)定存在。Yue等[33]的研究檢查了150份血液樣本，其中50份來自術前結腸癌患者，50份來自術后1個月的患者，50份來自健康的個體。結果發(fā)現(xiàn)，術前患者和健康人的循環(huán)lncRNA FER1L4水平無差異，但術后1個月結腸癌患者循環(huán)FER1L4水平降低了70%（35/50）。

3 局限性及未來發(fā)展方向

已證明lncRNA的失調會改變各種癌癥相關的信號通路，而且循環(huán)lncRNA的穩(wěn)定性、與CRC的關系以及易于獲得等特點都表明其具有較強的臨床應用前景，可用實時熒光、高通量測序、基因芯片等常用測序技術[34-35]，但某些局限性仍阻止了它們在臨床中的應用。第一，循環(huán)lncRNA轉錄水平及其轉錄后修飾是不穩(wěn)定和可變的，甚至在疾病的不同階段難以檢測。第二，在內源性控制中，對于循環(huán)lncRNA的量化沒有一個簡單的標準分析或共識。第三，獲得的大多數結果沒有被復制，需要在多個中心和不同人群的大規(guī)模驗證中得到證實。第四，很難確定已分離和量化的循環(huán)lncRNA的來源，因此很難確定這些lncRNAs是由腫瘤組織的細胞分泌出來的，還是由于血細胞污染而被檢測出來的。循環(huán)lncRNAs在CRC中的診斷效率見表1。

4 總結

CRC的發(fā)生發(fā)展遵循一個循序漸進的過程，即正常的結腸上皮轉化為腺瘤性息肉，然后發(fā)展為惡性腫瘤，其治療取決于臨床病理特征，包括TNM分期、組織學和腫瘤邊緣浸潤。血清中獨立或多種lncRNA的組合是篩選CRC及監(jiān)測預后的一種新的補充方法，可能提高臨床應用中CRC的診斷能力，為今后的研究提供新的方向，如循環(huán)lncRNA的來源、功能和臨床價值等。

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（收稿日期：2019-02-25? 本文編輯：封? ?華）