曾凡一 鄭志慧 位慧蕓 婁煊晨 陳小敏 李彥靈

摘要：指紋圖譜作為中藥質(zhì)量控制的重要手段而被廣泛應(yīng)用，本文綜述了中藥指紋圖譜的發(fā)展現(xiàn)狀、建立和評估方法。

關(guān)鍵詞：中藥材；指紋圖譜；建立方法

中藥質(zhì)量的好壞關(guān)與臨床療效的密切相關(guān)，質(zhì)量的優(yōu)劣是保證中藥的有效性、安全性、可控性的基礎(chǔ)[1]?？紤]到中藥的復(fù)雜性，中藥的檢測需要引入更精密的檢驗方法，簡單的研究方式，無法得到科學(xué)精確的結(jié)果[2]。因此，隨著國家對中藥質(zhì)量的重視，中藥鑒別的方法更加多元化。指紋圖譜作為綜合性，全面性的研究手段，能夠有效的的解決中藥鑒別中的復(fù)雜問題。

中藥指紋圖譜是經(jīng)過一定分析手段分析后，經(jīng)色譜測定，得到能特異性顯示某種中藥化學(xué)特征的圖譜。通過圖譜的比對可以對中藥進(jìn)行真?zhèn)文酥疗焚|(zhì)進(jìn)行鑒別，整體性和模糊性是中藥指紋圖譜的兩大特點[3]。

1.指紋圖譜發(fā)展史

上個世紀(jì)60年代薄層色譜技術(shù)始用于中藥的鑒別，接下來的20年里薄層掃描儀也逐漸投入使用，極大地提高了中藥質(zhì)量檢測的科學(xué)性。上個世紀(jì)60年代液相技術(shù)的使用投入商業(yè)化，90年代始載于我國藥典。隨著多種多樣的中藥鑒別手段的使用，中藥指紋圖譜開始提出并迅速為國際所接納[4]。21世紀(jì)初，中藥注射劑要求藥材產(chǎn)地固定，并且其質(zhì)量以指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)納入國家監(jiān)控[5]。

2.中藥指紋圖譜建立方法

2.1氣相色譜（GC）指紋圖譜

氣相色譜法用于可氣化而不分解的物質(zhì)的分析，由于分離度敏感度高、選擇性好等優(yōu)點，使氣相色譜被廣泛應(yīng)用衛(wèi)生醫(yī)藥檢驗等方面[6]。謝建軍等[7]通過氣相指紋圖譜的比對，指出不同產(chǎn)地的紅酒存在差異。同時，Cao G等[8]提供了一種基于化學(xué)圖譜方法的二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜（GC×GC-TOF/MS）方法，用于鑒定曬干和硫煙熏中藥中的非目標(biāo)和目標(biāo)揮發(fā)性化合物。研究表明，與曬干的樣品相比，硫煙熏樣品的主要活性成分明顯流失，指紋圖譜更具破壞性。此方法可用于中藥及其制劑、生物樣品和環(huán)境樣品等多種復(fù)雜混合物中復(fù)雜的靶標(biāo)和非靶標(biāo)成分的鑒別。Liu W等[9]利用熵和遺傳統(tǒng)計學(xué)原理，以魚腥草中的石腦油為GC指紋圖譜的變異系數(shù)建立了中藥提取過程中平衡基團(tuán)的數(shù)學(xué)模型，并對模型進(jìn)行了驗證。在質(zhì)量控制模型空白的情況下，進(jìn)一步利用菌株間H.cordata的Hardy-Weinberg平衡群來控制質(zhì)量的穩(wěn)定性，為中藥提取和質(zhì)量控制的穩(wěn)態(tài)奠定了新的理論和實驗基礎(chǔ)。Guo FQ等[10]采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和亞窗口因子分析（SFA）方法測定了青蒿毛細(xì)血管的揮發(fā)性化學(xué)成分，測定其中的89.03%，然后用該圖譜用正交投影法鑒定得到良好的一致性。Wang Z等 [11]利用GC-FPS技術(shù)，由樣品的氣相色譜相對保留值指紋圖譜，檢驗了進(jìn)口檀香精油的質(zhì)量。

2.2高效液相（HPLC）指紋圖譜

與傳統(tǒng)液相相比高效液相利用高壓液泵提高液體流動相的流速，為提高柱效采用多孔微粒固定相，柱子后有小而精密的檢測器。高效液相色譜儀的使用導(dǎo)致了高效液相色譜法的出現(xiàn)[12]。徐佳等[13]測定10批水蛭藥材的高效液相色譜指紋圖譜得到10個共有峰，其中兩個為黃嘌呤和次黃嘌呤的色譜峰，該方法為水蛭藥材的質(zhì)量評價提供了實驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。不局限于動物藥，Chen LY等[14]建立了鐵線蓮莖葉的高效液相色譜指紋圖譜，通過指紋圖譜與對照品的比對，其中5個峰分別被鑒定為維菌素-1、梔子苷、異黃酮、異梔子苷和異梔子苷。將指紋圖譜、模式識別與單標(biāo)記法技術(shù)相結(jié)合，彼此互為對照，為鐵線蓮的質(zhì)量控制和評價提供更為全面的參考。關(guān)于中藥茯苓指紋圖譜的研究也很多，Zhu LX等[15]通過對中國四個主要產(chǎn)地采集的25個供試樣品進(jìn)行UHPLC-QTOF-MS/MS指紋圖譜研究，建立了茯苓的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。對指紋圖譜中的23個共有峰進(jìn)行了定性和初步鑒定，同時采用主成分分析（PCA）、監(jiān)督正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）和層次聚類分析（HCA）對指紋圖譜中的特征峰進(jìn)行了定性和定量分析。將25批PCS樣品分為四組，與四個地理區(qū)域高度一致。篩選出10種化合物作為鑒別PCS質(zhì)量的潛在標(biāo)志物，利用分子生物學(xué)方法同時測定了9種三萜酸。還有對中藥成方制劑的指紋圖譜研究[16]。

2.3高效毛細(xì)管電泳（HPCE）指紋圖譜

以毛細(xì)管為分離通道，以電滲流為驅(qū)動力，毛細(xì)管電泳技術(shù)是一類依據(jù)樣品中各組分之間遷移速度和分配行為上的差異實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)[17]。同時，毛細(xì)管電泳的儀器簡單操作方便，實驗成本低。例如，蔡梅超等[18]采用高效毛細(xì)管電泳法，測量萊菔子中介子堿含量。最終，芥子堿在0.2～ 1.0m g/m L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。陳乃東等[19]，用PMP-HPCE檢測5個石斛樣品。不同種源間的石斛共檢測到木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和核糖等6種單糖。接著，在10個不同批次同一種源的鐵皮石斛樣品的HPCE指紋圖譜有很高的相似性。Ma Xiao-Li等[20]將雜聚糖變成單糖。雜聚糖水解后，與1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）衍生出單糖，然后用HPCE和HPLC進(jìn)行分離，并比較了二者的差異。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和回收率等多項指標(biāo)，兩種方法的結(jié)果基本一致。異黃酮成分的檢測與鑒定，對于葛根作為藥用植物的利用，以及對異黃酮次生代謝定量分析的研究具有重要意義。Fang C等[21]建立了一種高效毛細(xì)管電泳（HPCE）-二極管陣列檢測（DAD）分離測定葛根樣品中異黃酮的方法。最終葛根樣品中異黃酮含量的RSD小于5%。

2.4紫外光譜指紋圖譜

由于紫外光譜法操作簡單，分析速度快，對于中藥種類及真?zhèn)蔚蔫b別有廣泛的應(yīng)用[22]。賀正全等[23]利用紫外光譜法鑒別大黃的真?zhèn)?，真?zhèn)未簏S的紫外光譜指紋圖譜存在差異。Wang YZ等[24]采用紫外光譜法對三七進(jìn)行研究。采用均值法、平滑法和導(dǎo)數(shù)法對10個地區(qū)采集的50份三七樣品進(jìn)行紫外光譜分析。通過紫外光譜特征與偏最小二乘判別分析（PLS-DA）相結(jié)合的方法，研究了三七不同產(chǎn)地樣品間的差異及相互關(guān)系。結(jié)果表明，主要成分與采集區(qū)域相關(guān)性較低，而含量可能受采集區(qū)域的影響。多組分析方法和指紋圖譜被認(rèn)為是藥理學(xué)/生物勘探研究中從中草藥提取物中篩選候選中草藥的有效手段。Liang X等[25]用紫外光譜作為光譜指紋圖譜來表征樣品的化學(xué)特性。以主成分分析（PCA）和典型相關(guān)分析（CCA）為評價工具，建立了藥理學(xué)數(shù)據(jù)與光譜數(shù)據(jù)的相關(guān)性，建立了評價中藥解熱作用的光譜指標(biāo)。用紫外光譜第一正則相關(guān)變量U（1）確定的15個校準(zhǔn)和4個驗證CHM樣品的藥效序列與藥理學(xué)實驗結(jié)果一致。

2.5核磁共振氫譜指紋圖譜

核磁共振利用中藥材有效成分中特定的原子，用其吸收電磁的輻射進(jìn)而得到這種藥材的核磁共振指紋圖譜。核磁共振氫譜進(jìn)樣量少檢測速度快，接著通過分析將圖譜中的譜線進(jìn)行識別，來實現(xiàn)中藥的質(zhì)量監(jiān)控[26]。張培成等[27]從連翹及蒼術(shù)中分離獲得了一系列2-O取代苯乙醇昔類化合物和具有鏈狀鄰二醇片段的烯炔普類化合物，在對這兩類化合物絕對構(gòu)型確定的過程中，成功利用核磁共振氫譜建立了快速準(zhǔn)確的判斷方法，由于不需要對苷類化合物進(jìn)行水解，極大地縮短了實驗流程。Li J 等[28]采用NMR指紋圖譜結(jié)合多因素分析，款冬花花蕾在不同時期次生代謝產(chǎn)物和初級代謝產(chǎn)物上的差異，此舉揭示了只有花蕾才能用作草藥的內(nèi)在原因。這些結(jié)果有助于了解款冬花傳統(tǒng)使用的合理性。Jiang M等 [29]采用NMR代謝指紋圖譜和多元分析相結(jié)合的方法，對采自山西（野生）和甘肅（栽培）的兩個不同的黃芪進(jìn)行了化學(xué)成分的比較。結(jié)果表明，山西（野生）和甘肅（栽培）的兩個不同的黃芪在初級代謝產(chǎn)物與次生代謝產(chǎn)物中都存在顯著差異。基于1H -核磁共振（NMR）的應(yīng)用，代謝組學(xué)被用于區(qū)分三種相關(guān)的人參物種的水提取物：人參（中國兩個不同的栽培區(qū)）、三七和西洋參。水煎后，Chan PH等[30]對中國河北和吉林栽培的人參水提取物進(jìn)行了1H NMR代謝譜分析。光譜中，幾個鑒別特征存在顯著差異。1H -核磁共振（NMR）技術(shù)的應(yīng)用，適用于人參產(chǎn)品的認(rèn)證和質(zhì)量控制。Lin WN等[31]通過1H-NMR光譜對栽培年限為1 - 6年的干燥人參樣品進(jìn)行了化學(xué)指紋圖譜研究。然后，通過使用主成分分析和聚類分析來分析得到的數(shù)據(jù)集，建立一個分布模型，該模型允許基于植物代謝組學(xué)策略來識別人參的實際栽培年齡。用于各種干白人參樣品和商品的實際栽培年齡評估。

2.6薄層色譜

中藥材的鑒別手段中，薄層色譜法是一種簡便、快速、直觀、易重復(fù)的鑒別方式。2010版藥典中，82.77%的藥材都使用了薄層色譜進(jìn)行鑒別[32]。朱迪等[33]利用TLC指紋圖譜，將30批不同的天麻藥材，通過聚類分析將藥材分成5類，主成分分析把藥材分成了6種，用以區(qū)分天麻產(chǎn)地。Gebrehiwot M等[34]采用水蒸氣蒸餾法提取樹脂，再用甲醇從果渣中提取精油，并對樹脂進(jìn)行過濾。通過薄層色譜層析來研究沒藥的抗炎和抗菌作用，驗證了香沒藥具有真正的傷口愈合活性，支持植物的傳統(tǒng)使用。Wei FH等[35]將夏天無薄層色譜中6個明顯峰的面積與同一色譜中延胡索乙素的峰面積進(jìn)行了比較，結(jié)果表明在同一色譜條件下，六個明顯峰的面積與dl-延胡索乙素的峰面積相同。測定各峰的相對危險度（RR）和相對面積，以評價夏天烏的質(zhì)量，并對其進(jìn)行鑒別。

3.中藥指紋圖譜評價方法

中藥指紋圖譜自上個世紀(jì)90年代為國際組織所認(rèn)可，在我國的發(fā)展至今已有20余年。中藥色譜指紋圖譜的相似性評價方法，在促進(jìn)了中藥產(chǎn)業(yè)的技術(shù)創(chuàng)新和中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)步這一過程中發(fā)揮了重要作用。根據(jù)近30年來有關(guān)色譜指紋的文獻(xiàn)數(shù)量和研究趨勢，色譜指紋評價可分為三個階段：直接比較階段（1988 - 1999年）、相似性評價階段（2000 - 2009年）和相似性評價發(fā)展階段（2010 - 2017年）[36]。其中最主要的方法還是峰重疊率法，相關(guān)系數(shù)法，向量夾角余弦。近十幾年也出現(xiàn)了化學(xué)模式識別、相似度評價法、總量統(tǒng)計矩法等新方法[37]。

4.展望

利用指紋圖譜檢驗中藥，正在逐步變成中藥檢驗的標(biāo)準(zhǔn)方法。但由于不同地區(qū)、不同環(huán)境、不同采摘時期對中藥的質(zhì)量存在影響，難以建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此中藥材指紋圖譜庫的建立是必要的。同時指紋圖譜的建立，應(yīng)該以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，建立圖譜與藥效之間的關(guān)系，使中醫(yī)藥為更多人所接受。

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項目經(jīng)費來源：校級科技創(chuàng)新團(tuán)隊（新藥研發(fā)科技創(chuàng)新團(tuán)隊，編號STD201602）

第一作者簡介：曾凡一（1999-），男，漢，河南信陽人，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院16級藥學(xué)本科在讀。

通訊作者簡介：李彥靈（1987-），女，漢，河南輝縣人，碩士學(xué)位，助教。研究方向：天然藥物化學(xué)。