1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院食品藥品工程系 湖南長沙 410208 2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心 湖南長沙 410208 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖南長沙 410128

豬肉作為主要的肉制品來源材料之一，是人們從肉制品中攝入蛋白質(zhì)的主要來源之一。而蛋白質(zhì)又可分為水溶性蛋白質(zhì)，鹽溶性蛋白質(zhì)。鹽溶性蛋白質(zhì)中的肌肉鹽溶性蛋白質(zhì)主要有肌球蛋白，肌動(dòng)蛋白等，這些蛋白是具有形成良好熱誘導(dǎo)凝膠的能力[1]，而熱誘導(dǎo)凝膠能力是肉制品加工過程中重要的功能特性之一，其可以極大影響到加工過程中肉制品的工藝特性和感官品質(zhì)，故而對鹽溶性蛋白質(zhì)的溶解性、凝膠特性的研究一直受到廣泛的關(guān)注[2]。其次，不同蛋白質(zhì)組分也對于熱誘導(dǎo)凝膠形成具有較大影響[3]。

目前已有的研究表明，豬背最長肌鹽溶性蛋白中的肌球蛋白是一種對鹽溶性蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)有著極其重要影響的功能性蛋白[4],有關(guān)雞胸肉鹽溶性蛋白凝膠特性影響的研究結(jié)論也符合豬肉鹽溶性蛋白的結(jié)論[5]。同時(shí),提取鹽溶性蛋白的條件也對鹽溶性蛋白凝膠的質(zhì)地有著影響，如靳紅果[6](2008)等研究了NaCl、MgCl2和pH值對牛背最長肌鹽溶性蛋白質(zhì)，凝膠保水性和凝膠強(qiáng)度的影響；顏偉華[7](2010)等研究了NaCl濃度、pH值、靜置提取時(shí)間及加熱時(shí)間對魚肉鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠保水性和質(zhì)構(gòu)特性的影響。雖然，這類研究在探究提取條件對鹽溶性蛋白質(zhì)凝膠特性影響時(shí)，也調(diào)整過鹽溶性蛋白的提取工藝，但是相關(guān)研究大都一帶而過，同時(shí)不同類型不同部位肉的鹽溶性蛋白含量、結(jié)構(gòu)及蛋白組分也有差異。本實(shí)驗(yàn)主要選擇三個(gè)不同影響因素，NaCl溶液濃度、MgCl2溶液濃度和pH值，探究他們對豬里脊肉的鹽溶性蛋白提取率的影響，并設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

材料:豬肉里脊肉，采購于湖南新五豐食品有限公司同一批次，同一部位的樣本。

試劑：蛋白測定試劑盒(雙縮脲法)，購于南京建成生物科技有限公司；其他常見試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

電子天平CP413型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

可見分光光度計(jì)721型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

可調(diào)速勻漿器FSH-2型，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；

電子恒溫水浴鍋DZKW-4型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

離心機(jī)TGL16M型，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬肉樣品的制備

準(zhǔn)確稱取120g瘦肉、30g肥肉切成小塊，用絞肉機(jī)攪碎成肉糜；稱取4g瘦肉、1g肥肉混合均勻，制作30份留待備用。

1.2.2 豬肉鹽溶性蛋白的提取與測定

準(zhǔn)確稱取5.00g肉糜(4.00g瘦肉、1.00g肥肉)樣本于50mL離心管中，加入40mL(0.2mol/L)pH=6.5的磷酸鹽緩沖液(0.6mol/L NaCl,0.03mol/L MgCl2)，5 000r/min勻漿1.5min,4℃靜置18h,10 000r/min離心15min，取上清液，為鹽溶性蛋白質(zhì)溶液。用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，按照試劑盒指導(dǎo)進(jìn)行測定，蛋白質(zhì)溶液定量后立即使用或置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 不同濃度NaCl的提取實(shí)驗(yàn)

在磷酸鹽緩沖液pH值為7，MgCl2溶液濃度為0.03mol/L的條件下，對比不同濃度NaCl溶液(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mol/L)對于豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響。

1.2.3.2 不同濃度MgCl2的提取實(shí)驗(yàn)

在磷酸鹽緩沖液pH值為7，NaCl溶液濃度為0.3mol/L的條件下，對比不同濃度MgCl2溶液(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L)對于豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響。

1.2.3.3 不同pH值的提取實(shí)驗(yàn)

在NaCl溶液濃度為0.3mol/L，MgCl2溶液濃度為0.03mol/L的條件下，比較不同濃度pH值溶液(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對于豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

想要進(jìn)一步優(yōu)化豬肉糜鹽溶性蛋白提取的較佳參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用spss25.0軟件設(shè)計(jì)L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel2016和IBM SPASS 25.0進(jìn)行整理與分析，采用LSD檢驗(yàn)組間的差異，p<0.05作為差異顯著的標(biāo)志。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同NaCl濃度對豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響

在1.2.3.1實(shí)驗(yàn)中，伴隨著NaCl濃度變化即濃度升高，提取所得豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)濃度變化趨勢，呈現(xiàn)為先升高然后下降(p<0.05)，當(dāng)NaCL濃度達(dá)到0.6mol/L時(shí)，提取所得鹽溶性蛋白質(zhì)溶液濃度達(dá)到最大值(見圖1)。

圖1 不同NaCl濃度下鹽溶性蛋白提取濃度Fig. 1 extraction concentration of salt-soluble protein at different NaCl concentrations

經(jīng)分析，這可能是蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析現(xiàn)象，蛋白質(zhì)的提取受中性鹽的影響，伴隨著中性鹽氯化鈉溶液濃度的變化，改變了蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的電子分布，蛋白質(zhì)分子表面電荷隨之增加，改變了蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用力，即增強(qiáng)兩者之間的作用，反映為蛋白質(zhì)在水溶液中溶解度增加；但是這種現(xiàn)象不會(huì)一直持續(xù)，當(dāng)中性鹽溶液濃度超過一定的閾值時(shí)，就會(huì)抑制蛋白質(zhì)分子溶于水；此外，Pietrasik[8](2003)等研究發(fā)現(xiàn)較低添加量的中性鹽氯化鈉可能會(huì)抑制鹽溶性蛋白的萃取，降低蛋白質(zhì)的水合能力。因此，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選取NaCl溶液濃度為0.5、0.6、0.7mol/L的三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 不同MgCl2濃度對豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響

在實(shí)驗(yàn)1.2.3.2中，伴隨著MgCl2溶液濃度變化即濃度不斷升高，提取所得豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)溶液濃度也隨之變化，變化趨勢大致為先升高后下降(p<0.05)，當(dāng)鹽溶性蛋白質(zhì)濃度達(dá)到最高值時(shí)，此時(shí)MgCl2溶液濃度為0.02mol/L(見圖2)。

圖2 不同MgCl2濃度下鹽溶性蛋白提取濃度Fig. 2 concentration of salt soluble protein extraction at different concentrations of MgCl2

我們已經(jīng)知道，蛋白質(zhì)溶解度的大小受到中性鹽添加量的影響，低濃度稀MgCl2溶液剛開始添加時(shí)，溶液中Mg2+濃度相對增加，溶液中離子強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，離子間相互作用，致使蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用也隨之增強(qiáng)，反映為蛋白質(zhì)溶解度增大，提取濃度升高，Chang H S.[9](2001)等對MgCl2、焦磷酸鈉對雞胸肌肌球蛋白的增溶和凝膠化作用的研究也證明了這一點(diǎn)；但是伴隨著中性鹽氯化鎂溶液濃度的不斷升高，溶液中的Mg2+濃度逐漸超過閾值，過高的Mg2+濃度，對蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的電荷分布造成了影響，降低了蛋白質(zhì)分子的水和能力，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子之間的作用，反映為蛋白質(zhì)溶解度降低，提取濃度隨之下降。

2.3 不同pH對豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響

在實(shí)驗(yàn)1.2.3.3中，伴隨著溶液pH值的增加，提取所得豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)溶液濃度也隨之變化，大致趨勢呈現(xiàn)為先升高而后下降(p<0.05)，當(dāng)鹽溶蛋白質(zhì)溶液濃度達(dá)到最大值時(shí)，此時(shí)pH值為6.5(見圖3)。

圖3 不同pH值下鹽溶性蛋白提取濃度Figure 3 extraction concentration of salt soluble protein at different pH values

多方資料證明，pH值可以用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，高于或者低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)都會(huì)影響到蛋白質(zhì)的溶解度。改變?nèi)芤簆H值，使其高于或低于蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子因此得以攜帶凈的負(fù)電荷或凈的正電荷，同性相斥，蛋白質(zhì)分子間相互作用能力減弱；相對的，蛋白質(zhì)分子和水分子間的相互作用能力增強(qiáng)，反映為蛋白質(zhì)溶解度升高，蛋白質(zhì)提取濃度升高；與之相反的是，當(dāng)溶液pH值靠近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用能力減弱，蛋白質(zhì)分子相互聚集，難以分離。因此，選取pH值為6.0、6.5、7.0三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)中，提取豬肉糜鹽溶性蛋白的各組提取效果數(shù)據(jù)，得出相對較優(yōu)的條件設(shè)置區(qū)間，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，如表1。

表1 因素水平表L9(34)

由方差分析得知，本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，NaCl、MgCl2兩個(gè)因素均對豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取效果有顯著影響(P均小于0.05)，見表2。由極差分析得知，正交試驗(yàn)設(shè)置的三種因素對豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響由小到大排序：NaCl、MgCl2、pH值，如表3。通過極差分析表可以得知對于豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取條件的最優(yōu)組合是：濃度為0.6mol/L的NaCl、濃度為0.03mol/L的MgCl2、pH值為6.5。

表2 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果

3 結(jié)論

綜上，從單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)中分析得知，在提取豬肉鹽溶性蛋白質(zhì)的時(shí)候，本實(shí)驗(yàn)所選取的三個(gè)影響因素，NaCl、MgCl2和pH值均為影響提取率的重要因素。在用spss 25.0對正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，從方差分析結(jié)果可知，NaCl、MgCl2兩個(gè)因素均對豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取效果有顯著影響(P均<0.05)，對豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響由小到大排序：NaCl、MgCl2、pH值，從極差分析結(jié)果可知，對于豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取條件的最優(yōu)組合是：濃度為0.6mol/L的NaCl、濃度為0.03mol/L的MgCl2、pH值為6.5。豬肉鹽溶性蛋白質(zhì)形成的熱誘導(dǎo)凝膠的保水性和質(zhì)構(gòu)特性是評價(jià)豬肉品質(zhì)的重要考察因素之一，對于提升豬肉品質(zhì)有著重要的作用，因此提高鹽溶性蛋白質(zhì)的提取率有著重要的意義。