一株高漆酶活性樹舌靈芝降解木質素條件的優(yōu)化*

劉曉丹，王 霞，楊祥波，葉 飛

（吉林農業(yè)科技學院生物工程學院，吉林 吉林 132101）

農作物廢棄秸稈中含有大量難以被利用的木質素資源，同時木質素也是影響反芻動物瘤胃微生物消化的因素之一[1]。因此，如何提高微生物對木質素的降解效率成為近年來研究開發(fā)的熱點。據報道，木質素降解能力較強的微生物多為白腐真菌、軟腐真菌和褐腐真菌[2-4]。此類真菌通過合成漆酶（laccase，Lac）、錳過氧化酶 （manganese peroxidase，MnP） 和木質素過氧化物酶 （lignin peroxidase，LiP）[3，5]等一系列同功酶的方式發(fā)揮作用。

靈芝不僅具有較高的藥理活性，還具有高效降解木質素的潛在特性[6]。目前國內外對靈芝屬的研究多集中在木質素降解酶系及單一酶發(fā)酵條件的分析方面，而關于木質素降解應用的研究相對較少。在前期分離到的1株樹舌靈芝（Ganoderma applanatum） 的基礎上，分析該菌株的降解酶系，進一步研究其對木質素的降解條件，為提高微生物對木質素的降解能力提供參考，同時對未來如何應用農作物廢棄物資源進行生物轉化或飼料加工等領域的研究具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

樹舌靈芝菌株由吉林農業(yè)科技學院生物工程學院微生物實驗室分離、鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)基配方參考文獻[7]。

愈創(chuàng)木酚顯色培養(yǎng)基：含0.04%愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基。

產酶培養(yǎng)基[8]：小麥麩皮20.0 g·L-1、豆粕2.0 g·L-1、葡萄糖 20.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1。

木質素降解培養(yǎng)基[3]：木質磺酸鈉2.0 g·L-1、葡萄糖 0.5 g·L-1、豆粕 2.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1、CuSO40.375 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 樹舌靈芝降解木質素的定性分析

將活化后的樹舌靈芝菌株接種于愈創(chuàng)木酚顯色培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，12 h后觀察是否形成有色圈，測定菌落直徑d1及有色圈直徑d2，計算d1/d2的比值[9]，初步分析樹舌靈芝降解木質素的特性。

1.2.2 樹舌靈芝中木質素降解酶的動態(tài)分析

將活化好的菌株，用打孔器取3塊直徑為5 mm的菌餅，接種至種子培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min-1培養(yǎng)5 d后即為種子液，轉接至產酶培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。每隔2 d取5 mL發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心8 min，取上清液測定酶活。

木質素降解酶系的酶活測定：漆酶的活性測定采用ABTS法[10]；錳過氧化物酶（MnP） 的活性測定參考Rogalski[11]的方法；木質素過氧化物酶（LiP）的活性測定采用藜蘆醇法[12]。

1.2.3 木質素降解率的測定

配制不同濃度梯度的木質磺酸鈉標準溶液，于280 nm波長下測定OD值，并繪制標準曲線[3]。木質磺酸鈉濃度與吸光值間的線性回歸方程為y=0.028 8x-0.028 3，相關系數R2=0.998 6。

種子液按2%接種于降解培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min-1培養(yǎng) 9 d。發(fā)酵液經 10 000 r·min-1離心 8 min，上清液經適當稀釋后，測定OD280值，計算木質磺酸鈉含量[13]。

木質素降解率（P1，%）計算公式為：

式中：P1表示木質素磺酸鈉降解率，C表示發(fā)酵后木質素磺酸鈉的含量。

1.2.4 不同因素對樹舌靈芝降解木質素的影響

將制備的種子液接種到降解培養(yǎng)基中，以木質素磺酸鈣為底物，發(fā)酵培養(yǎng)9 d后，測定木質素的降解率。以降解率為指標，分別考察降解培養(yǎng)基中不同氮源、氮源濃度、底物濃度、培養(yǎng)溫度及初始pH對樹舌靈芝降解木質素的影響。

1.2.5 正交試驗優(yōu)化降解條件

在單因素試驗結果的基礎上，進行 L9(34)正交試驗進一步優(yōu)化木質素降解條件。水平因素見表1。

表1 正交試驗設計Tab.1 Design of orthogonal test

1.2.6 驗證試驗

按照正交試驗優(yōu)化的最適降解條件進行驗證，進行平行3次試驗，計算木質磺酸鈉的平均降解率。

2 結果與分析

2.1 產漆酶樹舌靈芝的定性分析

樹舌靈芝在愈創(chuàng)木酚平板中的顯色分析見圖1。

圖1 樹舌靈芝在愈創(chuàng)木酚平板中的顯色分析Fig.1 Colorimetric analysis of Ganoderma applanatum on plates supplemented with guaiacol

樹舌靈芝菌餅接種于顯色培養(yǎng)基上，第2天即形成淡紅色有色圈，初步判斷該菌株可以產漆酶。第5天后菌落直徑達到最大，有色圈顏色明顯加深，呈棕紅色。進一步測定菌落直徑和有色圈直徑并計算d1/d2的比值，比值為 0.568～0.734，小于1.000時，初步判定該菌株可以選擇性降解木質素[14]。

2.2 樹舌靈芝中木質素降解酶系的動態(tài)分析

對木質素降解酶的測定結果如圖2所示。

圖2 樹舌靈芝木質素降解酶系分析Fig.2 Ligninolytic enzymes analysis of Ganoderma applanatum

由圖2可知，樹舌靈芝Lac酶活明顯高于LiP和MnP；發(fā)酵培養(yǎng)7 d時Lac酶活達到峰值，為735.2 U·L-1。其次是LiP，而MnP的活性相對較低。LiP和MnP酶活均在第5天檢測到峰值，分別為254.6 U·L-1和142.7 U·L-1。由此推斷樹舌靈芝木質素降解過程中漆酶可能發(fā)揮關鍵作用。

2.3 不同因素對樹舌靈芝木質素降解率的影響

2.3.1 不同氮源對樹舌靈芝木質素降解率的影響

本研究分別選取無機氮源和有機氮源各3種，分析氮源對木質素降解率的影響。結果如圖3所示。

圖3 氮源種類對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.3 Effect of nitrogen source species on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖3可知，以豆粕作為氮源時，木質素降解率達到32.22%，降解效果最好。后續(xù)試驗中選擇豆粕為主要氮源。

2.3.2 不同氮源濃度對樹舌靈芝木質素降解率的影響

適宜的氮源濃度有利于提高木質素降解率，對不同氮源濃度的試驗結果見圖4。

圖4 氮源濃度對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖4可知，氮源濃度為2.5 g·L-1時，木質素降解率最高。氮源濃度較高時，木質素降解率略低于氮源濃度較低時的降解率。

2.3.3 不同底物濃度對樹舌靈芝木質素降解率的影響

不同底物濃度對樹舌靈芝木質素降解率影響的試驗結果見圖5。

圖5 底物濃度對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖5可知，當底物濃度為2 g·L-1時，降解效果最好，木質素降解率達到35.73%。當底物濃度大于5 g·L-1后，降解率迅速下降。分析原因可能是底物濃度升高后，隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液逐漸粘稠，會降低菌體對營養(yǎng)及氧氣的吸收[15]，進一步抑制菌體分泌降解酶系，進而影響木質素的降解。

2.3.4 不同培養(yǎng)溫度對樹舌靈芝木質素降解率的影響

不同培養(yǎng)溫度對樹舌靈芝木質素降解率的影響試驗結果見圖6。

圖6 培養(yǎng)溫度對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.6 Effect of culture temperature on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖6可知，溫度一方面影響菌株的生長代謝，另一方面影響木質素降解速度。在30℃條件下，樹舌靈芝木質素降解率最高。溫度高于30℃時，木質素降解率顯著降低，與相對高溫下降解酶容易變性、失活有關。

2.3.5 不同初始pH對樹舌靈芝木質素降解率的影響

不同初始pH對樹舌靈芝木質素降解率的影響試驗結果見圖7。

圖7 初始pH對樹舌靈芝木質素降解率的影響Fig.7 Effect of initial pH on lignin degradation rate of Ganoderma applanatum

由圖7可知，該菌株在pH 6.0～9.0之間，對木質素均有很好的降解效果。在pH為9.0時，木質素降解率仍能達到18.92%。pH過高或過低時，木質素降解率均明顯降低。

2.4 樹舌靈芝木質素降解條件的優(yōu)化

樹舌靈芝木質素降解條件的優(yōu)化的正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Tab.2 Orthogonal test results

由表2可知，樹舌靈芝降解木質素的最適發(fā)酵條件為氮源濃度2.5 g·L-1，底物濃度3.0 g·L-1，初始pH 6.0，發(fā)酵溫度28℃。極差分析結果表明，4個因素對木質素降解率的影響大小依次為氮源濃度＞底物濃度＞初始pH＞培養(yǎng)溫度。各因素對試驗顯著性的影響如表3所示。

由表3可知，氮源濃度對木質素降解率的影響顯著 （P＜0.05）。

表3 正交試驗顯著性分析結果Tab.3 Significance analysis results of orthogonal test

2.5 驗證試驗

根據正交試驗結果，選擇最優(yōu)降解條件，進行3次平行驗證試驗，得到優(yōu)化條件下樹舌靈芝木質素平均降解率，結果見表4。

表4 驗證試驗結果Tab.4 Verification test results

由表4可知，樹舌靈芝木質素降解率的平均值為44.72%，表明該發(fā)酵條件下木質素降解率較高，重復性好，符合最佳降解條件。

3 討論

靈芝屬菌類普遍具有高效降解木質纖維素的特性，在農作物秸稈的生物降解、造紙廢水的處理、飼料加工等領域具有廣闊的應用前景[6]。目前靈芝屬菌類的研究主要包括高產菌株的選育、產漆酶條件的優(yōu)化及酶生物學特性分析等基礎研究[16]，應用研究中多集中在染料脫色方面，關于木質素降解的應用研究相對較少。

真菌在不同生長階段分泌的木質素降解酶活性不同[17]，有文獻報道[18]食用菌在菌絲體時期漆酶活性較高，因此本研究采用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)菌絲進行降解特性的分析。不同靈芝菌株的木質素降解酶活性差異很大，直接影響到木質素的降解率。本研究中對樹舌靈芝發(fā)酵培養(yǎng)分泌的木質素降解酶系分析表明，Lac酶活性明顯高于LiP和MnP；發(fā)酵培養(yǎng)7 d檢測到峰值，為735.2 U·L-1。劉禹等[19]分析了相同培養(yǎng)條件下，靈芝屬7個不同菌種漆酶活性間存在差異，其中有柄樹舌與信州靈芝的漆酶活性顯著高于其他菌種，有柄樹舌在第3天時即可檢測到高漆酶活性，信州靈芝在第6天達酶活峰值。王茂成等[20]對8種不同食用菌產酶情況進行分析，發(fā)現木耳和靈芝產酶活性最高，培養(yǎng)到第3天時，檢測到靈芝中Lac、LiP和MnP的酶活分別為508.6 U·L-1、112.3 U·L-1和 112.6 U·L-1。

影響菌株合成和分泌木質素降解酶種類和活性的關鍵因素是培養(yǎng)體系中的碳源、氮源的種類、濃度[17]及培養(yǎng)條件。陶君等[21]研究發(fā)現，靈芝的最適產漆酶條件為麥芽糖3%、酵母浸粉0.25%、pH 6.0、培養(yǎng)溫度25℃。潘志恒等[8]發(fā)現，樹舌靈芝發(fā)酵產漆酶最佳培養(yǎng)基為小麥麩皮20 g·L-1、豆粕2 g·L-1、硫酸銅 0.625 g·L-1、香蘭素 0.037 5 g·L-1。孫海鑫[22]研究發(fā)現，雜色云芝產漆酶培養(yǎng)基最優(yōu)組合為馬鈴薯 200 g·L-1、葡萄糖 10 g·L-1、麩皮 10 g·L-1、黃豆粉7 g·L-1。吳佳慧[23]研究表明，最適合靈芝K-17菌株產漆酶的營養(yǎng)成分為玉米粉、麩皮和花生殼。而Stajic等[24]研究表明，靈芝產LiP和MnP的最佳氮源是蛋白胨，Lac和MnP的最佳氮源NH4NO3。Batool等[25]對靈芝菌株IBL-05進行產酶條件的優(yōu)化時發(fā)現，選擇葡萄糖和尿素作為碳源、氮源，發(fā)酵培養(yǎng)6 d時，LiP酶活最高。王書超等[26]在對樹舌靈芝產漆酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化和分析其主要降解酶系的基礎上，在木質素降解特性試驗中選擇以豆粕2.0 g·L-1作為氮源，額外添加0.5 g·L-1葡萄糖補充碳源，以滿足菌絲體生長的需要。

本研究中，在驗證樹舌靈芝能夠選擇性降解木質素的基礎上，采用液態(tài)發(fā)酵對樹舌靈芝的降解酶系進行分析，并通過正交試驗確定了液態(tài)發(fā)酵條件下樹舌靈芝降解木質素的最佳條件。目前課題組正在開展樹舌靈芝降解玉米和水稻秸稈的研究，以期為將來樹舌靈芝在農作物秸稈資源的生物轉化及飼料加工生產等方面的應用提供參考資料。