楊 光，王占寶，董 昕，于明鋼

肝 細(xì) 胞 癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)第五大常見(jiàn)的惡性腫瘤，由于早期診斷困難，能得到根治的患者僅占30%左右[1]。肝癌常見(jiàn)的診斷標(biāo)志物為AFP，但診斷敏感性僅僅為66%，特異性為81%，且有一定的假陽(yáng)性[2]。中國(guó)是乙型肝炎患者最多的國(guó)家，因此有必要尋找新型的腫瘤標(biāo)志物，為早期肝癌的篩查提供保障。miRNA是一組內(nèi)源性、小分子的單鏈RNA研究表明，miRNA的表達(dá)失調(diào)不僅對(duì)惡性腫瘤具有一定的診斷價(jià)值，在腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移甚至對(duì)治療的反應(yīng)性方面都有重大的研究?jī)r(jià)值[3]。miR-183家族由7號(hào)染色體轉(zhuǎn)錄而來(lái)，我們通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，miR-183在血清、血漿及肝癌組織中均表達(dá)升高[4-5]。本研究收集相關(guān)文獻(xiàn)，利用薈萃分析的方法，總結(jié)肝癌患者血清、血漿及組織中miR-183家族成員的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)其區(qū)分肝癌及對(duì)照組的能力，判斷其能否作為診斷肝癌的新型腫瘤標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索方法 以微小RNA、肝細(xì)胞癌、肝癌、血清、血漿、miR-183、miR-182、miR-96、hepatoma carcinoma、liver cancer、microRNA、serum、plasma作為中英文檢索詞。計(jì)算機(jī)檢索萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)服務(wù)系統(tǒng)、中國(guó)知網(wǎng)、PubMed、Medline、Embase和Cochrane臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)。檢索時(shí)間為2010年1月—2016年12月。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）檢測(cè)標(biāo)本為血清、血漿、血液或組織，miRNA為miR-183、miR-182及miR-96。（2）研究對(duì)象已被臨床證實(shí)為肝癌，對(duì)照組為肝硬化、肝炎或者健康人。（3）文獻(xiàn)中用于研究的標(biāo)本可以獲取其樣本數(shù)量、靈敏度及特異度等指標(biāo)。（4）可以獲得文獻(xiàn)全文。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）文獻(xiàn)為meta-analysis、書信或綜述。（2）重復(fù)的文獻(xiàn)。（3）對(duì)照人群不明確。（4）研究質(zhì)量差或者無(wú)法獲得需要的數(shù)據(jù)者。

1.3 資料提取及文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)估 由2名研究者通過(guò)確定納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，各自進(jìn)行文獻(xiàn)的計(jì)算機(jī)檢索及手工篩選過(guò)程，然后對(duì)納入研究的第一作者、發(fā)表時(shí)間、標(biāo)本來(lái)源、文獻(xiàn)來(lái)源、目標(biāo)miRNA以及診斷的靈敏度、特異度等內(nèi)容進(jìn)行提取。參考 QUADAS（Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies）評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，若是“否”則代表0分，若是“不清楚”代表1分，若是“是”則代表2分。倆位研究員若出現(xiàn)有不一致之處，可通過(guò)討論解決。若討論無(wú)法達(dá)到一致，可請(qǐng)第三位研究者決定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)納入的文獻(xiàn)認(rèn)真進(jìn)行數(shù)據(jù)提取、整理，對(duì)不同文獻(xiàn)的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，區(qū)分研究?jī)?nèi)容的差異。用state12.0軟件完成數(shù)據(jù)的合并分析。另外進(jìn)行如下評(píng)估：（1）異質(zhì)性檢驗(yàn)，主要評(píng)價(jià)各個(gè)文獻(xiàn)之間的一致性。統(tǒng)計(jì)量包括Q、I2、P值。以I2來(lái)判斷有無(wú)明顯異質(zhì)性，通常I2若大于50%則各研究間存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析計(jì)算；若I2小于50%則認(rèn)為各研究間同質(zhì)，可采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。（2）若合并結(jié)果存在異質(zhì)性，可進(jìn)行敏感性分析，剔除異常研究后在重新進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性來(lái)源。（3）文獻(xiàn)發(fā)表偏倚的評(píng)估，采用EggerS檢驗(yàn)，漏斗圖的斜率P值及對(duì)稱程度進(jìn)行評(píng)估，若P值小于0.05則說(shuō)明存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索 共發(fā)現(xiàn)197篇文獻(xiàn)，剔除不符合條件的文獻(xiàn)，最終獲得6篇，涉及8個(gè)指標(biāo)，其中英文4篇，中文2篇[4-9]。檢索流程見(jiàn)圖1。

圖1 文獻(xiàn)檢索流程圖

2.2 納入文獻(xiàn)研究對(duì)象的基本特征及質(zhì)量評(píng) 估 檢索出的6篇文獻(xiàn)，共有肝病患者497例，涉及到肝硬化、肝炎、健康人在內(nèi)的各種對(duì)照組共736人,涉及到miR-183、miR-182及miR-96在血漿、血清及組織中表達(dá)共3種統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。用QUADAS-2[13]對(duì)各個(gè)文獻(xiàn)的病例選擇、檢測(cè)指標(biāo)及流程、參考標(biāo)準(zhǔn)等方面進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。見(jiàn)表1。

2.3 合并靈敏度及合并特異度等指標(biāo) 用stata12.0合并各研究結(jié)果得出，合并敏感性的I2=91.92，合并特異性的I2=53.61。說(shuō)明各研究之間存在一定的異質(zhì)性，故而采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。合并后的敏感性為0.76（0.70,0.84）、合并后的特異性為0.83（0.79,0.87）；合并后的陽(yáng)性似然比PLR為4.64（3.6,5.97），合并后的陰性似然比NLR為0.27（0.20,0.36），診斷比值比（診斷優(yōu)勢(shì)比）DOR為17.22（11.12,26.67）；合并后的ROC曲線下面積為0.88（0.85,0.90）。見(jiàn)圖2～4。

圖2 合并敏感性及合并特異性的meta分析結(jié)果

圖3 合并后的陽(yáng)性似然比PLR與陰性似然比NLR的meta分析結(jié)果

圖4 合并后的ROC曲線的meta分析結(jié)果

圖5 剔除異質(zhì)性來(lái)源的文獻(xiàn)后PLR、NLR及SROC圖示

2.4 敏感性 由于納入文獻(xiàn)的meta分析結(jié)果之間存在異質(zhì)性，故進(jìn)行敏感性分析。在剔除組織miR-183一項(xiàng)（Zenghui Liang）后，合并敏感性及特異性之間的異質(zhì)性減少，合并敏感性為0.80(0.76,0.84)，其I2為33.05；合并特異性為0.82(0.78,0.86)，其I2為49.21。由此可見(jiàn)，該文獻(xiàn)可能為異質(zhì)性來(lái)源，但剔除后其合并敏感性及特異性的變化不大。除此外，其他文獻(xiàn)并未證實(shí)為異質(zhì)性來(lái)源。剔除該文獻(xiàn)后的合并敏感性及合并特異性及合并ROC見(jiàn)圖5。

2.5 文獻(xiàn)發(fā)表偏倚分析 采用EggerS檢驗(yàn)漏斗圖法對(duì)納入文獻(xiàn)的發(fā)表偏倚做一評(píng)估，其斜率系數(shù)的P值為0.33，說(shuō)明文獻(xiàn)間并不存在發(fā)表偏倚。見(jiàn)圖6。

圖6 納入文獻(xiàn)發(fā)表偏倚的Deeks線性回歸圖示

3 討論

肝癌的惡性程度較高,盡管人們?cè)谄渲委煷胧┓矫嫱度肓司薮笈?但是肝癌患者的死亡率仍高居不下。為此，敏感性高的的新型診斷方法成為科學(xué)工作者們的聚焦點(diǎn)。當(dāng)前肝癌的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是腫瘤的病理學(xué)檢查，但是其具有一定創(chuàng)傷性，且可能造成腫瘤的轉(zhuǎn)移種植而難以用于臨床篩查。AFP對(duì)體積較小的腫瘤預(yù)測(cè)能力較差，當(dāng)血清含量超過(guò)500 ng/mL時(shí)，才有診斷意義。有報(bào)道稱，其對(duì)肝癌的整體預(yù)測(cè)價(jià)值僅為12%[10]。影像學(xué)檢查對(duì)早期的較小的腫瘤分辨率較低，常常造成漏診。且部分檢查手段存在放射性及花費(fèi)較高，不利于用于篩查[11]。近來(lái)研究較熱的肝癌腫瘤標(biāo)志物有高爾基體蛋白GP73、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，GPC-3）、熱休克蛋白以及腫瘤相關(guān)抗原（tetrazolyl acetic acid，TAA）的自身特異性抗體均證明有較高的敏感性及特異性，但是其臨床應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步證實(shí)[12]。肝癌研究的另一熱點(diǎn)為非編碼RNA，其根據(jù)序列長(zhǎng)度可區(qū)分為小非編碼RNA及長(zhǎng)鏈非編碼RNA。lncRNA（長(zhǎng)鏈非編碼RNA）的表達(dá)譜揭示，其在多種腫瘤中存在異常表達(dá)。如Panzitt等[14]發(fā)現(xiàn)，肝癌中高表達(dá)的lncRNA HULC；Zhang等[15]報(bào)道的肝癌的另一個(gè)預(yù)后因子lncRNA SNHG15。與長(zhǎng)鏈非編碼RNA相對(duì)應(yīng)的為短鏈非編碼RNA，包括microRNA、piRNA、snoRNA等，目前研究較多的為microRNA。miR-183家族是microRNA領(lǐng)域研究較早的RNA，被證實(shí)在多種腫瘤中存在異常。我們?cè)鴮?duì)肝癌及肝良性疾病中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，在檢查的80余種miRNA中發(fā)現(xiàn)存在多種失調(diào)，部分失調(diào)的miRNA與肝癌的臨床病理特征之間存在者密切聯(lián)系[16]。miR-183家族在循環(huán)及組織中均表現(xiàn)為上升，且在診斷肝癌方面有較高的敏感性及特異性。為了進(jìn)一步探究其在肝癌診斷方面的價(jià)值，我們?nèi)鏅z索了相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行meta分析。

本次meta分析結(jié)果表明，miR-183在肝癌方面可能具有一定診斷價(jià)值，其合并敏感性為0.76、合并特異性為0.83，兩者均大于甲胎蛋白的66%及81%。在剔除可能造成異質(zhì)性的組織中miR-183后，合并敏感性上升到0.80，合并特異性沒(méi)有顯著變化。合并后的PLR為4.64，陰性似然比NLR為0.27兩者均沒(méi)有達(dá)到理想狀態(tài)，這可能與樣本數(shù)量不足有關(guān)，或者與對(duì)照組的樣本選擇不統(tǒng)一有關(guān)。診斷優(yōu)勢(shì)比為17.22，說(shuō)明其作為診斷指標(biāo)的價(jià)值較好。Meta結(jié)果提示，miR-183家族尤其是在循環(huán)中（血清、血漿）的，能更好地區(qū)分肝癌與對(duì)照組。另外，miRNA特有的穩(wěn)定性及敏感性也更易被儀器設(shè)備所檢測(cè)，這是其作為新型腫瘤標(biāo)志物的一大優(yōu)勢(shì)[17]。

本meta分析的不足之處是，納入的文獻(xiàn)量較少，無(wú)法對(duì)不同部位來(lái)源的miRNA的診斷價(jià)值及miR-183家族各成員診斷價(jià)值進(jìn)行亞組分析。另外文獻(xiàn)來(lái)源均為中國(guó)人研究的，沒(méi)有其他地區(qū)的相關(guān)文獻(xiàn)，無(wú)法綜合評(píng)價(jià)國(guó)人與外國(guó)人之間miR-183的表達(dá)差別。因此，本次meta分析結(jié)果有待于將來(lái)納入更多文獻(xiàn)進(jìn)行完善。

此外，本篇論文所分析的是miR-183家族在于肝癌診斷方面的價(jià)值，其家族之下的數(shù)種miRRNA亞型分析在本科室前期論文中有詳細(xì)分析，本文不再贅述[18]。

目前，miRNA的應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越被人認(rèn)識(shí)，不僅僅在疾病診斷方面，文獻(xiàn)表明其在評(píng)價(jià)腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)、相關(guān)預(yù)后及復(fù)發(fā)方面也有一定的參考價(jià)值。人們對(duì)miR-183家族的研究已經(jīng)深入到機(jī)制層面，筆者也曾對(duì)其在各種腫瘤間的作用途徑做一綜述，發(fā)現(xiàn)miR-183家族在多種腫瘤間的致病途徑具有相似性，且已多種模型證實(shí)，為腫瘤的相關(guān)治療提供巨大啟示作用。本次meta的結(jié)果也再次證實(shí)，miR-183家族可能對(duì)肝癌的診斷具有應(yīng)用價(jià)值。