微生物發(fā)酵床不同深度墊料的細(xì)菌群落多樣性

陳倩倩，劉 波，朱育菁，劉國紅，車建美，王階平，鄭雪芳，張海峰

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003）

微生物發(fā)酵床具有降解糞污的功效，其中的微生物起物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化的作用，是發(fā)酵床良性運(yùn)作的核心[1-2]。發(fā)酵床中的微生物種群豐富，肖榮鳳等[3]自發(fā)酵床中分離了18種真菌，包含總狀毛霉、尖孢枝孢菌、橘青霉和構(gòu)巢曲霉等。劉國紅等[4]研究表明發(fā)酵床中的芽孢桿菌含量多達(dá)4.41×108個(gè)·g-1，其中芽胞桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬和類芽胞桿菌屬是優(yōu)勢菌?；潞Ａ值萚5]采用高通量測序的方法探尋了發(fā)酵床中的微生物組成，揭示發(fā)酵床的優(yōu)勢菌為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，包含節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬等。筆者前期采用高通量測序發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床中的主要細(xì)菌與宦海林等[5]的研究結(jié)果一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床中含有多種糞污降解菌，包括棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、放線菌屬、乳桿菌屬等[6]。

微生物發(fā)酵床墊料深度一般為60～100 cm，不同深度墊料的微環(huán)境有所差異，因此導(dǎo)致其中微生物種群和數(shù)量的差異。張學(xué)峰等[7]分離純化了不同深度墊料的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵床30 cm處的墊料活菌數(shù)量大于表層墊料，推測微生物發(fā)酵床的核心發(fā)酵層是30 cm處的墊料層，此處的主要發(fā)酵菌株為地衣芽孢桿菌。而鄭雪芳等[8]采用脂肪酸標(biāo)記了不同深度墊料中的微生物，發(fā)現(xiàn)表層墊料（0～25 cm）中的微生物含量最高。由于培養(yǎng)條件限制，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法通常無法獲得全部的環(huán)境微生物，因此可能會造成研究結(jié)果的差異。16S rDNA的高通量測序技術(shù)，無分離培養(yǎng)的過程，直接提取和克隆環(huán)境樣品中所有微生物的DNA，獲得環(huán)境中所有微生物的遺傳信息，能夠較為全面地揭示環(huán)境微生物的多樣性。然而，基于宏基因分析養(yǎng)豬發(fā)酵床不同深度微生物組的研究未見報(bào)道，因此本研究采用高通量測序研究不同深度墊料的微生物群落，明確發(fā)酵床糞污降解的優(yōu)勢層，發(fā)掘潛在的降解菌，促進(jìn)養(yǎng)殖廢棄物的資源化利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

微生物發(fā)酵床位于福建省福清漁溪現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)樣本工程示范基地，自2013年8月開始運(yùn)行。發(fā)酵床墊料由70%椰糠和30%谷殼粉構(gòu)成，墊料每年更換一次。采用五點(diǎn)取樣法（以發(fā)酵床對角線的中點(diǎn)作為中心取樣點(diǎn)，再在對角線上選擇4個(gè)與中心取樣點(diǎn)距離相等的點(diǎn)作為取樣點(diǎn)，共計(jì)5處取樣點(diǎn)），取10、11月和12月的不同深度墊料（表層10 cm、中層30 cm、深層50 cm），分別命名為OCT10cm、OCT30cm、OCT50cm、NOV10cm、NOV30cm、NOV50cm、DEC10 cm、DEC30cm、DEC50cm。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物發(fā)酵床墊料總DNA的提取[9]

每個(gè)樣本稱取500 mg墊料，按土壤DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit for Soil的操作指南，分別進(jìn)行總DNA的提取。調(diào)整終濃度至1 ng·μL-1開展后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 微生物組16S rDNA V3～V4區(qū)測序

采用原核生物16S rDNA基因V3～V4區(qū)通用引物338F（5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′）和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′，對各墊料樣本總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（重復(fù)3次）。從3次重復(fù)中取相同體積混合后進(jìn)行目的片段回收，所用膠回收試劑盒為AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）。采用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）對回收產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。然后構(gòu)建插入片段為350 bp的paired-end（PE）文庫（TruSeqTMDNA Sample Prep Kit建庫試劑盒，Illumina公司），經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，HiSeq上機(jī)測序。

1.2.3 微生物組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)。采用Mothur軟件（version 1.36.1）基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類分析[10]。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析[11]。從各個(gè)OTU中挑選出一條代表序列與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫（Silva，http：//www.arb-silva.de）進(jìn)行比對，完成物種注釋；根據(jù)每個(gè)OTU中序列的條數(shù)，得到各個(gè)OTU的豐度值[12-13]。同時(shí)進(jìn)行樣品之間的共有及特有OTU數(shù)目分析、物種組成及物種差異性分析[14]、16S功能預(yù)測[15]。

相應(yīng)的數(shù)據(jù)釋放與SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫,序列號分別為SRR5611224（OCT10cm）、SRR5611227（NOV10cm）、SRR5611230（DEC10cm）、SRR5611225（OCT30cm）、SRR5611228（NOV30cm）、SRR5611231（DEC30cm）、SRR5611226（OCT50cm）、SRR5611229（NOV50cm）和SRR5611232（DEC50cm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同深度墊料細(xì)菌多樣性測序分析

經(jīng)454焦磷酸測序，9個(gè)樣本共獲得1 045 225個(gè)有效序列，有效堿基數(shù)458 650 508 bp，序列平均長度438.8 bp，各樣本分析結(jié)果見表1。不同樣品宏基因組分析結(jié)果存在差異：序列數(shù)量最大值為DEC10cm（140 350條），最小值為NOV50cm（101 537條）。表層、中層和深層墊料的短序列數(shù)分別為125 687、119 364和103 357。試驗(yàn)共檢測到1834種OUT類型，包含32門、76綱、156目、303科、609屬和939種細(xì)菌。其中，表層墊料包含31門、71綱、144目、283科、576屬和891種細(xì)菌，中層墊料包含31門、72綱、146目、283科、580屬和904種細(xì)菌，深層墊料包含30門、69綱、140目、268科、546屬和853種細(xì)菌。

表1 發(fā)酵床墊料微生物細(xì)菌群落宏基因組測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Similarity-based OTUs and species richness estimates of the bacterial phylotypes of the litters

2.2 微生物發(fā)酵床不同深度墊料的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

表層、中層和深層墊料OTUs種類分別為1701、1731種和1587種（圖1）。中層墊料OTUs種類最多，物種最為豐富，深層墊料細(xì)菌種類少。3組樣本共有的OTU有1482種，表層10 cm樣本與中層30 cm樣本共有OTUs 1676種，10 cm與50 cm共有1513種OTUs，30 cm與50 cm樣本共有155種OTUs。表層和中層樣本共有OTUs種類最多，而表層和深層共有OTUs種類最少，表明相鄰深度墊料趨向含有更多的共有OTUs。表層10 cm的樣本，特有OTUs為26種，占表層總OTU的1.5%。中層30 cm樣本特有OTUs為16種（0.9%），深層50 cm樣本特有OTUs為14種（0.9%）。綜上分析，微生物發(fā)酵床表層墊料具有更多的細(xì)菌和特有細(xì)菌種類，隨著墊料深度增加，細(xì)菌種類減少；微生物發(fā)酵床相鄰深度墊料具有更多的共有細(xì)菌種類。

圖1 樣品韋恩圖Figure 1 Venn diagram denoting the unique and shared OTUs in the different samples

2.2.1 各發(fā)酵等級細(xì)菌門群落結(jié)構(gòu)分析

微生物發(fā)酵床墊料共檢測到32個(gè)細(xì)菌門（圖2）。在表層墊料中，占主要比例的細(xì)菌為擬桿菌門（25.3%）和變形菌門（25.9%）；擬桿菌含量低于深層墊料同月份采集樣本；放線菌門（10.2%）高于中層（7.6%）和深層墊料（5.4%）。在中層墊料中，含量高的細(xì)菌為擬桿菌門（27.8%）、變形菌門（25.1%）和厚壁菌門（17.0%）。在深層墊料中，主要的細(xì)菌門為擬桿菌門（33.3%）、變形菌門（13.0%）、厚壁菌門（15.2%）和糖桿菌門（14.7%），其中擬桿菌門含量高于表層和中層墊料。

圖2 微生物發(fā)酵床墊料在門水平的微生物組成Figure 2 Relative abundances of predominant bacterial compositions on phylum levels

2.2.2各發(fā)酵等級細(xì)菌科結(jié)構(gòu)分析

微生物發(fā)酵床不同深度樣本共獲得303個(gè)細(xì)菌科（圖3）。在表層墊料中，黃桿菌科含量最高（7.4%）。在中層墊料中，黃單胞桿菌科（9.9%）、糖桿菌科（8.4%）和黃桿菌科（6.3%）是含量較高的細(xì)菌科。在深層墊料中，糖桿菌科（14.7%）含量最高，其次為螺旋體科（9.0%）、紫單胞菌科（7.6%）和海洋滑動菌科（7.1%）。微生物發(fā)酵床深層墊料不同月份樣本具有相似的細(xì)菌群落構(gòu)成，而表層和中層墊料不同月份樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異很大。尤其是采集于10月份的微生物發(fā)酵床墊料，與相同深度不同月份的樣本具有明顯差異。10月份的表層和中層墊料中的主要細(xì)菌為糖桿菌門（17.7%）和變形菌門的黃單胞菌科（30.0%）；11月份的表層和中層墊料中則是擬桿菌門的Cryomorphaceae（7.9%）和綠彎菌門的厭氧蠅菌科（8.7%）含量最高；12月份的表層和中層墊料中糖桿菌門（10.3%）和擬桿菌門的紫單胞桿菌科（9.6%）含量較高。

2.3 墊料微生物與深度的關(guān)聯(lián)性分析

RDA結(jié)果顯示（圖4），深度對墊料微生物多樣性的影響大于月份對微生物群落的影響。厚壁菌門和綠彎菌門隨著墊料深度的增加而增加，放線菌門、擬桿菌門和棲熱菌門與墊料深度負(fù)相關(guān)。放線菌門在10月份的淺層墊料中含量最高，棲熱菌門在12月份的表層墊料中含量最高。厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和綠彎菌門與月份呈正相關(guān)，在11月份和12月份墊料中的含量高于10月份墊料。而放線菌門與月份呈負(fù)相關(guān)，在10月份墊料中含量最高。

綜合分析，深層墊料有穩(wěn)定的微生物群落，10、11月和12月采集的樣本中，其主要優(yōu)勢菌都為糖桿菌門、螺旋體門和擬桿菌門。淺層墊料微生物群落變化較大，微生物分布與月份相關(guān)，如DEC30cm和DEC10cm（擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門），NOV30 cm和NOV10cm（擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和綠彎菌門），OCT30cm和OCT10cm（擬桿菌門和變形菌門）有相似的微生物群落結(jié)構(gòu)。發(fā)酵床養(yǎng)殖過程中，生物活動干擾表層和中層的墊料，因而導(dǎo)致發(fā)酵床表層墊料微生物群落的動態(tài)變化。

圖3 微生物發(fā)酵床墊料在科水平的微生物組成Figure 3 Relative abundances of predominant bacterial compositions on family levels

圖4 墊料微生物與發(fā)酵床深度的RDA分析Figure 4 Redundancy analysis（RDA）of the relationship between bacteria and depth

2.4 微生物發(fā)酵床不同深度墊料物種差異分析

在門水平上，螺旋菌門在不同深度墊料間具有顯著差異性（圖5），該門在深層墊料（9.2%）中含量遠(yuǎn)高于中層（2.7%）和淺層墊料（0.9%）。擬桿菌門隨著墊料深度的增大而增多，在深層、中層和淺層墊料中的含量分別為33.3%、27.8%和25.3%。變形菌門則主要活躍在表層（25.9%）和中層墊料（25.1%）。放線菌門和異常球菌-棲熱菌門在表層墊料中的含量大于中層和深層墊料，其中放線菌門在表層、中層和深層墊料中的含量分別為10.2%、7.6%和54%，異常球菌-棲熱菌門在表層墊料中的含量為3.7%，是中層和深層墊料的1.8倍和3.0倍。隨著深度的增加，底層墊料中的溶氧量降低，為厭氧菌提供了生長環(huán)境，因此在深層墊料中厭氧菌含量高。

在科水平上，螺旋菌門的螺旋體科在深層墊料中的含量高于其他層墊料（圖6）。該菌是厭氧的腐生菌，可降解深層墊料中的有機(jī)質(zhì)。擬桿菌門的海洋滑動菌科和擬桿菌目在深層墊料中的含量也高于淺層墊料，分別是表層墊料的4.0倍和19.3倍。而特呂珀菌科主要分布于表層（3.7%）和中層墊料（1.4%）中，在深層墊料（1.2%）中含量低。擬桿菌門的霜狀菌在中層（3.7%）和表層（3.8%）墊料中含量高于深層墊料（0.5%）。

2.5 發(fā)酵床微生物代謝相關(guān)基因的等級差異分析

圖5 不同深度墊料細(xì)菌在門水平上差異顯著性分析Figure 5 Significance difference of bacteria in litters of different depth on the phylunm level

PICRUSt預(yù)測不同深度墊料中細(xì)菌的主要有機(jī)物降解途徑的基因數(shù)目見圖7。表層墊料細(xì)菌群落中與氨基酸、碳水化合物和脂類代謝相關(guān)的基因拷貝數(shù)最多，深層最少，表明表層墊料中的細(xì)菌代謝最為旺盛，而深層墊料細(xì)菌的代謝較為緩慢。結(jié)合前文高通量測序的結(jié)果，表層墊料中細(xì)菌數(shù)量最多，提供了更多的代謝相關(guān)基因，因此代謝旺盛。如表層墊料中與氮素降解相關(guān)的硝酸還原酶在表層、中層和深層墊料的拷貝數(shù)分別為2928、1848和909，表層墊料中的含量高于深層墊料。因此，發(fā)酵床表層墊料中的細(xì)菌群落在養(yǎng)殖廢棄物的降解中起主要作用。

圖6 不同深度墊料細(xì)菌在科水平上差異顯著性分析Figure 6 Significance difference of bacteria in litters of different depth on the family level

圖7 不同發(fā)酵程度墊料中細(xì)菌群落氨基酸、碳水化合物和脂類代謝相關(guān)基因的分布Figure 7 Functional prediction of bacterial community in amino acid,carbohydrate and lipid metabolism in litters of different fermentation grades

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門是微生物發(fā)酵床的主要細(xì)菌。深層墊料與淺層墊料有著不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。發(fā)酵床墊料表層和中層中的細(xì)菌主要為異常球菌-棲熱菌門的特呂珀菌科、變形菌門的黃單胞菌科和擬桿菌門的黃桿菌科細(xì)菌。特呂珀菌科細(xì)菌的最佳生長溫度為50℃，可以抵御堆肥的高溫，利用多種糖類、有機(jī)酸和氨基酸等有機(jī)質(zhì)[16-17]。黃單胞菌科細(xì)菌在蚯蚓堆肥系統(tǒng)中起降解作用[18-19]，還能夠降解碳水化合物，是木質(zhì)材料堆肥過程中的優(yōu)勢菌群[20-21]，可能參與降解微生物發(fā)酵床墊料中的椰糠、谷殼以及豬糞中的碳水化合物。黃桿菌科細(xì)菌能夠抵御抗生素脅迫，并能降解有機(jī)物，是堆肥中的常見菌[22]；黃桿菌能夠降解多糖，如纖維素、木聚糖、幾丁質(zhì)和葡聚糖[23-24]；黃桿菌屬的F.banpakuense可還原硝酸鹽，參與堆肥中的氮循環(huán)[25]。

深層墊料中厭氧菌含量高，如螺旋體門的螺旋體科、擬桿菌門的腐螺旋菌科，微生物發(fā)酵床深層墊料缺氧環(huán)境適合其生長。螺旋體門的螺旋體科、擬桿菌門的紫單胞桿菌科和腐螺旋菌科、糖桿菌門、厚壁菌門的梭菌目是深層墊料中的主要有機(jī)質(zhì)降解菌。紫單胞桿菌科在動物糞便降解中發(fā)揮作用[26-27]；腐螺旋菌科在污泥處理中起重要作用[28-29]。糖桿菌目的細(xì)菌分布于土壤、沉積物、廢水以及動物中，許多細(xì)菌能夠厭氧發(fā)酵，分泌多種酶，參與有機(jī)物降解[30-31]。

在12月份的表層和中層墊料中，硫假單胞菌和寡源桿菌屬含量較高，硫假單胞菌是厭氧菌，用硝酸鹽氧化硫化物和乙酸鹽，產(chǎn)生可利用的硫[32-33]。在11月份的表層和中層墊料中，厭氧蠅菌科含量較高，厭氧蠅菌科在降解碳水化合物的過程中有重要作用，Liang等[34]在長期發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)厭氧蠅菌科在長鏈正烷烴生物降解的初始活化中起關(guān)鍵作用。在10月份表層和中層樣本中，藤黃桿菌屬含量最高，此屬的某些細(xì)菌可分泌脂肪酶[35]；某些細(xì)菌可降解甲胺磷，參與環(huán)境修復(fù)[36]。這些細(xì)菌可能參與了發(fā)酵床豬糞的降解過程。

此外，本研究首次在陸地生境中發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌——霜狀菌，霜狀菌屬于黃桿菌目，分離自海水、藻類等海洋生境[37-38]。本實(shí)驗(yàn)場所是一座圍海造田后的農(nóng)場，地處海邊，推測霜狀菌經(jīng)由海水滲透和空氣傳播至豬場，這是首次在微生物發(fā)酵床中發(fā)現(xiàn)該類細(xì)菌，其功能及對發(fā)酵床的影響有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）本研究采用高通量測序技術(shù)，分析了3種不同深度墊料中的細(xì)菌群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表層墊料中微生物含量最高，表明發(fā)酵床表層是豬糞降解的主要功能層。

（2）發(fā)酵床表層和中層的優(yōu)勢菌為異常球菌-棲熱菌門的特呂珀菌科、變形菌門的黃單胞菌科和擬桿菌門的黃桿菌科細(xì)菌；深層墊料中含有豐富的厭氧細(xì)菌，包括螺旋體科、腐螺旋菌科，參與發(fā)酵床中有機(jī)質(zhì)的降解。

（3）微生物發(fā)酵床細(xì)菌資源豐富，蘊(yùn)藏著許多木質(zhì)素、多糖、蛋白質(zhì)降解菌及未知功能的細(xì)菌，本研究為發(fā)酵床有機(jī)物降解及其微生物資源的利用提供了基礎(chǔ)。