高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定水果中乙氧基喹啉

余曉琴，李澍才，唐昌云

(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 610097)

乙氧基喹啉的化學(xué)名為6-乙氧基-1,2-二氫化-2,2,4-三甲基喹啉，又名乙氧基喹或乙氧喹，為淡黃色至琥珀色粘稠液體，沸點(diǎn)為125 ℃，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。乙氧基喹啉有一定的防霉和保鮮作用，可作為食品防腐劑、水果保鮮劑，以及食品、飲料、油脂及藥品等的抗氧化劑[1]。但人體攝入過(guò)量乙氧基喹啉會(huì)存在損害人體組織器官的潛在風(fēng)險(xiǎn)[2]。

目前已有許多國(guó)家規(guī)定了食品中乙氧基喹啉的最高殘留限量，其中我國(guó)GB 2760-2014規(guī)定乙氧基喹啉在經(jīng)表面處理的鮮水果中的最高殘留限量為1 mg/kg[3]；美國(guó)規(guī)定乙氧基喹啉在禽蛋中的限量為0.5 mg/kg，在牛奶中則不允許添加[4]；日本規(guī)定植物源性食品中乙氧基喹啉的限量為0.05 mg/kg[5]。為有效控制乙氧基喹啉在食品中的殘留量，目前已開(kāi)發(fā)了多種檢測(cè)方法，國(guó)外已報(bào)道的測(cè)定方法有高效液相色譜-熒光檢測(cè)法[2]、液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法[6]、液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法[7]和穩(wěn)定同位素液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等。而國(guó)內(nèi)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法和文獻(xiàn)方法包括氣相色譜法[9]、液相色譜法[10-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]等，其覆蓋基質(zhì)和測(cè)定方法均有所不同。但均未綜合考慮乙氧基喹啉在檢測(cè)中的技術(shù)難點(diǎn)：SN/T 0533-2016[12]標(biāo)準(zhǔn)方法未關(guān)注乙氧基喹啉在酸性水果基質(zhì)中易離子化而導(dǎo)致提取困難的問(wèn)題；丁濤等[16]所建方法未關(guān)注乙氧基喹啉與水果中自由基發(fā)生反應(yīng)的問(wèn)題；黃超群等[17]所建方法未關(guān)注乙氧基喹啉在濃縮過(guò)程中易損失的問(wèn)題。此外，上述方法多為一次提取，難以保證實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)的準(zhǔn)確度。

本文綜合考慮上述關(guān)鍵問(wèn)題，建立了一種通過(guò)抑制乙氧基喹啉的氧化反應(yīng)，在堿性條件下提取后濃縮測(cè)定的高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法。所建方法涵蓋多種水果，已通過(guò)5家檢測(cè)機(jī)構(gòu)協(xié)作驗(yàn)證，能夠滿足水果中乙氧基喹啉殘留量的監(jiān)測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜-熒光檢測(cè)器聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；Milli-R04 純水儀(德國(guó)Millipore公司)；乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)：91-53-2，純度≥98%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；正己烷、維生素C、氫氧化鈉、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、抗壞血酸棕櫚酸酯、沒(méi)食子酸丙酯(分析純，成都科龍化學(xué)試劑廠)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg(精確至 0.01 mg)乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至10 mL，混勻后轉(zhuǎn)移至玻璃容器中，于-20 ℃保存。精密移取上述溶液適量，用維生素C飽和的乙腈稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、50、100 μg/L，臨用現(xiàn)配。

1.3 供試品溶液的制備

取代表性樣品500 g，加入10 g維生素C，用組織搗碎機(jī)粉碎加工成漿狀，混勻。稱(chēng)取5 g(精確至0.01 g)上述樣品于50 mL離心管中，加入0.1 mol/L氫氧化鈉5 mL，渦旋混勻30 s后，加入10 mL正己烷，渦旋混勻，振蕩提取15 min后，以 8 000 r/min離心3 min。將正己烷層轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，殘?jiān)性俅渭尤?0 mL正己烷，重復(fù)提取1次，以 8 000 r/min離心3 min后，合并正己烷層，以正己烷稀釋至刻度，搖勻后，精密量取5 mL，于30 ℃氮吹至干，精密加入5 mL乙腈，渦旋，過(guò)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜，濾液待測(cè)。對(duì)于乙氧基喹啉含量較高的樣品，可用乙腈適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測(cè)定。

1.4 分析條件

色譜柱為Waters XTERRA C18液相色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm，美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：乙腈-水(體積比65∶35)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)：365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：435 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇對(duì)比了Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Agilent XDB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters XTERRA C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、ACE 3 C18(2.1 mm×75 mm，3 μm)、安譜Athena C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Thermo Hypersil ODS C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)等色譜柱對(duì)待測(cè)化合物的分離效果，結(jié)果表明以乙腈-水(65∶35)為流動(dòng)相時(shí)，乙氧基喹啉在7種C18色譜柱中均能得到很好的分離，拖尾因子均小于1.05。驗(yàn)證單位(湛江市食品藥品檢驗(yàn)所、上海市食品藥品檢驗(yàn)所、常州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心、四川省輕工業(yè)研究設(shè)計(jì)院、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心)分別使用Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters Symmetry RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、SHIMADZU Inertsil ODS-HL(4.5 mm×250 mm，5 μm)等不同色譜柱對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示普通C18色譜柱均可滿足分析要求。本方法選用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的Waters XTERRA C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇比較了乙腈、甲醇作為有機(jī)相以及純水和不同濃度的乙酸銨溶液(5、10、20 mmol/L)作為水相時(shí)，不同流動(dòng)相組成對(duì)乙氧基喹啉峰形和響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，以乙腈為有機(jī)相時(shí)，乙氧基喹啉的響應(yīng)明顯優(yōu)于甲醇，故采用乙腈作為有機(jī)相；水相中含有乙酸銨時(shí)，對(duì)乙氧基喹啉的峰形和響應(yīng)影響不明顯。因此，本研究選擇乙腈-水作為流動(dòng)相，待測(cè)化合物可獲得良好的色譜峰形和響應(yīng)，且靈敏度高。為兼顧保留時(shí)間和色譜峰形，以及試樣中部分極性雜質(zhì)需要洗脫，最終選擇乙腈-水(65∶35)為流動(dòng)相等度洗脫，乙氧基喹啉的保留時(shí)間為7.54 min。

圖1 乙氧基喹啉的色譜圖(20 ng/mL)Fig.1 Chromatogram of ethoxyquin(20 ng/mL)

圖2 抗氧化劑種類(lèi)對(duì)乙氧基喹啉回收率的影響(n=3)Fig.2 Effect of antioxidant type on recovery of ethoxyquin(n=3)

2.1.3 熒光條件的選擇乙氧基喹啉的苯環(huán)和喹啉環(huán)可形成共軛體系，使其具有明顯的紫外吸收和熒光性質(zhì)。由于相比于紫外檢測(cè)器，熒光檢測(cè)器具有更高的選擇性、靈敏度以及更低的基質(zhì)和背景干擾，因此本實(shí)驗(yàn)選用熒光檢測(cè)器。分別對(duì)乙氧基喹啉的紫外吸收和熒光激發(fā)情況進(jìn)行了考察，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描190～800 nm范圍內(nèi)的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)乙氧基喹啉在226 nm和365 nm處有特征吸收峰。選擇干擾相對(duì)較小的365 nm作為熒光的激發(fā)波長(zhǎng)，掃描365～650 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)最佳發(fā)射波長(zhǎng)為435 nm。最終確定熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為435 nm。在優(yōu)化條件下，乙氧基喹啉的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 供試品溶液制備條件的優(yōu)化

乙氧基喹啉不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，其結(jié)構(gòu)中的仲胺具有一定的接受質(zhì)子能力，屬于一種弱的有機(jī)堿[16]，因此乙氧基喹啉在水果基質(zhì)中易以離子態(tài)存在。本實(shí)驗(yàn)利用堿性溶液抑制其離子化，再采用正己烷作為提取溶劑，具有較高的提取效率。提取過(guò)程中水果中的大量自由基能與乙氧基喹啉快速發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致方法回收率為0，因此需在前處理過(guò)程中加入抗氧化劑，以阻斷乙氧基喹啉的氧化反應(yīng)。

2.2.1 抗氧化劑條件的優(yōu)化比較了維生素C、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、抗壞血酸棕櫚酸酯(AP)、沒(méi)食子酸丙酯(PG)4種抗氧化劑在提取過(guò)程中對(duì)乙氧基喹啉(添加量為0.2 mg/kg)的保護(hù)效果。稱(chēng)取5 g粉碎的蘋(píng)果樣品，分別加入上述4種抗氧化劑0.5 g。同時(shí)制備橙子樣品，同法處理，考察4種抗氧化劑對(duì)富含維生素C的水果基質(zhì)是否造成影響。結(jié)果(圖2)顯示，維生素C和PG的抗氧化效果良好，蘋(píng)果和橙子樣品的回收率均大于80%；BHT由于不溶于水，無(wú)法在水溶性的樣品基質(zhì)中發(fā)揮抗氧化作用，導(dǎo)致蘋(píng)果樣品的回收率不足10%；AP的水溶性相對(duì)較差，因此抗氧化效果比維生素C和PG弱，2種樣品的回收率均小于80%。對(duì)于橙子等富含維生素C的樣品，加入抗氧化劑后對(duì)乙氧基喹啉的提取效率影響較小。由于相比于PG，維生素C是一種在水果中天然存在的抗氧化劑，價(jià)格低，易獲得，因此選擇維生素C作為抗氧化劑。

進(jìn)一步對(duì)維生素C的加入量(0.2%、0.5%、1%、2%、5%)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，維生素C的加入量分別為0.2%和0.5%時(shí)，乙氧基喹啉的回收率分別為51.8%和78.1%；維生素C的加入量分別為1%、2%和5%時(shí)，乙氧基喹啉的回收率為82.6%～86.2%。為保證充分的抗氧化效果，實(shí)驗(yàn)選擇維生素C的加入量為2%。

2.2.2 堿的加入與優(yōu)化比較了加入5 mL不同濃度的碳酸鈉溶液(0.47、0.94、1.89 mol/L)和氫氧化鈉溶液(0.05、0.1、0.2 mol/L)堿化樣品后對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示，加入不同濃度的碳酸鈉溶液和氫氧化鈉溶液后，蘋(píng)果、橙子和葡萄樣品中乙氧基喹啉的回收率分別為70.2%～82.5%和76.7%～84.3%，差別較小。而加入碳酸鈉溶液和氫氧化鈉溶液后樣品的pH值分別為8～9和11～12，表明經(jīng)氫氧化鈉調(diào)節(jié)后的堿性更強(qiáng)。進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液時(shí)的回收率最高(84.3%)，因此選擇加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液堿化樣品。

2.2.3 提取次數(shù)的優(yōu)化本研究采用加堿后再加入正己烷提取的方式，為保證充分提取，選擇蘋(píng)果、橙子、葡萄3種基質(zhì)對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，提取次數(shù)為2次時(shí)即可達(dá)到充分提取，3種基質(zhì)中乙氧基喹啉的回收率分別為80.4%、80.0%和 86.8%，因此選擇提取2次。

2.2.4 氮吹濃縮溫度的優(yōu)化樣品經(jīng)正己烷提取后，需將提取溶液濃縮后再用乙腈復(fù)溶。由于乙氧基喹啉在室溫下為液態(tài)，沸點(diǎn)為125 ℃，較高的氮吹溫度對(duì)回收率影響較為明顯。本研究分別用蘋(píng)果、橙子、葡萄3種基質(zhì)考察了不同溫度下(30、40、50 ℃)氮吹對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明，氮吹溫度為40 ℃和50 ℃時(shí)，乙氧基喹啉的損失較大，回收率均小于60%；而氮吹溫度為30 ℃時(shí)，回收率均較好(>80%)，因此選擇氮吹溫度為30 ℃。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)為考察基質(zhì)以及維生素C飽和的乙腈對(duì)乙氧基喹啉的影響，在進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)同時(shí)制備了基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和維生素C飽和的乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用相對(duì)響應(yīng)值法，即通過(guò)計(jì)算兩曲線的斜率之比來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示不存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，但使用維生素C飽和的乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)曲線與乙腈配制相比有一定的響應(yīng)增強(qiáng)作用，因此采用維生素C飽和的乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量檢測(cè)。

2.3.2 線性關(guān)系量取質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，乙氧基喹啉在2～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 99，線性方程為y=0.230 4x+0.001 0。

2.3.3 檢出限與定量下限在空白蘋(píng)果樣品中分別添加0.01、0.02、0.05、0.08 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行樣品前處理和測(cè)定。結(jié)果表明，乙氧基喹啉的信噪比均大于3，當(dāng)加標(biāo)水平不低于0.02 mg/kg時(shí)其信噪比均大于10，且回收率均在60%～120%之間。同時(shí)，鑒于待測(cè)物為可使用的食品添加劑，綜合考慮，將本方法的檢出限(LOD)定為0.01 mg/kg，定量下限(LOQ)定為0.02 mg/kg。

2.3.4 回收率考察以蘋(píng)果、梨、葡萄、橙子為代表基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g(精確至0.01 g)空白樣品，添加乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)品，分別制成加標(biāo)水平為0.02、0.04、0.2、1 mg/kg的樣品各6份，按本方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。由表1可見(jiàn)，各加標(biāo)水平下的平均回收率為80.4%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%～8.1%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足殘留分析的要求。

表1 乙氧基喹啉在4種基質(zhì)中的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)Table 1 Average recoveries and RSDs of ethoxyquin in 4 kinds of fruit matrix(n=6)

2.3.5 實(shí)驗(yàn)室間協(xié)作驗(yàn)證結(jié)果為驗(yàn)證本方法的有效性和適用性，通過(guò)前述5家檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)本方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，乙氧基喹啉在2～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999；方法檢出限濃度下的色譜峰信噪比均大于3；各加標(biāo)水平的平均回收率為67.7%～102%，RSD為0.70%～9.4%，方法準(zhǔn)確度和精密度均能滿足相關(guān)要求。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)蘋(píng)果、梨、葡萄、橙子4種水果共30份，應(yīng)用本方法進(jìn)行測(cè)定，樣品中均未檢出乙氧基喹啉殘留。

3 結(jié) 論

本研究建立了測(cè)定多種水果中乙氧基喹啉殘留量的液相色譜-熒光檢測(cè)法，通過(guò)對(duì)儀器分析條件、抗氧化劑、樣品堿化以及濃縮溫度等因素的優(yōu)化，使方法的準(zhǔn)確度、靈敏度得到提高。方法檢出限和定量下限分別達(dá)0.01、0.02 mg/kg，平均回收率為80.4%～108%。本方法實(shí)用性強(qiáng)、可操作性好、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，適用于多種水果中乙氧基喹啉殘留量的測(cè)定。